O slideshow foi denunciado.
Utilizamos seu perfil e dados de atividades no LinkedIn para personalizar e exibir anúncios mais relevantes. Altere suas preferências de anúncios quando desejar.

Entseiu mikrobiologikoa

1.827 visualizações

Publicada em

Mikroorganismoei buruzko edukiak

Publicada em: Educação
  • Entre para ver os comentários

  • Seja a primeira pessoa a gostar disto

Entseiu mikrobiologikoa

  1. 1. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAPROGRAMAZIOA1. MIKROBIOLOGIA  Mikrobiologiaren kontzeptua eta historia  Izaki bizidunen sailkapena  Zelulak: motak eta egitura  Célula prokariotoa  Birusak eta beste izaki ez-zelularrak  Monera Erreinua  Protista Erreinua2. METABOLISMO MIKROBIANOA  Mikroorganismoen metabolismoa: mantenu erreakzioak  Biosintesia, polimerizazioa eta muntaketa  Mkroorganismoen hazkuntza3. MIKROBIOLOGIA APLIKATUA  Mikroorganismoen baliagarritasuna  Populazio mikrobianoa  Mikroorganismoen controla  Familia esanguratsuenak4. PRAKTIKAK  Zelulen behaketa  Hazkuntza-inguruen prestaketa  Laborategiko giroko mikroorganismoak  Hazkuntza puruak lortzeko teknikak  Mikroorganismo bizigarriak berreskuratzea  Hazkuntza-inguru hautagarriak eta bereizgarriak prestaketa  Bakterio-tindaketak  Ezezagun morfologiko baten tindaketen bitarteko ezagutzea  Mikroorganimoen zenbaketa  Ingurumen baldintzen eragina bakterioen hazkundean  Onddoen (lizunak eta legamiak) kultiboa  Urokultiboa  KoprokultiboaEntseiu mikrobiologikoak 1
  2. 2. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA  Esne gordinaren azterketa mikrobiologikoa  Uraren analisi mikrobiologikoa  Elikagaien analisi mikrobiologikoa  AntibiogramakEntseiu mikrobiologikoak 2
  3. 3. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA1. Unitatea: MIKROBIOLOGIAREN KONTZEPTU ETA HISTORIAA. Definizioa: Mikrobiologia mikroorganismoak aztertzen dituen zientzia da. Beraz,Biologiaren atala da. Zer dira mikroorganismoak? Zentzu orokorrean, begiz ikustezinak direnbizidunak. Objetu bat 0,1 mm bat baino txikiagoa bada, begiak ezin du kusi, eta 1 mmizanda ere detaile gutxi igarri daiteke. Beraz, 1 mm edo gutxiago duten bizidunakmikroorganismoak dira eta mikrobiologiaren eremuan sartzen dira. Mikroorganismoak: animalia batzuk, protista, monera, alga asko, bakterioak etabirusak dira. Ondorio bezala, mikroskopioa behar beharrezkoa da bizidun hauek aztertzeko,beraz mikrobiologiak ezinbestekoa du mikroskopia.B. Mikrobiologiaren garapena.1632-1723: Antony van Leeuwenhoek. (1. deskribapena) Testua 11664: Robert Hooke (zelula hitza 1. aldiz erabili)1665: Francesco Redi, zizareak okelan. Testua 2XVIII mendea: Lazzaro Spallanzani, infusioak, berotu eta itxiXIX mendea: François Appert, elikagaiak kontserbatu. XIX mendearenerdialdean, zientifiko batzuk konturatzen hasiak zieren erlazio kausala dagoelamikroorganismoen garapena infusioetan eta infusio hauek jasastzen dituzten aldaketak;hau da, mikroorganismoek aldaketa kimikoak sortzen dituzte infusioetan.1861: Louis Pasteur (1822-1895), mikroorganismoak airean zeudela frogatuzuen. Irudia 31870: John Tyndall, bakterioen faseak: tyndalizazioa.1876: Robert Koch (1843-1910), mikroorganismo batek gaixotasun bat(tuberkulosia).1880: Ferdinand Cohn, endosporak.Entseiu mikrobiologikoak 3
  4. 4. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA1884: H.C. Gram-ek tindaketa teknika bat asmatu zuen. Gaur egun ere oraindikerabiltzen dena. Teknika horri esker bakterioak bi taldetan sailkatzen dira: Gram + eta Gram –1920-1935: Bizidun guztion prozesu metabolikoak antzekoak dira, hau da“biokimikaren batasuna”1934: Mikroskopio elektronikoaren sorrerak mikroorganismoen barneegituraren ezagupenean bultzada handia eman zuen. Ordurarte mikrobiologia apartekozientzia bezala hartzen bazen ere, aldi honetan gainontzeko zientzien garapeneanlagungarri bihurtu zen. Genetikan adibidez, ekarpen handiak eman ziren:1944: Avery, McLeod eta McCarthy-k eraldaketa bakterianoa DNA-k eragitenduela frogatu zuten1953: Watson eta Crick, DNA-ren egitura eta molekula horren bikoizketa etafuntzionamendua.C. Mikroorganismoak eta prozesu kimikoakInfusioetan gertatzen diren prozesu kimikoak bi motatakoak dira nagusiki:  Ustelketa: Eraldaketa hauetan usain txarra duten gaiak sortzen dira, eta okela gertatzen da proteinak deskonposatzerakoan  Hartzidura: Prozesu honetan alkoholak edota azido organikoak sortzen dira gluzidoak –landare eta fruituen osagai nagusiak- deskonposatzerakoan.1837an hondakin hauek ikertu ziren eta bertan zelula biziak zeudela konturatu zirenbiologoak. Kimikariek, berriz elementu inorganikoak zirela pentsatzen zuten- Pasteurekfrogatu zuen hondakin hauek bizirik zirela, legamiak, hain zuzen.1857-1876an Pasteurek hartzidura laktikoa eta alkoholikoa bereizi eta aztertu zituen.Hartzidura mota bakoitzak gai kimiko eta mikroorganismo bereziak zituela ikusi zituen:  Mikroorganismo batzuk aerobioak (oxigenoaren beharra) zirela eta beste batzuk anaerobioak.  Hartzidura arnasketa baino efizientzia energetiko txikiagoa zuelaIngurumenaren mikrobiologiaren gurasoak ondoko bi hauek ditugu: S. Winograsky (1856-1953) eta M. Beijerinch (1851-1931)Entseiu mikrobiologikoak 4
  5. 5. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAMtaeria organikoa zoruan eraldaketak sortzen zituela behatu zuten eta egoera etabaldintza desberdinetara egokitzen zirela konturatu ziren. Adibidez, materia organikoadeskonposatzen zen lekuetan NO3-ak agertzen zirela konturatu ziren. Orduan, hondakinurak NO3-tan aberatsak zirela ikusi zuten. Suposatu zuten mikroorganismoek NH4 NO3-ra eraldatzen zutela. Hortik aurrera beste zenbait eraldaketa ikusi ziren, guztietan ziklobiokimikoak parte hartzen dutelarik. S2- --------------------- S Fe2+ --------------------> Fe3+ H2 -------------------- H- N2 ------------------- NH4Ziklo biokimikoak.D. Mikroorganismoak eta gaixotasunak1793: Hunter-ek bi gizakiren arteko gaixotasun (gonorrea) kutsakorrarentransmisioa frogatu zuen.1840: J.L. Schönlein-ek frogatu zuen gizakion larruaren zenbait gaixotasunonddo batzuk sortzen zituztela Semmelweis-ek “fiebre perperal” izeneko gaixotasuna ospitalekolangileek transmititzen zietela ameei frogatu zuen. Henle-k mikroorganismo konkretu bat eta gaixotasun konkretu batenarteko erlazioa frogatzeko beharrezkoa zela mikroorganismoa isolatzea frogatu zuen.1864: Lister-ek kirurgia antiseptikoa aurrera eramateko prozedurak prestatuzituen eta hasiera batean harrera oso ona ez bazuten izan ere, denboraz emaitzek lortuzituen euren onarpena. Euskarri teorikorik gabe bazen ere, prozedura hauek nahikofroga ez-zuzenak eman zizkioten “zenbait gaixotasun mikroorganismoek sortzen zutela”zioen teoriari.1876: Robert Koch-ek karbunkoa bakterio batzuk sortzen zutela frogatu zuen.Erakutsi zuen osasuntsu ziren arratoiak kutsatzen zirela gaixorik zeudenen odola hartuzgero. Ondoren, bakterioak hazi zituen, eta hazkundea behatzen orduz ordu, ikusi zuenbaziloak zuntz luze bihurtzen zirela. Euren barruan gorputz obalatu eta errefringenteakagertzen ziren eta hauek beste inguru batetara pasatuz gero zuntzak berriro agertzenzirela.Entseiu mikrobiologikoak 5
  6. 6. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Koch-ek egindako esperientziak bat zetozen Henl-k proposaturiko irizpideekin,erlazioa lortzeko mikroorganismo eta gaixotasunaren artean. Irizpideak hauek dira(Koch-en postulatuak):  Mikroorganismoak gaixorik dauden indibiduoengan agertu behar du beti eta ez ondo dauden indibiduoengan.  Mikroorganismoa gaixoarengandik lortu eta isolatu behar da hazkuntza puruan.  Gaixotasuna agertu behar da garbia den hazkuntza batetik lortutako mikroorganismoa sartzen denean ostalari gaitzikor eta osasuntsu batean.  Mikrrorganismoa berriro isolatu behar da esperimentuen bitartez kutsaturiko gaixoarengandikKoch lehena izan zenez irizpide hauek praktketan jartzen gaur egun Koch-enpostulatuak deitzen ditugu. Irudia 4 Urte batzuk pasatuta Pasteur eta Joubert karbunko aztertzari ekin zioten, Kochenlanen berri izan gabe, eta antzeko emaitzak lortu zituzten. Ezer berri ez bazuten gehituere, Kochen lanak baieztatu zituzten eta zenbait froga gehitu zituzten erakusteko bazilohori eta ez besterik karbunkoaren kausa zela. Hurrengo urteetan, Pariseko eta Berlingo institutuak munduko antzindariakbihurtu ziren. Alemaniako eskolak, Kochen zuzendaritzapean, gizakiaren gaixotasunkutsakor garrantzitsuen eragileen isolaketa, kultibo eta ezagupena aztertzeko erabil zuendenbora eta bitartekoak. Frantsesek, beriz, Pasteuren zuzendaritzapean, arazo latzagoariheldu zion: nola gertzen da gaixotasuna animaliaren gorputzean eta nola izaten daosaketa eta nola lortzen du inmunitatea. 25 urtetan, gizakion gaixotasun garrantzitsuen eragileak aurkitu eta ezagutuzituzten eta, beste aldetik, gaixotasunei aurre egiteko metodoak garatu ere.1892: D. Iwanowsky-k, bakterio baino xikiagoak ziren eragile infekziosoakaurkitu zituen, birusak. Ez zekien zer ziren, baina argi zegoen bizidun talde bereziaosatzen zutela, guztiz desberdina bai egitura bai garatzeko era ordurarte ezagutzenzituzten izaki zelularrakEntseiu mikrobiologikoak 6
  7. 7. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Irakurgaiak eta irudiak 1. IrakurgaiaEntseiu mikrobiologikoak 7
  8. 8. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA 2. IrakurgaiaEntseiu mikrobiologikoak 8
  9. 9. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAIrudia 3Entseiu mikrobiologikoak 9
  10. 10. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA4. IrakurgaiaEntseiu mikrobiologikoak 10
  11. 11. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 11
  12. 12. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 12
  13. 13. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAmente la madre la que cuenta como primer autor. También, todo lo que alcanza a la mujer -infec-ci6n, intoxicación, desórdenes nerviosos- tiene el riesgo de que se continúe a través de la descendencia, mucho másque en el caso del hombre. De lo que le resultan a la mujer responsabilidades y deberes par- ticulares hacia sí misma,hacia su propia integridad.En cambio, y por la misma razón, la sociedad tendrá hacia la mujer deberes de protección, de sal- vaguardia yvigilancia.Si es verdad -como decfa Ju1liot de La Moran- diere- que la evolución del papel jurídico de la mujer encuentra talvez una explicación en el progreso de la biología, está permitido esperar que esta evolución no haya llegado a sutérmino. Sin ir hasta reivindicar para la mujer una primacía que respondería a su prevalencia biológica, estimamosque una igualdad en todos los campos es lo menos que se le debe.La verdad biológica ya ha servido a la causa del sexo femenino; debe servirle todavía.Entseiu mikrobiologikoak 13
  14. 14. 2. Unitatea: IZAKI BIZIDUNEN SAILKAPENAA. Sarrera Izaki bizidun guztiek hiru ezaugarri komun dituzte:  Konposizio berdina  Metabolismo desberdinan izan arren, helburuak berdinak dituzte: i. Materia konplexuak (makromolekulak) sintetizatzea (proteinak, DNA,...) ii. Energia lortzea  Oinarrizko egitura finkoa: organismo guztiak zelulez osatuta daude Hiru ezaugarri hauen salbuespena birusak dira, zelularik ez dituztelako. Bestalde, izaki bizidunak hiru taldetan bana daitezke: izaki zelulabakarrak, zelulanitzak eta egitura zenozitikoakB. Antolaketa maila  Izaki zelulabakarra: Izaki mikroskopikoak, bakterio gehienak, zenbait alga eta onddo  Izaki zelulanitzak: o Bereizketa gabekoa:  Zelula gutxi dituzte  Zelula guztiak berdinak dira  Koloniak osatzen dituzte  Onddo eta alga batzuk o Berezitakoak:  Zelula askoz osaturik  Zelula desberdinak  Zelulak taldeka elkartuta, ehunak osatzen dituzte eta hauek organoak eta hauek aparatuak  Egitura zenozitikoa: Organismoa ez dago zelulaz osaturik. Mugarik gabeko masa da. Zelula baten erdibiketatik sortzen da. Erdibiketa nuklearra egoten da, baina ez da ehunik sortzen. Talde garrantzitsuenak mixomizetoak (onddo batzuk) dira.C. Izaki bizidunen sailkapenerako irizpideak Aristotelen denboretan izaki bizidunak bi erreinutan banatzen ziren: Animalia eta landare erreinuak. Bi erreinuak elkarren artean oso desberdinak ziren, batzuk energia lortzeko materia organikoa eta besteek materia inorganikoa erabiltzen zuten; batzuen mugimendua eta besteen mugimendu eza; klorofila izatea ala ez; karbono iturri desberdina izatea,... XVIII-XIX. mende haseran animalikuluen (mikroorganismoak) aurkikuntzarekin batera beste sailkapen bat egitera bultzatu zuten. Mikroorganismo asko animalia (protozoo) eta landare erreinutan sartu zituzten.
  15. 15. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Baina mikroorganismo gehiago ezagutzearekin batera beste sailkapen batzuk egin zituzten:  Flagelatu fotosintetikoak o Fotosintesia o Mugimendua  Onddo mukiduna o Onddoak o Mugimendua Taula 1 Esfuerzo final (hacia 1860) para asignar los microorgasnismos a los reinos vegetal o animal Vegetales Grupos discutidos Animales Pequeños metazoos  Roíferos  Nematodos (algunos)  Artrópodos (algunos) Algas (fotosintéticas) Protozoos Formas inmóviles Flagelados fotosintéticos Flagelados no fotosin. Hongos (no fotosintéticos) Hongos mucosos Protozoos ameboides Bacterias 1866an Haeckel-ek hiru erreinutako sailkapena proposatu zuen, hirugarren erreinuan protista izeneko mikroorganismoak sartzen zituelarik. Bereiztu gabeko zelulaz osatutako mikroorganismo zelulanitz eta zelula bakarrak sartu zituen. Taula 2 Grupos que componen los tres reinos de organismos propuestos por Haeckel (1866) Propiedades Vegetales Animales Multicelulares; diferenciación profunda Plantas con semillas Vertebrados de las células y tejidos Helechos Invertebrados Musgos y hepáticas Protistas Unicelulares, cenocíticos, o Algas, Protozoos, Hongos y bacterias multicelulares; estos últimos con poca o ninguna diferenciación de células y tejidosD. Izaki bizdunen taldeen ezaugarriak  Monera erreinua. Organismo prokariotoak dira soilik, beraz, antolaketa zelular prokariotoa duten zelulabakarrak dira denak. Nutrizio mota guztiakEntseiu mikrobiologikoak 15
  16. 16. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA dituzte, asexualki ugaltzen dira, nahiz eta, material genetikoaren truke soilak bezalako sexualitate-modu oso primitibo batzuk agertu. Bakterioak, zianofizeoak eta mikoplasmak sartzen dira bertan.  Protista erreinua. Organismo zelulabakar eukariotoak dira eta ehun antolaketarik ez duten izaki kolonialez osatuta dago; landareetatik eta animalietatik bereizten dira garapenik ez dutelako, ezta ehunik ere, eta onddoetatik, berriz, beren bizitzako etaparen batean zilioak eta flageloak dituztelako. Erreinu honetan protozooak, beste organismo urtar, eta nahiko ezezagunak diren parasito batzuk eta algak sartzen dira.  Onddoen erreinua (Fungi). Organismo eukariotoak dira, esporaz ugaltzen dira, ez dute garapen enbrionariorik, beren bizi-zikloaren etapa guztietan ez dute ziliorik ezta flagelorik ere eta denek nutrizio heterotrofoa dute. Legamiak bezalako onddo zelulabakarrak eta lizuna eta perretxikoak bezalako onddo zelulanitzak biltzen ditu, baita likenak ere.  Animalia erreinua (Metazooak). Organismo zelulanitz eukariotikoak dira, nutrizio heterotrofoa dute, ugalketa sexuala eta ondoren garapen enbrionarioa; garapen horretan zehar blastula izeneko egoera bat izaten da beti. Erreinu honetan eskuarki animali zelulanitz bezala kontsideratuak izan diren organismoak sartzen dira.  Plantae erreinua (Metafitoak). Organismo zelulanitz eukariotoak dira, nutrizio autotrofo fotosintetikoa dute, ugalketa sexuala eta garapen enbrionario bakuna (ez da blastula egoerara iristen). Belaunaldi alternantzia izan ohi da bi ugalketa-motekin. Goroldioak, iratzeak, gimnospermoak (haziak agerian) eta angiospermoak (haziak estalita – loreak) biltzen ditu.3. Unitatea: ZELULAK: MOTAK ETA EGITURAKEntseiu mikrobiologikoak 16
  17. 17. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA1. Sarrera Izaki bizdunok osatzen gaituen egiturarik txikiena zein den jakiteak jakinmina eragin du historian zehar. Antzinako Grezian hasi ziren arazoei erantzuna emateko teoriak pentsatzen. XVII. Mendera arte oso gutxi aurreratu zuten, proposatutako hipotesiak frogatzeko baliabiderik ez zutelako. 1950. urtean Zacahry eta Francis Janseen-ek lehen mikroskopio konposatua asmatu zuten, tutu batean bi lente ganbil jarrita. Handik urte batzuetara, Robert Hooke-k (1635-1703) mikroskopio konposatua erabiliz, kortxozko xafla mehe batzuk behatu zituen 1665. urtean, eta ikusitakoa deskribatzerakoan hitz ezin egokiagoak erabili zituen: “...argi eta garbi ikusi ahal izan dut xafla zulatuta dagoela erabat, poroz beteta dagoela, abaraska baten antzera. Poro edo zelula horiek ez dira batere sakonak, baina ugariak bai, oso ugariak dira...” Hooke izan zen egitura biologiko bat deskribatzeko zelula hitza erabili zuen lehena. Garai hartan, mikroskopiogileak ziren objetu txikiak behatzen ibiltzen zirenak. Antony van Leeuwenhoek-ek (1632-1723) adibidez, mikroskopi bakun eta garatu gabeak, baina bereizmen handikoak erabiliz, makina bat mikroorganismo aurkitu zituen: infusorioak, algak, onddoak, bakterioak, etab. Malpighi-k (1628-1694) ere hamaika behaketa desberdin egin zituen, kapilarrak, intsektuak, landareak, etab. Brisseau de Mirbel eta Jean Baptiste de Lamarck-ek 1809. urtean eta Henri Dutrochet-ek 1837an, izaki bizidunok zelulaz eratuta geundela esan zuten, eta zelula horiek bizi-funtzio independienteak zituztela. Urte haietan, 1831 inguruan, Robert Brown-ek egindako ikeerketen ondorioz, beste ororkortze nagusi batera iritsi ziren, zelulen barruan nukleoa dagoela aurkitu baitzuten. Teoria zelularra finkatzeko bidea, beraz, eginda zegoen, berandu baino lehen etorriko zena bi biologi alemanen –Matthias Jakob Schleiden (1804-1881) eta Theodor Schwann (1810-1882) biologoen – lanaren ondorioz. Schleidenek landareen zelularen jatorriari buruzko lana argitaratu zuen 1838. urtean eta nukleoak zelularen garapenaren duen zereginari buruzko hipotesia plazaratu zuen. Schawnn bere aldetik, animaliak aztertu zituen. Berak egindako behaketak eta Schleindenek egin zizkion oharrak kontuan hartuta “izaki bizidun guztien oinarrizko zatiak zelulaz osatuta daude” esan zuen 1839. urtean. Schleinden eta Schwannek emandako oinarrizko ideia hori da, hain zuzen, teoria zelularra gauzatu zuena:Entseiu mikrobiologikoak 17
  18. 18. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA “Animaliak nahiz landareak, independienteki, baina aldi berean batera funtzinatzen duten zelulez eratuta daude”. Zelularen jatorriari buruzko teoria zuzenak agertzeko mikroskopioak hobetu eta tindaketa-metodoetan aurreratu ahala, zatiketa zelulararen nondik norakoaren berri izaten hasi ziren. R. Virchow 1855. urtean “omnis cellula ex cellula” esan zuen. Gaur egun egia unibertsaltzat dugun teoria zelularrak denbora luzea behar izan zuen zientifikoen artean onartua izateko. Walter Flemming-ek zelularen zatiketa-prozesuak ikusi zituen 1879. urtean. Kromosomen kopurua beti berdina dela aurreratu zuen eta zelularen zatiketaz hitz egiteko mitosi hitza erabiltzen hasi zen. Handik urte gutxi batzuetara animali eta landare-zelulen meiosia beste batzuek deskribatu zuten. 1880-1900 urtealdian mikroskopio optikoz ikus zitezkeen organulurik gehienak ikusi zituzten; izan ere, orduantxe hasi baitziren teknikak berriak erabiltzen: tindaketa, ebakidurak, etab. Garai horretan ere, Ramon y Cajal-ek neuronari buruzko teoria plazaratu zuen eta ondorioz, teoria zelularra ehun guztietara zabaldu zen. XX. mendeanren haseran zelularen funtzionamendu ikertzeari ekin zioten. 1930- 1940. hamarkadatik aurrera aurrerapauso handia egin zuten zelularen ezagutzan, tresna berri baten erabilerari esker: mikroskopio elektronikoa. Egitura zelularra ezezik ultraegitura ere ikus zitekeen, hau da, organulu zelularren xehetasun guztiak. Mendearen erdialdean zelularen azterketa biokimikoek eurenganatu zituzten eta gaur egun prozesu zelular guztiak ezagutzen ditugu. Egitura zelularrari buruzko ezagutzaren kronologia Aurrerapen teknikoa Urtea Ideien aurrerapenaEntseiu mikrobiologikoak 18
  19. 19. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Mikroskopio konposatua 1590 1665 Hook-ek zelula deskribatu 1670 Espermatozoideak deskribatzeko animalkulu hitza erabili Malpighi eta Leeuwwenhoek-en 1680 lanak Mikroskopio bidezko behaketa 1750 Zuntz-teoria Nukleoa ikustea 1760 Dolland-ek lente akromatikoak 1780 Besikula-teoria asmatu 1827 Teoria zelularraren aitzindari izango diren lehen ideiak Lehen mikroskopio konposatu 1833 Brown-ek nukleoa deskribatu akromatikoa 1838 1839 Schawnn eta Schleiden-ek teoriazelularra formulatu 1840 Purkinje-k proptoplasma terminoa erabiltzen hasi Abbe-k mikroskopioari zenbait 1855 Virchow-ek zelula oro beste zelula hobekuntza batetik datorrela esan 1879 Flemming-ek mitosia deskribatu Teknika mikroskopikoen 1880 Plastoak, mitokondriak eta Golgi- aurrerakada handia ren aparatua deskribatu Zeiss-ek lente berriak asmatu 1900 Sutton-ek gen-kromosoma Lehen mikroskopio elektronikoa 1931 harremana ezarri Fase-kontaste bidezko 1933 Organulu berriak deskribatu mikroskopioa Organulu desberdinen funtzioa Teknika berrien garapena: 1955 zentrifugazioa, zitokimika,... “Microscopio electrónico de 1965 Mintz plasmatikoaren eredua barrido” Kriohausturako mikroskopio 1979 elektronikoa Teknika berriak..... 1980 Organuluen ultraegitura 1990Entseiu mikrobiologikoak 19
  20. 20. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAZELULA EUKARIOTA:a.- Organuloak:Eukariotak diren zeluletan DNA mintzez inguraturik dago, nukleoa eratuz. Zitoplasmaorganulo zelular desberdinetan oso aberatsa eta ugaria da. Era honetako antolaketaondorengo erreinuetan agertzen zaigu: Protista, Fungi, Landare eta Animalia. Argazkiak konparatu Ondorengo irudiak kontutan hartuz erantzun itzazu ondoko galderak: A B 1.- Zein da handiena? 2.- Zein da konplexuena? 3.- Zeinek dauka nukleoa? 4.- Zein da zelulabakarra? 5.- Zer organismo izan daiteke A argazkikoa?  Bakterioa  Beste izakiren bat 6.- Zer organismo izan daiteke B argazkikoa?  Bakterioa  Beste organismoren batZelula eukariotak bizi forma eta mota (landare eta animalia) guztietan komunak direnorganuloak dituzte:Entseiu mikrobiologikoak 20
  21. 21. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Animalia eta Landare zeluletan agertzen diren organuloakOrganuloa Irudia Funtzioa Proteina eta fosfolipidoz osaturiko geruza da. Kanpo etaMintz Plasmatikoa barne inguruak bereizten ditu eta elkartrukeak kontrolatu egiten ditu. Zelularen barne medioa da. Bertan, metabolismoZitoplasma zelularra eta molekulen mugimendua burutzen da. Mintzez inguraturiko zonaldea nukleoplasma eta DNAzNukleoa osaturik nagusiki.DNA Kondentsatutako DNA zuntzak dira. Informazio(Kromosoma) genetikoa biltzen dute. Arnasketa zelularra egiten dute. Materia organikoaMitokondria ATPan bilakatzen dute (energia) Entseiu mikrobiologikoak 21
  22. 22. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAErribosoma Proteinak sintetizatzen dituzte (itzulpena). Erribosometan sortutako proteinak garraiatu eta bilduErretikulu egiten dute. Baita ere, lipidoak sintetizatzen ditu, eta,endoplasmatikoa mintz nuklearra eratzen dute. Erretikulu endoplasmatikotik jasotako proteinak bildu etaGolgi aparatua sailkatu egiten ditu. Pareta zelularra eratzen du. Lisosomak sortzen ditu. Golgi eta Erretikuloan jatorria duten eta sustantziaBesikulak biltzen dituzten esfera txikiak dira Digeri entzimak biltzen dituzten mintzez inguraturikoLisosomak esfera txikiak. Eurei esker elikagaiak digeritu egiten dira. Landare zelulari babesa, euskarria eta egituraPareta Zelularra mantentzen laguntzen dio. Zelulosaz osaturiko mintzez egina dago. Fotosintesia egiten duen organuloa: materia inorganikoaKloroplastoa materia organikoan bilakatzen da. Entseiu mikrobiologikoak 22
  23. 23. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Zilioa eta flageloak eratzen dituzten mikrotubuloZentrioloak zilindrikoen multzoa. Animali zeluletan zatiketa zelularrean parte hartzen du.Amiloplastoak Fotosintesia sortutako almidoia biltzen duen organuloa.Zilioak eta Mugimendu zelularra eragiten duten organuloak dira.FlageloakBakuolak Erreserba sustantziak edo hondakinak biltzen ditu.Forma Animalietan aldakorra eta landareetan prismatikoa. b.- Animali eta landare zelula: Entseiu mikrobiologikoak 23
  24. 24. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAAurrekoaren laburpen gisa zera esan dezakegu: Landare zelulak erregularragoa etaprismatikoagoa den forma erakusten duela, animali zelulak oso aldakorrak diren formakagertzen duten neurrian. Organuloak ere desberdinak dira: landareak kloroplastoak, paretazelularra, amiloplastoak eta zitoplasmaren bolumenaren gehiena okupatzen duen bakuolahandi bat dute. Animali zelulak aurreko organulorik ez du eta bai ordea zentrioloak etalisosomak. PRAKTIKETAKO PROGRAMAEntseiu mikrobiologikoak 24
  25. 25. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Segurtasun neurriak mikrobiologiako laborategian araudia PRAKTIKAK  Kultibo-medioen prestaketa  Mikroorganismoen ereinketa eta kultiboa  Mikroorganismoak ingurugiroan  Mikroorganismoen isolaketa eta identifikazioa lagin batetatik  Mikroorganismoen behaketa MIKROBIOLOGIA LABORATEGIAN JARRAITU BEHARREZKO ARAU OROKORRAKEntseiu mikrobiologikoak 25
  26. 26. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA1. Liburu, poltsa eta arropa guztia lan-eremutik at egon behar dute. Lan-eremuan, lanerakobeharrezkoak diren gauzak soilik egon daitezke (koadernoak, protokoloak, lanerakotresnak), eta ahal bezain garbi, ordenatu eta huts mantenu behar da lan-eremua.2. Bata eraman beharra dago, era hortan gu eta gure arropak babestuko baititugu (baikontaminazioa eta bai koloratzaile eta substantzia kimikoen ekintza). Ez irten laborategitiklaborategiko batarekin (kafea hartzera, hitzegitera, klasera...).3. Laborategian jatea (txiklea mastekatzea barne), edatea edo erretzea debekatuta dago.Ekiditu eskuak zein beste edozein objektu ahoratzea. Ez haginka egin boligrafoari. Ez ikutuaurpegia, begiak etabar.4. Ezer egin baino lehen, protokoloa irakurri. Zer egin behar den eta nola egin behar denaurrez jakiteak istripuak gutxitzen ditu eta denbora hobeto erabiltzea baimentzen du.5. Praktika egun bakoitzaren hasieran azalpen labur bat emango da. Ez hasi laneanazalpenak eta protokoloa irakurri baino lehen. Metodoa edo esperimentuaren helburuaulertzen ez duzunean, galdetu irakasleari.6. Praktika hazterakoan desinfektatu lan-eremua desinfetatzailearekin (desinfektatzaileapaperezko toaila batekin zabaldu mahai gainean eta lehortzen utzi). Prozedura beraerrepikatu lana amaitutakoan. Praktika amaitzean mahaia txukundu.7. Erabilitako gauza guztiak izen, talde, data eta experimentuarekin errotulatu, era hortanmaterilaren erabilera ez-zuzena ekidituko baitugu.8. Lanean zehar, kontaminazioak erraz ditzaketen aire korrenteak ekiditu . Saio-hodiesterilak edo kultibodunak gradilatan bertikalki mantendu behar dira. Sekula ez mahaigainean etzanda.9. Praktiketan egindakoaren ohar guztiak laborategiko koadernoan idatzi.10.Kontuz metxeroekin , batez ere metxeroaren bestaldean dagoen zerbait hartu nahi Entseiu mikrobiologikoak 26
  27. 27. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAdenean. Istripuak ekiditzeko, itzali metxeroak beharez direnean.11.Kontaminatutako materiale guztia eta erabiliko ez diren kultibo guztiak garbitu edobota baino lehen, esterilizatu beharra dago. Esterilizatu beharreko materialea ontzi egokietanutzi. Pipetak, portak eta kubreak mahaietan dauden lixibiadun untxietara botako dira.12.Paperak, poxpoloak eta beste material ez kutsagarriak sakar-ontzira botako dira. Inoiz ereez, harraskara.13.Laborategitik atera baino lehen, bai aldi batez edo behin-betiko, eskuak xaboigermizidaz garbitu behar dira.14. Edozein istripu edo arazoren aurrean (ebaketak, erredurak, kultiboen isurketak...),irakasleari jakinarazi berehala dagokion neurriak har daitezen. KULTIBO MEDIOEN PRESTAKETA Kultibo-medioak: laborategian mikroorganismoak hazteko erabili daiteken edozein sustantzia (solido edo likidoa) da; Kultibo medioaren konposaketan sustratu natural bat (odol plasma edo esnea adibidez) edota gatz eta sustantzia kimikoen kontzentrazio ezagunak parte har dezakete. Jatorriaren arabera kultibo-medioak talde desberdinetan sailka daitezke: Konplexua: honen konposaketan liseritutako konposatuak, landare edo animali ehunen estraktuak, kaseina... auki daitezke. Mikroorganismoak hazteko beharrezko dituzten elementu guztiak egongo dira, nahiz eta konposaketa eta kontzentrazio zehatzak ez ezagutu. Definitua : kontzentrazio ezagunean aurkitzen diren sustantzia kimiko puruez osatutako kultibo medioa. Hazkuntzarako beharrezko diren konposatu guztiak egongo dira, hauek desberdinak izan daitezkeelarik mikroorganismoaren behar Entseiu mikrobiologikoak 27
  28. 28. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA nutrizional konkretuen arabera. Guztiek eskeintzen dute ura, energi iturria (adibidez karbohidratoak eta gatz ezorganikoak), konposatu nitrogenatuak eta hazkuntzarako beste faktore batzuk.Kultibo medioa solidoa bada, solidifikatzaile bezala agarra erabiltzen da (nahiz eta bestebatzuk ere erabil daitezken agarra ez denean egokia, adibidez, mikroorganismoak agarraerabiltzeko ahalmena duenean).Ezin formula daieteke mikroorganismo guztien hazkuntza baimen dezakeen kultibo-medioa. Hala ere, Mueller-Hinton agarra bezalako kultibo medio konplexuetan bakterioaskok hazteko gaitasuna dute eta horregatik sarritan erabiltzen dira.Mikroorganismoen isolaketa eta identifikaziorako kultibo-medio hautakorrak edotabereizgarriak erabiltzen dira.Medio hautakorren konposaketan parte hartzen duten konposaturen bat edo gehiagozenbait mikroorganismoren hazkuntza inhibitzeko ahalmena izango dute, eta ondorioz,mikroorganismo edo mikroorganismo-talde konkretuen hazkuntza soilik gertatuko da.Hauen artean ditugu: MacConkey agarra, Manitol agarra eta beste asko.Kultibo-medioetan hazi ondoren mikroorganismoen itxuraren arabera (kolonientamaina, kolorea, distira, ertzaren izaera...) espezie ezberdinak daudela antzemandezakegu. Hala ere, mikroorganismo askok kolonia desberdinezinak ematen dituzte.Kultibo-medio bereizgarrietan ordea, nahiz eta koloniaren itxura berdintzua izan,kolonien arteko bereizketa lortuko dugu. Medio bereizgarri hauetan, hazkuntzan zehar,erreakzioren batek koloniaren kolorea edo beste ezaugarriren bat aldaerazi dezakeerreakzio positiboa eta negatiboa duten koloniak bereiztuko ditugularik.Kultibo-medio solidoen prestaketaMedio deshidratu batetatik abiatuz prozedura orokora honako hau litzateke:  Medio deshidratatua pisatuEntseiu mikrobiologikoak 28
  29. 29. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA  Ur destilatua gehitu  Nahasketa irakin  Autoklabatu  Hontzietan banaduAgarra duen kultibo-medioa Petri kutxatiletan prestatu nahi badugu, proseduraaipaturikoa litzateke. Medioa saiodietan nahi dugunean, nahasketa irakin etaautoklabatu baino lehen saiodietan banaduko dugu.Agarra ez duten medioek normalki ez dute irekin beharrrik. Laborategiko balantza arrunta Irabiagailu magnetikoa duen plaka Kultibo-medioaren pH-a finkatzeko,Entseiu mikrobiologikoak 29
  30. 30. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA batzutan pHmetroa erabili beharko dugu. Kultibo medio solidoak prestatzeko medioa saiodiaren barruan dagoela esterilizatzen da autoklabean, eta ondoren erdi etzanda solidifikatu arte utziko dugu. Era hortan ereintza-azalera handiagoa izango da. MIKROORGANISMOEN EREINKETA ETA KULTIBOALaborategian mikroorganismo baten azterketarako, beharrezkoaizaten da gehienetan mikroorganismoa kopuru handitan lortzea, hauda, mikroorganismoaren hazkuntza kultibo-medioan lortzea. Behinkultibo-medio egokia aukeratu ondoren, mikroorganismoa bertanereingo dugu. Honetarako, inokulazioa egiten denean, teknikaaseptikoa erabili behar da, era hortan kutsadurak ekidingo direlarik.Erabili beharreko tresna guztiak aldez aurretik esterilizatu egin behardira eta prozesu osoa suaren ondoan egin behar da.Mikroorganismoen transferentzia ereintza-euskarri bati loturikoplatino edo kromo-nikelezko alanbre batekin egin daiteke. Alanbre Kutsadura ekiditzeko maiz fluxu laminarrekohonek diametro txikiko kiribila izango du muturrean. Ereinketa kanpaietan egiten da lana.ziztadaren bidez egiten bada, ordea, kiribilik ez da egongo etaereintz-euskarriaren alanbrea zuzena izango da. Entseiu mikrobiologikoak 30
  31. 31. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEreinketaEreinketa saiodietan edo Petri kutxatiletan egin daiteke. Saiodien kasuan kultibo-medio solido edolikidoa erabil daiteke. Solidoa deneko kasuan, lortu nahi dugun helburuaren arabera, ziztadaren bidezkoereinketa edo azalekoa erabiliko da. Azken kasu honetan agar inklinatua duten saiodiak erabiltzen dira. . Ereintza-euskarria suaren gainean ia bertikalki jarri behar da gori-gori jarri arte. Honela euskarriaren luzera osoa esterilizaturik geratuko da. Esterilitate baldintzak ez galtzeko beti suaren ondoan egin beharko dugu lan. Saiodi batean mikroorganismoen kultiboa izango dugu, hau ezkerreko eskuarekin hartu, eskubiko eskuko atzamar txikiarekin tapoia kendu eta suaren ondoan mantendu behar da. Saiodiaren ahoa suaren gainetik pasatu, esterilizatutako ereintza-euskarria saiodian sartu eta segundu batzuz, beirarekin kontaktuan dagoela, hozten utziko da. Behin hotzituta, inokuloa hartuko dugu, euskarria saioditik etara eta berriro ere saiodiaren ahoa sutatik Entseiu mikrobiologikoak 31
  32. 32. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA pasatu eta itxi egingo dugu. . Inokulatu nahi dugun saiodia hartu, ireki, ahoa sutatik pasatu eta zelulak dituen ereintza-euskarria saiodiaren hondoraino sartu behar da. Ondoren, euskarria ateratzen gaudenean zigi-zaga egingo dugu kultibo- medioaren azalean. Amaitzeko, hodiaren ahoa sutatik pasatu eta tapatu egingo dugu. Ereintza-euskarria ere sutatik pasatu behar da bertan dauden mikroorganismoak hiltzekoEreinketa Petri kutxatilan egitean pausu berdinak jarraitu behar dira. Kutxatilak suaren ondoan irekibeharko dira esterilitatea mantentzeko. Kultibo-medioa likidoa denean inokuloa (euskarrian daudenzelulak) medioan murgildu beharko da.Ereinketa egiteko beste modu batzuk:1. Ziztadaren bidezko ereinketa. Zenbait teknika diagnostikotan erabiltzen da. Eukarriaren alanbreazuzena izango da eta medioa ziztatzeko erabiliko da. Entseiu mikrobiologikoak 32
  33. 33. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Ereintza-euskarri arrunta eta ziztadaren teknikan erabiltzen dena; lehenak kiribil bat du puntan, eta bigarrenean alanbrea zuzena da2. Kutxatiletan ildoango ereinketa. Kultibo-medio likido zein solido batetatik abiatuz inokuloaeuskarrirekin hartu eta Petri kutxatilak zigi-ziga eginez inokulatuko ditugu. Ereinketa egiterakoan ereintza-euskarriarekin zigi-zaga mugimenduak egiteko euskarria ahal bezain horizontalen erabiliko dugu, era hortan agarraren apurketa gutxitu egingo baita.Ereinketa hontatik abiatuz murrizketa bidezko ereinketa egin daiteke. Kasu hontan asmoa koloniaisolatuak lortzea litzateke. Murrizketa bidezko ereinketa: 1. Inokuloa ildoango ereinketaren bidez kutxatilaren albo batetan erein (marra gorriak). Ondoren euskarria esterilizatu. 2. Euskarri esterilarekin ildoango teknikaren bidez marra urdinak egin. Asmoa marra gorrietako microorganismo batzuk (marra urdinekin ikustzen ditugunak) azalera handiago batetan sakabanatzea da. 3. Prozedura berdina jarraituz marra laranjak eta urdin argiak egin Entseiu mikrobiologikoak 33
  34. 34. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA (euskarria esterilizatu marra berriak egin baino lehen). 4. Kutxatila tenperatura egokian inkubatu hondoren hazkuntza gertatuko da eta kolonia isolatuak garatuko dira.3. Hedadura bidezko ereinketa. Kasu hontan mikroorganismoak likidoan suspendituta egongo dira etaPetri kutxatilen gainazal osoa inokulatuko dugu likido horrekin. Pipeta esterilak erabili behar dira, hauenbidez, mikroorganismoak dituen likidoaren bolumen jakina (0.1-0.2ml) hartu ahal izateko. Hartutakobolumena kutxatilako agarraren gainean kokatuko dugu. Inokulua beirazko euskarri batekin heda daiteke(Digradsky euskarriarekin). Beirazko euskarria esterilizatzeko alkoholarekin buzti eta euskarriasugarretik igaroko dugu alkohola erre dadin (esterilitatea ziurtatzeko hiru aldiz erreko dugu). Ereinketametodo honek lagineko mikroorganismo bizien kopurua ezagutzeko balio du (kolonia formatzaileenunitateak edo ufc).4. Sakonerako ereinketa. Laginaren bolumen jakin bat (mililitro bat adibidez) agarra duen eta bainasolidifikatu gabeko kultibo-medioarekin (demagun 15 mililitro) nahastuko dugu (agar duen kultibo-medioa autoklabean esterilizatu ondoren tenperatura hortan likido egoeran aurkituko dugu. Tenperaturajeistean agarra solidifikatu egingo da). Nahasketa irabiatu eta Petri kutxatila esteriletara botako dugu.Ondoren mahai gainean zortzi itsurako mugimenduak egingo ditugu apur batez (nahastu eta kutxatilaosoan heda dadin). Agarra solidifikatzean mikroorganismoak agarraren barruan hasi eta kolonienkontaketa egin ahal izango da.5. Suspentsioaren bidezko ereinketa, ingurune likido batetik beste ingurune likido batetara. Entseiu mikrobiologikoak 34
  35. 35. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAInkubazioaKultiboak, aztertzen ari garen mikroorganismoaren tenperatura optimoan inkubatu behar dira hazkuntzaegokia lortu ahal izateko. Petri kutxatilak inkubatzean alderantzizko posizioan jarri behar dira, horrelakondentsatziorik ez baita gertatuko goikaldean eta kondentsazioko tantak ez dira kultiboaren gaineaneroriko. Tenperaturaz aparte, mikroorganismoen oxigeno beharra kontutan hartu behar da.Mikroorganismoa anaerobio bada, esterila den parafinarekin estali daiteke. Berogailuak mikroorganismoen inkubazioa tenperatura egokian egiteko erabiliko dira. Berogailuaren barruan Petri kutxatilak agarra goialdean dutela inkubatuko dira. Entseiu mikrobiologikoak 35
  36. 36. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA MlKROORGANISMOAK INGURUGIROANLaborategia, beste edozein girotan bezala, mikroorganismo askorekin kolonizatutadago. Mikroorganismo hauek airean edo gainazaletan itsatsiak egon daitezke.Mikrobiologoek, kontutan hartu behar dute ingurugiroko kutsadura lanerako erabiltzendituzten materialak kutsatu ez daitezen. Lehenengo praktikan, gure lan postuan daudeningurugiroko baldintzak aztertuko ditugu.Materiala: 1. TSA edo CPA agar elikagarria duten Petri kutxatilak 2. Hisopo edo torundakProzedura:  Bi kutxatila erabiliko ditugu: o Bata mahaiaren gainean zabalik utxiko dugu 30 minutuz. Ondoren kutxatila itxi eta berogailuan inkubatuko dugu. Airean mikroorganismoak dauden detektatzeko erabiliko dugu proba hau. o Torunda bat mahaiaren gainazaletik igaroko dugu (100 cm2 inguru) eta bigarren kutxatila hedaduraz inokulatzeko erabiliko dugu (kontuz ibili agarraren hausketa ekiditzeko).  Kutxatilak 37° C-tan 18-24 orduz inkubatuko ditugu  Kutxatilak aztertu eta kolonien tamaina, itxura eta kolorea deskribatu. Lortutako kolonia kopurua UFC edo Kolonia Eratzaileen Unitateen Kopuru dela esango dugu.  Kolonia batzuren GRAM tindaketa egin morfologia aztertzeko.Entseiu mikrobiologikoak 36
  37. 37. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Torundarekin laginaren ereinketa egiten. MIKROORGANISMOEN ISOLAKETA ETA IDENTIFIKAZIOA LAGIN LIKIDO BATETATIK ABIATUZIngurugirotik hartutako lagin gehienek, mikroorganismoen populazio mixtoak dituzte.Lagin hoietan dauden mikroorganismoen ezaugarri espezifikoak aztertu baino lehen,beharrezkoa da, populazio mixto hoietan dauden espeziek kultibo puruan isolatzea. Behinmikroorganismoak isolatuta daudenean, zenbait proba biokimikoren bidez identifikatukoditugu.ISOLAKETAIsolaketarako beharko dugun materialeahonako hau da: MacConkey eta Manitol agarra kultibo-medio hautakorrak dituzten plakak. Agar nutritibo ez selektiboaEntseiu mikrobiologikoak 37
  38. 38. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA (TSA edo CPA) dituzten Lanpostuan aurkituko ditugu behar ditugun materialeak plakak. Kultibo mixtoa duen lagin problema.Entseiu mikrobiologikoak 38
  39. 39. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 39
  40. 40. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAJarraitu beharreko metodoa:Mikroorganismoen suspentzio bat izango dugu, eta suspentzio hortan aurkitzen direnmikroorganismo desberdinak isolatzeko bi kultibo medio inokulatuko ditugu.Bikote bakoitzak honako hauek izango ditu: Mikroorganismoen suspentzio bat (lagin-problema), 2 Petri kutxatila McConkey kultibo-medioarekin eta 2 Petri kutxatila Gatz-manitol kultibo-medioarekinMurrizketa bidezko ereinketaren bidez kultibo medio hautakorra duten kutxatilak ereingodira , eta tenperatura egokian inkubatu 24 orduzKultibo puruak ditugula baieztatzeko normalean berrereinketak hiruzpalau aldiz eginbehar izaten dira, baina gure kasuan McConkey-an bi berrereinketa egongo ditugu (ezbait dugu denborarik berrereinketa gehiago egiteko):  Esperimentuaren lehen egunean mikroorganismoen suspentziorekin bi McConkey kutxatila inokulatuko ditugu.  Inkubazioaren ondoren, bigarren egunean, bi motatako koloniak egertu beharko lirateke: kolonia laktosa positiboak eta kolonia laktosa negatiboak . Lortutako bi kolonia isolatuak aukeratu (kolonia bat laktosa positiboa eta bestea laktosa negatiboa) eta berrereinketa egingo dugu McConkey kutxatila berri banetan murrizketa bidezko ereinketaren teknikaren bidez.Gatz-manitolean kasuan kultibo bakarra egingo da. Normalean ereinketa bakarrarekin ezgenuke isolaketa ziurtatuko, baina mikroorganismoen suspentzioa irakaslearentzatezaguna da, eta kontutan izanik suspentzioa osatzen duten mikroorganismoak,kontaminaziorik ez badago ez litzateke arazorik egon beharko kultibo bakarrean isolaketalortzeko (gainerako mikroorganismo motak ez lirateke haziko). Medio hontan ez daEntseiu mikrobiologikoak 40
  41. 41. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAberrereinketarik egingo mikroorganismoen suspentziotik abiatuz haz daitezkeenmikroorganismoek hazkuntza geldoa aurkezten dutelako (48 orduz inkubatu beharkoditugu kutxatilak), eta ondorioz ez genukeelako denborarik izango berrereinketakegiteko.Isolaketa prosesuaren ondoren, experimentuaren hirugarren egunean honako kultibohauek izan beharko genituzte: Bi MacConkey Petri kutxatila Bata kolonia laktosa positiboak dituena Bestea kolonia laktosa negatiboekin Bi Gatz-Manitol kutxatila koloniekin. McConkey Agarra Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu. Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu: Gatz biliarrak eta kristal-bioleta : bakterio Gram positiboen hazkuntza) eta zenbait Gram negatibo sentikorrena) inhibitzen du. Ondorioz, Gram negatiboak hasiko dira. Laktosa eta Glukosa 10:1 proportzioan. Mikroorganismo gehienek glukosa erabiltzeko gaitasuna dute, eta gutxi batzuk laktosa ere erabili dezakete. Mikroorganismoek glukosa soilik erabiltzen badute glukosaren hartzidura egitean konposagai azido gutxi ekoiztuko dituzte. Aldiz, glukosa eta laktosa erabiltzen badute, hartziduran konposatu azido asko ekoiztukoEntseiu mikrobiologikoak 41
  42. 42. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA dituzte. pH indikatzailea. Koloniak azido asko ekoizten badituzte kolore gorria izango dute (hots, laktosa erabiltzen dutenean). Ekoiztutako azido kopurua txikia denean koloniak zuriak izango dira. MacConkey agarrean hazitako koloniak. Kolonia zuriak laktosa negatiboak dira, eta kolonia gorriak laktosa positiboak. Manitol-gatz agarra Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu. Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu: Kloruro sodikoaren kontzentrazio altua (7.5%). Gatz kontzentrazio altua jasan dezaketen mikroorganismoak soilik haziko dira. Manitola. Manitolaren hartzidura ematen bada azidoak ekoiztuko dira kopuru handitan. pH indikatzailea. Medioa berez gorrizka da, eta manitol positiboak diren kolonien inguruan halo horia ikusi ahal izango dugu (azidoen ekoizpenaren ondorioz).Entseiu mikrobiologikoak 42
  43. 43. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Hazkuntzaren ondoren kolonia manitol positiboen inguruan halo horia eratuko da. Halo horiaren hedapena gerta daiteke kutxatila osoa hori gera daitekeeelarik.Entseiu mikrobiologikoak 43
  44. 44. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAIDENTIFIKAZIOAIdentifikaziorako, lehenengo aztertu egingo ditugu gure kultiboak puruak direnbeieztatzeko.Gram tintaketaren bidez, kolonien morfologia zelularra aztertuko dugu.  Kolonia isolatu bana aukeratuko dugu McConkey agarrean kutxatila bakoitzetik. Kolonia hori zelula bakarraren hazkuntzaren ondorioa izanik, kolonia hortan agertuko diren organismo guztiak berdinak izan beharko lirateke. Horrela izanik kolonia bakarraren Gran tindaketa egiten badugu zelula guztiek Gram tindaketarekiko emaitza berdina eman beharko da (zelula guztiak edo Gram positibo edo Gram negatibo izango dira), eta morfologia berdina aurkeztuko dute (denak bazilo, koko edo beste morfologiaren bat izango dute, baina denak morfologia bakarra izango dira). Horrela ez balitz, berereinketak egin beharko genituzke.  Gauza berdina gertatu bejarko litzateke Gatz-manitol agarrarekin.Kultibo puruak ditugula baieztatu ondoren, proba biokimikoak egingo ditugu. McConkeyagarreko koloniak proba biokimikoak egin baino lehen kultibo medio ez selektiboankultibatuko ditugu (TSA edo CPA). Arrazoia oso simplea da: kultibo-mediohautakorretatik abiatuz egiten baditugu proba biokimikoak, gerta daiteke probabiokimikoen emaitzak aldatzea (baldintza ez estandarrak erabiltzen ditugulako).Lagin probleman dauden bakteria mota ezberdinak isolatu eta medio ez-hautakorreanhazi ondoren, identifikaziorako beharrezkoak diren froga biokimikoen bateriak egingodira. Zein proba egingo den erabakitzeko dagokion eskema jarraitu.Entseiu mikrobiologikoak 44
  45. 45. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAHonako proba biokimiko hauek egin ditzakegu:Katalasaren proba.Karbohidratoen metabolismo oxidatzaile aerobikoan amaierako produktuetariko bat uroxigenatua da (H2O2). Produktu hau toxikoa izanik, mikroorganismoek konposatu hausuntsitzeko metodoak dituzte, hauen artean katalasa entzimaren ekintza dagoelarik.Katalasak honako erreakzioa burutuz ur oxigenatua suntzitu egingo du: H2O2 ---------> H2O + 1/2 O2Katalasa mikroorganismo aerobio eta aukerazko anaerobioetan egoten da, eta ez duguaurkituko aerotoleratzaileetan (azido laktikoaren bakterioak) eta anaerobioetan.Proba hau egiteko, porta baten gainean eta ur tantakarik gabe, aztertu nahi ditugunmikroorganismoak jarriko ditugu (ereintza-euskarria erabiliko dugu Petri kutxatilatikportara mikroorganismoen transferentzia egiteko). Ondoren ur oxigenatuaren diluzioagehituko dugu mikroorganismoen gainean. Burbuilak azalduko balira adierazitakoerreakzioa ematen dela esango genuke, hots, mikroorganismoak katalasa entzimadaukala.Oxidasaren proba.Arnasketa kate aerobioan c zitokromoa duten mikroorganismoak identifikatzekoerabiltzen da (enterobakterioek ez dute, eta Pseudomona-k bai).Proba hau egiteko jadanik prestatuta dauden erreaktibo kometzialak erabiliko ditugu.Ereintza-euskarriarekin mikroorganismoen kolonia bat hartuko dugu eta erreaktiboakdituen paperrraren gainean jarriko ditugu (urik gabe). Paperaren kolorea zuria izatetikurdina izatera igarotzen bada proba positiboa dela esango dugu (mikroorganismoaEntseiu mikrobiologikoak 45
  46. 46. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAoxidasa positiboa dela).Koagulasaren proba.Odolean fibrinogenoa dago, eta mikroorganismo batzuk fibrinogenoa polimerizatu etafibrina sortzen duten entzimak dituzte. Proba hontan entzima hori dutenmikroorganismoak identifikatuko ditugu. Proba komertziala izango da, eta kontrolpositiboa eta negatiboa izango ditu. Koagulasa entzimaren presentzia birulentzia faktoreada.Proba hontan latex bolatxoak izango ditugu fibrinogenoarekin estalita. Mikroorganismoakultibo-medio solidotik ereintza euskarriarekin hartu eta dagokion tanpoiaren tantabatetan suspendituko dugu. Ondoren latex bolatxoen tanta bat gehituko ditugu.Mikroorganismoa eta bolatxoak nahastu eta minutu pare batez mugitu egingo ditugu(errotazio mugimendua). Mikroorganismoaren paretan koagulasa entzima egonik latexbolatxoak bildu egingo dira eta bikorrak azalduko dira. Koagulasaren proba komertziala: Goian ezkerrean, kontrol positiboa. Goian eskuman, kontrol negatiboa. Behean ezkerrean, lagin positibo bat. Behean eskuman, hutsik.Entseiu mikrobiologikoak 46
  47. 47. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA Proba biokimikoen bateria saiodietan. Inokulatu gabeko saiodiak. Ezkerretik eskumara: indolaren proba, urearen proba, Metilo gorriaren proba, Vorgues-proskauer proba, Zitratoaren proba, KIA multi-proba medioa.Entseiu mikrobiologikoak 47
  48. 48. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAIMViC.Lau proba biokimikoz osoturiko proba da eta enterobakterioen desberdintzapenerakoerabiltzen da. Probak honako hauek dira:Indolaren proba (I).Proba hau egiteko behar den kultibo-medio likidoa (salda) saiodian izango dugu. Medioinokulatu eta berogailuan inkubatuko dugu 37°C-tan 24 orduz. Ondoren Kovacserreaktiboa gehituko dugu kontu handiz kultibo medioaren gainean kokatuko delarikerreaktiboa (erreaktiboa oliotsua baita). Interfasean eraztun gorria eratzen badamikroorganismoak medioan dagoen triptofanoaren degradazioz indola ekoiztu duelaadieraziko du. Kolore aldaketarik ez bada ematen proba negatiboa izango da.Metilo gorriaren proba (M).Saiodian MR-VP salda (Metilo gorria-Vorgues-Proskauer salda) izango dugu.Indolarekin bezala inokulatu, inkubatu eta irakurketa egiteko MR erreaktiboa gehitukodugu. Erreakzio gorria izanik proba posiboa izango da. Negatiboan ez da kolorealdaketarik emango.Vorgues-Proskauer proba (V).Saiodian MR-VP salda izango dugu (Metilo gorriaren proban ere medio berdina da).Inkubazioaren ondoren VP1 eta VP2 Erreaktiboak gehituko dira eta proba positiboaizanik kolore gorria emango du. Negatiboan ez da kolore aldaketarik emangoMetilo gorriaren proban eta Vorgues-Proskauerren proban enterobakteriak burutuEntseiu mikrobiologikoak 48
  49. 49. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAdezakeen hartzidura mota aztertzen da. Hatzidura bi motatakoa izan daiteke: hartziduraazido-mixtoa edo hartzidura butilenglikolikoa. Lehen kasuan azidoen ekoizpengarrantzitsua gertatzen da eta ondorioz Metilo gorriaren proba positiboa irtetzen da(azidotasun aldaketa bortitsa detektatzen da). Hartzidura butilenglikolikoan ez da azidoenekoizpen garrantzitsurik ematen eta besteak beste, azetoina ekoizten da. Vorgues-Proskauerren proban erreaktiboak gehitzean azetoinaren presentzia detektatuko dugu.Metilo gorriaren proba eta Vorgues-Proskauer proba ezin dira biak batera positibo izan.Zitratoaren proba (C).Saiodian zitratoa duen medioa solidoa daukagu. Jatorriz medioa orlegia da etainokulazioaren eta inkubazioaren ondoren mikroorganismoak zitratoa erabiltzekogaitasuna badu kolore aldaketa emango da (medioa urdina bilakatuko da).Entseiu mikrobiologikoak 49
  50. 50. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAUrearen proba.Salda hontako kultibo-medioak urea izango du (NH2-CO-NH2 ). Mikroorganismoak ureaerabiltzeko gaitasuna izanik, amonioa askatuko da eta ondorioz pH aldaketa emango da(pH-a gehitu egingo da nabarmenki, eta medioaren kolorea gorria bilakatuko da). Kolorealdaketa ematen bada proba positiboa dugula esango dugu.KIA (Kligler Iron Agar) muti-proba kultibo-medioa.KIA medioa multi-proba medioa dela esango dugu zenbait gauzadesberdin jakiteko erabili ahal daitekeen medioa delako. Mediosolidoa da eta siodietan izango dugu (argazkian, inolkulatu gabekomedioa ezkerraldekoa da).Medioa ziztadaz inokulatu eta ondoren zigi-zaga egingo dugumedioaren azalean.Besteak beste, medioko osagaien artean honako hauek daude:  sulfato ferrosoa  glukosa kontzentrazio baxuan KIA  laktosa kontzentrazio handitan  pH indikatzailea daude.Mikroorganismoak sulfatoa elektroi hartzaile bezala erabiltzeko gaibada arnasketa anaerobioaren bidez, sulfidrikoa ekoiztuko da, etaEntseiu mikrobiologikoak 50
  51. 51. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAmedioan burdin ferroso ioia dagoenez, FeS eratuko da. Sulfuroferrosoa eratu eta prezipitatzean prezipitatu beltza ikus daiteke.Mikroorganismoaren metabolismo hartzitzailearen ondorioz CO2ekoizten bada, medioa ziztatutako lekuan burbuilak agertuko dira.Batzutan, gasaren produkzioaren ondorioz medioak gora egin edoapurtu egin daiteke (argazkian eskumako saiodian gertatzen denbezala).Mikroorganismoak glukosa erabilitzeko ahalmena badu bainalaktosa erabiltzekoa ez, hartzidura egitean azido kopuru txikiaeratuko da. Azidoaren ekoizpenak medioaren kolore aldaketaerakarriko du saiodiaren hondoan (gorritik horira), baina azaleanoxigenoaren prezentziaren ondorioz eta medioan dagoen peptonarenerabileraren ondorioz amonioa ekoiztu eta pH-a altuagoa izango da,kolore aldaketarik ez delarik nabarituko medioaren gikaldean.Beraz, mikroorganismoak glukosaren hartzidura egiteko gai bada,baina laktosarena ez, medioaren gainazala gorria izango da etahondoa horia.Mikroorganismoak bai glukosa eta bai laktosa erabiltzeko gai bada,hartziduraren ondorioz azido asko ekoiztuko dira eta amonioarenekoizpenak ezingo du medio osoaren azidifikatzea ekiditu. Ondoriozmedio bere osotasunean gorritik horira pasatuko da (argazkianeskumako saiodian gertatzen den bezala).Entseiu mikrobiologikoak 51
  52. 52. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAProba biokimikoen bateria komertziala.Guk API 20E (Biomerieux, France) proba biokimikoen bateria komertziala erabilikodugu.Plastikozko tiratxo batetan hodi eta kupula anitz izango ditugu eta hodi bakoitzeandeshidrataturik dagoen substratoa dago. Mikroorganismoen suspentzioa prestatu etaproba komertziala inokulatzen (mikroorganismoa dagokion tanpoioan suspenditu eta hodieta kupula hoiek fabrikatzaileak adierazten duen eran inokulatuko ditugu) badugudeshidratatutako konposatuak disolbatu eta mikroorganismoek erabiliko dituzte edo ez.Hodi konkretu batetako konposatuen erabilera ematen bada, orduan medioan kolorealdaketa emango da.Inkubazio aldia (24 ordu) igaro ondoren kolore aldaketak emango dira. Aldaketa hoiekproba positiboa den edo ez adieraziko dute. Kasuren batzutan erreaktiboak erabilibeharko ditugu erreakzioaren emaitza ezagutzeko. API 20E proba biokimikoen bi bateria komertzial. bakoitza mikrooorganismo batekin inokulatua izanda, eta ondorioz proba desberdinen emaitzak desberdinak dira (kolore desberdinak ematen dituzte).Entseiu mikrobiologikoak 52
  53. 53. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA MIKROORGANISMOEN BEHAKETA.MIKROSKOPIOARENERABILERA 1. Objetiboak, okulareak eta kondentsadorea garbiak daudela ziurtatu. Ez baleude kontu handiarekin garbitu. 2. Lagina 10X objektiboarekin fokatu. Fokatzeko hasieran torloju makrometrikoa erabiltzen da. Fokatze finagoa lortzeko torloju mikrometrikoa erabiliko dugu. 3. Ondoren, 40X objektiboa jarri eta fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili (makrometrikoa ez litzateke beharrezko izan beharko). 4. Laginaren gainean olio tanta bat jarri eta 100X objektibora pasatu. Objektibo hau erabiltzeko olioa beharrezkoa da, era hortan difrakzio arazoak ekiditzen baitira. Fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili 5. Beharrezkoa izanik, argi kopurua kontrolatzeko, diafragmaren bidez argiaren sarrera kontrolatu 6. Behaketa guztiak amaitu ondoren eta mikroskopioa gorde aurretik objektiboak garbitu egin beharko dira (batez ere 100X objektiboa olioa kentzeko). Bukatzerakoan estalkia jarri. 7. Mikroskopioa erabiltzen ez den bitartean argi- iturria itzalita mantendu.Entseiu mikrobiologikoak 53
  54. 54. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLATINDAKETEN PRESTAKETAMikroskopioarekin mikroorganismoak behatzeko, hauekportatan jarri beharko ditugu. Horretarako portatanbakterioen hedapena prestatu beharko dira. Kasuguztietan portan oso garbi egon beharko dira.Bakterio hedapenaren prestaketa 1. Ereintza-euskarriarekin ur tanta bat jarri portaren erdian. 2. Suaren gainean euskarria bertikalki jarriz esterilizatu gori jarri arte bere luzera osoan. 3. Bakterioen kultiboa duen hodia hartu, suaren ondoan ireki eta sutatik pasa, tapoia sutatik gertu mantenduz. Esterilizatutako euskarria hodian sartu, hoztu beirarekin kontaktuan eta zelula kantitate txiki bat hartu. Euskarria hoditik atera, hodia sutatik pasatu eta hodia itxi. 4. Euskarriarekin hartutako zelulak portan dagoen ur tantan suspenditu eta ondoren hedatu portaren azalera zehar kapa fin eta homogeneo bat lortuz. 5. Euskarria esterilizatu. 6. Prestaketa lehortu arte itxaron. 7. Zelulak portaren azalean finkatzeko, porta bi aldiz sutatik pasatu. Honela bakteriak portan geratzea lortuko dugu. Azkenengo hau lortzeko alkohola eta zenbait konposatu kimiko ere erabili daitezke, baina beroa da erabiliena.Entseiu mikrobiologikoak 54
  55. 55. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAMedio likido batetik abiatzen bagara, pauso berdinakjarraitu behar dira, baina ur tantarik ez dugu beharizango (mikroorganismoen suspentsioa jadanikbadaukagulako).Entseiu mikrobiologikoak 55
  56. 56. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLABEHAKETA FRESKUANMuntai hezeaLegamia, onddo eta algak behatzeko erabiltzen den prestaketa mota. Bakterio biziakikusteko ere erabili daiteke.Mikroorganismoaren tanta bat portan jartzen da eta kubreobjektuarekin estali (aireburbuilak ekiditu beharko dira). Ondoren mikroskopioan behatzen da.Zintzilikaturiko TantaKultibo-medio likido batetan hazten ari diren mikroorganismoak ikusteko erabilikodugu teknika hau. 1. Kubreobjektu baten lau izkinetan baselina pixka bat jarriko dugu. 2. Ereintza-euskarrierekin kultiboaren tanta bat hartuko dugu eta kubreobjektoaren erdian jarriko dugu. 3. Kubreobjektuari buelta eman eta induzturiko porta baten sakonaldearen gainean kokatuko dugu laginaren tanta. Mikroorganismoaren tantaBehaketarako, mikroskopioaren lOX objektiboarekin tantaren ertza fokatuko dugu(ertza itsura ondulatudun lerro bat bezala ikusiko da). Ondoren 40X objektiboa jarri,berriz ere ertza fokatu, eta azkenez lOOX objetiboa jarriko dugu (olioarekin). Tantarenertzean bakterioak ikusiko ditugu. Bakterio hauek, baldin eta flageloak badituztemugitzen ikusiko ditugu.Experimentu hontan, behaketa mikroskopikoa egitean, bakterioak ez daudeneztindatuta, behaketa zaila izango da. Behar beharrezkoa izango da kondentzadoretikEntseiu mikrobiologikoak 56
  57. 57. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA sartzen zaigun argi kopurua oso ondo kontrolatzea mikroorganismoak ikusi ahal izateko. TINDAKETA BEREIZGARRIAK Tindaketa berezgarriak bakterioak sailkatzeko edo bereizteko erabili daitezke bakterioek tintatzeko orduan erakusten dituzten propietateen arabera. GRAM tintaketaBakterioen azterketarako erabiltzen den tintaketa bereizgarri garrantzitsuena da.Tintaketa honek bakterioak bi taldetan banatzen ditu, bakterioen paretazelularraren ezaugarrien arabera: GRAM positiboak eta GRAM negatiboak.Tindaketa egiteko mikroorganismoaren hedapen bat egingo da porta batetan,sugarrean finkatu, eta ondoren tindatu: 1. Lagina kristal bioteta koloratzaile basikoarekin estali (minutu bat) Gram tindaketa: 2. Urarekin garbitu Bazilo Gram negatiboak 3. Lugolarekin estali (1 minutu). Lugola, iodoa duen fixatzailea da (Kristal bioletaren finkapena baimentzen du). 4. Urarekin garbitu 5. Alkohol-azetonarekin dekoloratu (30 segundu). Gram negatiboetan, pausu honek kristal bioleta kendu egingo du. Gram positiboetan ez da dekolorazioa emango. 6. Urarekin garbitu 7. Safraninarekin edo fuktsinarekin tindatu (1 minutu). Kontraste tindaketa da hau. Gram negatiboek kolore larrosa hartuko dute, eta Gram Gram tindaketa: positiboek kristal bioleta dutenez, azken koloratzaile hau ez da Koko Gram positiboak Entseiu mikrobiologikoak 57
  58. 58. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA antzemango. 8. Urarekin garbitu 9. Sikatu 10. Behaketa mikroskopikoa.Beraz, kolore urdinak direnak GRAM positibok direla esango dugu, eta kolorelarrosadunak GRAM negatiboak, eta normalki tindaketaren emaitza paretarenizaerarekin erlaziona dezakegu.Dena den, GRAM positibo edo negatiboak izateak tindaketa baten ondorioz Gram tindaketa:lortzen dugun kolorea adierazten du (urdina edo larrosa), eta ez derrigorrez Koko Gram positiboak etapareta zelularraren izaera. Hala ere, mikroorganismo askorentzat, eta batez ere bazilo Gram negatiboakguretzat garrantzitsuak izan daitezkeen mikroorganismo askorentzat,tindaketaren emaitza eta paretaren izaera erlazionatzea posible da. Tindatzaileak gehitu ondoren, porta urarekin Tindaktea ondoren porta sikatzen utziko dugu. garbitzen Entseiu mikrobiologikoak 58
  59. 59. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLATINDAKETA SELEKTIBOAKapsularen tintaketaBakteria asko lodiera desberdina izan dezakeen kapsula batez inguraturik daude;kapsula hauek zelula baino intentsitate txikiagoarekin tintatzen dira, eta ondorioz,tindaketa arruntekin ez dira nabarmentzen. Kapsula hauek behatzeko tindaketa motaegokia tindaketa negatiboa da. Tindaketa hontan koloratzaile azidoak erabiltzen dira(koloratzaile azidoetan kolorea gatzaren ioi negatiboan oinarrituta dago, eta zelulagehienak kanpoaldean karga negatiboa dutenez, ez dute koloratzailea hartzen etakoloratzailea zelula inguratzen dagoen likidoan geratuko da).Portaren izkina batetan tinta txina edo negrosina tanta bat jartzen dugu. Ereintzaeuskarriarekin mikroorganismoen kopuru txiki bat hartuko dugu eta koloratzailearentantan suspendituko ditugu. Ondoren, beste porta baten ertzarekin eta koloratzailearentantatik hasita frotis bat egiten da portaren luzeran zehar. Era hontan koloratzailearenkapa fin bat lortzen da, kapa fin hortan mikroorganismoak egongo direlarik. Laginaairean lehortzen usten da, eta ondoren mikroskopioan behatzen da. Bakterioak daudenlekuan kolore argia izango dugu (koloratzailerik gabe).Tindaketa mota hau bakterioen morfologia ikusteko ere erabili daiteke. Kapsulen tindaketa: hutsune zuriak kapsulen presentzia adierazten duteEntseiu mikrobiologikoak 59
  60. 60. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEndosporen tintaketaBacillus eta Clostridium generoetako espezieek ingurune baldintzekiko osoerresistenteak diren egiturak eratzen dituzte: endosporak. Endosporak, zelulabegetatiboak ez bezala, denbora epe luzetan baldintza desfaboragarrietan iraundezakete. Egitura hauek, tintatzaileekiko ere erresistentzia erakusten dute, tintaketamota gehienetan ez direlarik koloreztatzen. Hala ere, tintatu ondoren, koloratzaileakentzea oso zaila da. Endosporak tintatzeko tintatzaile kontzentratuak berotan erabiltzendira.Endosporen tindaketa: Wirtz metodoaEndospora asko dituen bakterio kultibo zahar baten tanta bat portan jarri eta lehortzenutzi (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium). Beroarekin fixatu. Malakita berdearekinestali eta berotu lurrina irten arte. Horrela mantendu hiru minutuz. Urarekin garbitu etakontrastea lortzeko fuksina koloratzailea gehituko diogu minutu batez. Esporak koloreberdea hartuko dute eta zelulek larrosa. Endoporen tindaketa: endosporak kolore orlegi argia azaltzen dute, eta zelula begetatiboak larrosa. Endosporak zelula begetatiboen barruan edo aske ager daitezke.Gorputz metakromatikoen tindaketaBakterio batzuk polifosfatoz osoturiko bikorrak dituzte (gorputz metakromatikoak edobolutina bikorrak). Bikor hauek koloratzaile basikoekin tindatu eta koloratzailearen argixurgapenaren ezaugarriak alda ditzakete (horregaitik deritze metakromatikoak). Egiturahauek lehenengo aldiz Spirillum volutans espezien aurkitu ziren (horregaitik bolutinaEntseiu mikrobiologikoak 60
  61. 61. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAbikorrak izena). Lactobacillus generoan ere agertzen den egitura da (yogurta egitekoLactobacillus vulgaricus eta Streptococcus thermophilus erabiltzen dira)Egitura zelular gehienak koloratzaile basikoekin tintatzen dira hauen inguruko pH-apuntu isoelektrikoaren gainetik dagoenean (5 baino handiagoa). Bolutina osagai azidoezosatua dagoenez, koloratzaile basikoekin tindatu ahal izateko medioaren azidotasunajeitsi egin beharko da bolutina bikorren eta koloratzaile basikoaren arteko afinitatealortzeko (pH <4).Albert tintaketa 1. Lactobacillus kultiboaren (yogurta) hedapena portan egin eta airean lehortu. 2. Albert tintatzailearekin 5 minutuz estali. 3. Tintatzailea kendu, lugola gehitu minutu batez, urarekin garbitu, lehortu eta 100X objektiboarekin mikroskopioan behatu.Gorputz metakromatikoak orlegi-urdin kolorez tintaturik ikusten dira, bakterioarengainontzeko zatiak orlegi argiak. Lactobacillus zelulen barruan puntotxoen segida batbezala azalduko dira gorputz metakromatikoak. Yogurteko Lactobacillus -en barruan gorputz metakromatikoen tindaketa.Gorputz metakromatikoak hiladatan agertzen dira baziloen barruan aurkitzen dutelarik, eta batzutan kokoen hiladak dirudite.Entseiu mikrobiologikoak 61
  62. 62. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 62
  63. 63. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 63
  64. 64. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOSTEMA: Recuento de hongos en un alimento balanceado de marca comercial parapollosOBJETIVO: Determinar la presencia y recuento de hongos en un alimentoTÉCNICA: Método de las diluciones sucesivas y siembra en superficie de AgarFUNDAMENTO: El presente análisis permite determinar la presencia de hongoscontaminantes, sean éstos ambientales o propios del alimento por contaminacióndurante o después de su elaboración.DESARROLLO: Pesar exactamente 10 gr del alimento a analizar cuya poblaciónfúngica se desea estudiar. Añadir la muestra de alimento a 90 ml de H2O d/e (aguadestilada estéril contenida en un erlenmeyer, agitar hasta alcanzar la mayor disoluciónposible. El contenido del erlenmeyer (agua más alimento) constituye la “suspensiónmadre” .Tener preparado 10 tubos de ensayos estériles con 9 ml de H2O d/e cada uno y 10placas de Petri estériles con 0,1 ml de Rosa de Bengala (colorante), 0,1ml deClorenfenicol (antibiótico inhibidor de crecimiento bacteriano) y 10 ml de Agar papadextrosa (o Saboraud Glucosa).Colocar en el primer tubo 1 ml de la suspensión madre , de esta forma obtendremos asíla primera dilución de la muestra, esto equivale a la dilución 1:10 que es lo mismo 10-1.Colocar 1 ml de la dilución 1:10 al segundo tubo, obtendremos así la segunda dilución,esto equivale a la dilución 1:100 que es lo mismo 10-2.Colocar 1 ml de la dilución 1:100 al tercer tubo, obtendremos así la tercera dulución,esto equivale a la dilución 1:1000 que es lo mismo 10-3.Colocar 1 ml de la dilución 1:1000 al cuarto tubo, obtendremos así la cuarta dilución,esto equivale a la dilución 1:10000 que es lo mismo 10-4.Colocar 1 ml de la dilución 1:10000 al quinto tubo, obtendremos así la quinta dilución,esto equivale a la dilución 1:100000 que es lo mismo 10-5.En todos los casos se hace por duplicado (utilizando de esta manera los 10 tubosestériles con 9 ml de H2O d/e.Nota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante yEntseiu mikrobiologikoak 64
  65. 65. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLANota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante yantibiótico y luego agregar el Agar estéril a una temperatura que pueda ser soportadopor la mano. (tener cuidado que solidifica muy rápidamente).Una vez agregado el Agar agitar la placa por movimientos giratorios sobre la mesada.En cada una de las placas de Petri se colocará 0,1 ml de cada uno de los tubos (utilizarpor cada una de las diluciones una pipeta estéril distinta) Tendremos así 5 placasoriginales y 5 duplicados.Proceder a sembrar la muestra sobre la superficie del Agar con espátula de Drigalskyestéril (flameado sobre la llama y enfriada sobre la tapa de la placa). Dejar secarsobre mesada y luego proceder a incubar las 10 placas previo rótulo con la diluciónque contiene, en forma invertida en estufa de cultivo a 27ºC durante 5 días.Al cabo del 5º día de incubación proceder al realizar el recuento de colonias.RECUENTOGeneralmente las placas que contienen las diluciones 1:10 y 1:100 (primeras dosdiluciones no se tienen en cuenta por la gran cantidad de colonias.Se comienza la lectura de la última dilución hacia atrás.Contar las colonias crecidas en cada una de las placas originales (se supone que tieneque se idético al contaje en su duplicado).El total de colonias se multiplica por 10 por el factor de dilución, es decir:p. ej.: en la placa 5 cuya dilución es de 1:100000 lo que equivale a 10-5 se contaron 8colonias, tendremos:8 X 10 X 105 = 800.000 UFC/gr de alimentoCuanto mayor sea la dilución, menor será el númeo de colonias que se tienen quecontar.Nota: cuidado que no se multiplica p. ej.:X 10-5 sino por 105)Entseiu mikrobiologikoak 65
  66. 66. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLA(Ver esquema de trabajo)ESQUEMA DE TRABAJO: MUESTRA ALIMENTO 10 grs. 90 ml agua destilada estéril 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e dil. 1:10 dil. 1:100 dil. 1:1000 dil. 1:10000 dil. 1:10000001 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color.10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml AgarEntseiu mikrobiologikoak 66
  67. 67. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 67
  68. 68. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 68
  69. 69. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 69
  70. 70. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 70
  71. 71. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 71
  72. 72. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 72
  73. 73. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 73
  74. 74. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 74
  75. 75. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 75
  76. 76. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 76
  77. 77. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 77
  78. 78. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 78
  79. 79. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 79
  80. 80. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 80
  81. 81. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 81
  82. 82. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 82
  83. 83. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 83
  84. 84. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 84
  85. 85. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 85
  86. 86. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 86
  87. 87. ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua ANALISIA ETA KONTROLAEntseiu mikrobiologikoak 87

×