1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29276
(51) C12N 1/20 (2006.01)
A01N 63/00 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1996.1
(22) 30.12.2013
(45) 15.12.2014, бюл. №12
(72) Шегебаева Асемгул Амантаевна; Рахимова
Елена Владимировна; Нечай Наталья Леонидовна;
Карменова Жулдуз Кайратовна; Доспаева Райхан
Талгатовна; Алмагамбетов Каиртай Хамитович
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Республиканская
коллекция микроорганизмов" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(74) Суюндуков Мади Жмайевич
(56) KZ 10330B, кл. C12N 1/14, A01N 63/00, 2001
(54) ШТАММ ГРИБА TRICHODERMA VIRIDE
PERS.134-1, ОБЛАДАЮЩИЙ
ФУНГИЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ
ФИТОПАТОГЕНОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
РАСТЕНИЙ
(57) Изобретение относится к микробиологии и
биотехнологии, в частности, к получению средств
защиты лекарственных растений полыни гладкой
Artemisia glabella Kar. et Kir. и аянии
кустарничковой Ajania fruticulosa (Ledeb.) Poljak от
фитопатогенов, и представляет собой новый штамм
гриба Trichoderma viride Pers. для получения
биопрепарата триходермина.
Новый штамм гриба Trichoderma viride Pers.
обладает фунгицидным действием в отношении
фитопатогенов лекарственных растений.
Методом агаровых блоков значения величин зон
ингибирования роста фитопатогенов превышали 20
мм, что свидетельствовало о высокой
чувствительности Fusarium oxysporum, Alternaria
alternata, Macrosporium commune к исследуемому
штамму Trichoderma viride F-RKM 0560.
Методом встречных культур угнетение роста
фитопатогенов на 10 сутки (76-95%)
свидетельствует о наличие антибиотических
свойств у штамма гриба Trichoderma viride F-RKM
0560.
Прирост стебля и корня после обработки семян
аянии кустарничковой продуктами метаболизма
штамма Trichoderma viride F-RKM 0560 на 5,15-
6,07%, полыни гладкой на 6,05-8,12% выше
контроля. На 14 сутки инокулирования семян аянии
кустарничковой - на 7,32-9,14%, полыни гладкой -
на 8,18-10,05% выше контроля.
Данный штамм рекомендуется в качестве основы
биопрепарата для защиты сеянцев лекарственных
растений от фитопатогенов.
(19)KZ(13)A4(11)29276

2. 29276
2
Изобретение относится к микробиологии,
биотехнологии и представляет собой новый штамм
гриба, обладающий фунгицидным действием против
фитопатогенов лекарственных растений.
Известен штамм гриба Trichoderma lignorum F-
RKM 0268, обладающий фунгицидным
действием к фитопатогенным микроорганизмам
(Инновационный патент РК №24478), обладающий
антагонистической активностью по отношению к
Fusarium sporotrichiella, характеризующийся
диаметром стерильной зоны по всей поверхности
чашки Петри, а также фитотоксичностью штамма -
снижением роста ростков и проростков
сельскохозяйственных культур на 61,9% и 33,3%
соответственно, снижением всхожести на 67% и
фитопатогенностью штамма - полным снижением
всхоженности (пораженность 100%).
Недостатком известного штамма является
ограниченное действие, направленное на отдельного
возбудителя сельскохозяйственных культур.
Известен штамм гриба Trichoderma viride ИМИВ
F-1, обладающий комплексным действием против
стеблевых, галловых нематод, колорадского
жука и фитопатогенов (Патент РК №10330),
характеризующийся антагонистическими
свойствами против возбудителей болезней растений
Alternaria tenius, Aspergillus niger, Fusarium
oxysporum, Fusarium solani, Fusarium sporotrichiella,
Rhizoctonia solani, Helminthosporium sativum, Phoma
solanicola, Botrytis cinerea, Sclerotium sclerotiorum,
Erwinia carotovorum, Bacillus subtilis, а также
стимулирующий рост проростков
сельскохозяйственных растений (пшеницы, огурцов,
томатов, сои, сахарной свеклы, кукурузы, перца) на
17-20% выше контроля.
Недостатком известного штамма является низкая
эффективность антагонистической активности в
отношении данных фитопатогенов.
Новый штамм гриба Trichoderma viride Pers.
обладает высокой антагонистической активностью в
отношении фитопатогенных грибов лекарственных
растений Fusarium oxysporum, Alternaria alternata,
Macrosporium commune.
Trichoderma viride Pers. выделен из ризосферы
полыни гладкой Artemisia glabella Kar. et Kir.,
произрастающих на сухостепной зоне Центрального
Казахстана с темно-каштановыми почвами. Штамм
депонирован в Центральном музее
микроорганизмов РГП «Республиканская коллекция
микроорганизмов» с целью гарантийного хранения
и патентной процедуры под номером F-RKM 0560.
Копия свидетельства о депонировании прилагается.
Выделение грибов рода Trichoderma проводят
путем высева почвенных суспензий на питательную
среду Чапека. Для этого использовали навеску в 1 г
почвы и переносили в колбу со 100 мл стерильной
водопроводной воды. Готовили разведения
почвенной суспензии, для чего 1 мл почвенной
суспензии из колбы (разведение 1:100)
последовательно переносили в ряд пробирок с 10 мл
стерильной водопроводной воды. Посев почвенной
суспензии на плотные среды проводили из
разведений 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. в зависимости
от таксономической принадлежности учитываемых
микроорганизмов. На поверхность питательной
среды наносили 0,1 мл почвенной суспензии
определенного разведения и с помощью
стеклянного шпателя распределяли по всему агару.
Чашки со средой Чапека инкубировали при 26°С ±
1°С в течение 5-7 суток. Идентификацию видов
проводили на основании исследования физиолого-
морфологических и культуральных особенностей
выделенных изолятов методами, предложенными
J.Bisset и GJ.Samuels.
Состав стандартной среды Чапека (г/л
дистиллированной воды): NaNO3 - 3,0; KН2РO4- 1,0;
MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4- 0,01; сахароза - 30,0,
агар-агар - 20,0. Стерилизация среды при 0,5 атм. -
20-30 мин. Культивирование в течение 5-7 суток при
t +28°С на качалке 120 об/мин. Хорошо растет на
жидкой синтетической среде Чапека; картофельно-
декстрозном агаре.
Морфолого-культуральные признаки
Колонии Trichoderma viride Pers.,
формирующиеся на среде Чапека распростертые, на
7 день культивирования занимают всю чашку, центр
колонии занят стерильным неокрашенным
мицелием, далее располагается зона спороношения,
окрашенная в желтый и желто-зеленый цвет. Реверс
не окрашенный.
При микроскопировании обнаружены
септированные, бесцветные гифы различного
диаметра. Старые гифы диаметром 3,32-7,66 мкм,
вакуолизированы и в них хорошо видны включения.
Тонкие гифы диаметром 2,49-3,32 мкм.
Конидиеносцы представляют собой боковые
ветвящиеся веточки мицелиальных гиф. Фиалиды
удлиненно-бутылевидные с хорошо оформленной
шейкой, размером (6,64-8,72 × 3,32-4,15) мкм.
Конидии круглые, диаметром 2,97-3,35 мкм,
одноклеточные, образуются на вершинах фиалид.
pH: минимальный - 4,5; оптимальный - 5,5-6,7;
максимальный - 7,2.
Температура скорости роста мицелия:
минимальная - 7-10°С; оптимальная - 21-29°С;
максимальная - 25-28°С.
Физиолого-биохимические свойства
Отношение к источникам углерода. Хорошо
усваивает глюкозу, сахарозу, крахмал;
удовлетворительно - мальтозу, маннит.
Отношение к источникам азота. Хорошо
усваивает азотнокислый калий, азотнокислый
натрий, нитрат аммония.
Изучены дифференцирующие и диагностические
ферменты (амилолитические, протеолитические,
целлюлозолитические): проявляет зону
просветления на среде с крахмалом, разжижижает
желатину, на фильтровальной бумаге не растет.
Сведения о наличие патогенных свойств: штамм
Trichoderma viride F-RKM 0560 принадлежит к 3
классу опасности.
Способ, условия и состав сред для хранения
штамма. Хранение на скошенной агаризованной
среде Чапека подкисленной до рН-5-6, при
температуре +4°С, пересев 1 раз в 3-4 месяца.
Состав среды Чапека (г/л дистиллированной воды):

3. 29276
3
NaNO3 - 3,0; KН2РO4-1,0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5;
FeSO4- 0,01; сахароза - 30,0, агар- агар - 20,0.
Антагонистические свойства
Антагонистические свойства штамма в
отношении фитопатогенов изучали методами
агаровых блоков и встречных культур.
Испытуемую культуру гриба высевают
сплошным газоном на поверхность агаровой
пластинки в чашке Петри. После того как организм
хорошо вырастет, пробочным сверлом (диаметр
примерно 8 мм) вырезают агаровые блоки с газоном
продуцента и переносят их на поверхность другой
агаризованной среды, засеянной тест-культурой. На
одну чашки Петри размещают 4 агаровых блока. О
степени антагонистической активности испытуемой
культуры судили по величине зоны ингибирования
роста тест-культур вокруг агаровых блоков.
По дну чашки Петри провести черту,
разделяющую чашку на две равные части. Залить
агаризованную среду по 20 мл на чашку. В центр
одной половины на расстоянии 2 см от черты
поместить, засеяв гриб-патоген, на таком же
расстоянии в центр другой - гриб рода Trichoderma.
Степень антагонистического воздействия штамма на
фитопатогенные тест-культуры учитывали по 5-
бальной шкале.
Данные по антагонистической активности,
полученные методами агаровых блоков и встречных
культур штамма гриба Trichoderma viride F-RKM
0560 приведены в табл. 1, 2.
Таблица 1
Значения величин зон ингибирования роста тест-культур штаммом Trichoderma viride F-RKM 0560, мм
Тест-культуры Радиус зоны подавления роста тест-культуры на 5 сут.
Fusarium oxysporum 22-24
Alternaria alternata 25-30
Macrosporium commune 22-24
Значения величин зон ингибирования роста тест-
культур превышали 20 мм, что свидетельствовало о
высокой чувствительности данных тест-культур к
исследуемому антагонисту.
Таблица 2
Показатель ингибирования фитопатогенов штаммом Trichoderma viride F-RKM 0560, %
Тест-культуры Степень нарастания колоний гриба на 5
сут., балл
Внешний вид колоний патогена на 10
сут.
Fusarium oxysporum 4 - рост возбудителя угнетен на 75% Мицелий редкий, прижатый к субстрату,
патоген угнетен
Alternaria alternata 4 - рост возбудителя угнетен на 75% Мицелий редкий, прижатый к субстрату,
патоген угнетен
Macrosporium commune 4 - рост возбудителя угнетен на 75% Мицелий редкий, прижатый к субстрату,
патоген угнетен
Угнетение роста фитопатогенов Fusarium
oxysporum, Alternaria alternata, Macrosporium
commune на 10 сутки (76-95%) свидетельствует о
наличие антибиотических свойств у гриба
Trichoderma viride F-RKM 0560.
Ростстимулирующие свойства
Trichoderma viride F-RKM 0560 стимулирует
произрастание семян лекарственных растений.
Прирост стебля и корня на 7 сутки после обработки
семян аянии кустарничковой продуктами
метаболизма штамма Trichoderma viride F-RKM
0560 на 5,15-6,07%, полыни гладкой на 6,05-8,12%
выше контроля. На 14 сутки инокулирования семян
аянии кустарничковой - на 7,32-9,14%, полыни
гладкой - на 8,18-10,05% выше контроля.
Таким образом, приведенные данные позволяют
считать, что применение данного штамма,
обладающего высокой антагонистической
активностью против фитопатогенов Fusarium
oxysporum, Alternaria alternata, Macrosporium
commune, позволит снизить потери продуктивности,
а его ростстимулирующие свойства будут
способствовать повышению урожайности
лекарственных растений.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм гриба Trichoderma viride Pers.,
депонированный в РГП «Республиканская
коллекция микроорганизмов» МОН РК под номером
F-RKM 0560, обладающий фунгицидным действием
против фитопатогенов лекарственных растений.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова