2. استخراج mRNAاز بافت غده زهری عقرب ایرانی ادونتوبوتوس دوریه
( ،)Odonthobuthus doriaeتهیه cDNAاز آن و انجام PCR
از ژن 1 ODبا استفاده از پرایمرهای دژنراتیو
اساتید راهنما: دکترامیر جاللی، دکتر حمید گله داری
استاد مشاور: دکتر عباس زارع میرک آبادی
2
4. oاهمیت مطالعات ژنتیکی:
- انجام پروژهای بی شمار و صرف میلیاردها دالر
اهمیت کلون نمودن و تهیه مقدار کافی سموم جدا شده از زهر جانوران سمی به ویژه عقرب وبه ویژه عقرب و حلزون های سمی دریائی (،)conus
تهیه داروهائی با قیمت تمام شده پائین در مقایسه با روشهای قبلی (با توجه به شواهدبه شواهد فارماکولوژیک و فیزیولوژیک گزش)
در دو سال اخیر دو داروی آن یعنی ® Zincotideو ® ، Exantaبه بازار معرفی وبازار معرفی و تعداد زیادی نیز در مرحله کارآزمائی بالینی می باشد
4
5. عقربها ()scorpions
رده عنکبوتیان، متعلق به شاخه بند پایان ( ، )Arthropodaابتدائی ترین جانواران موجود در جهان با بیش از
0051 جنس مختلف ، متشکل از 9 خانواده مهم و با پراکندگی جهانی باال ، از لحاظ تاکسونومی ، شش خانواده
از این عقرب ها تا کنون تشخیص داده شده اند:
:Buthidaeمهمترین جنسهای خطرناک:
آندرو کتونوس ()Androctunus
لیوروس () Leiurus
متعلق به دنیای قدیم عقربها
بوتوس ()Bothotus
هترومتروس ()Heterometrus
و
پارابوتوس )(Parabuthus
سنترورویدس )(Centruroides
متعلق به دنیای جدید
تیتیوس ).(Tityus
5
6. Bothriuridaeو :Chactidae
در دسته بندی خانواده عقربها
چندان مورد توجه قرار نگرفته اند.
Nebo hierichonticus
:Diplocentridaeبه استثناء عقرب
سایر گونه های این خانواده چندان مورد توجه نیستند.
:Scorpionidaeبه استثناء عقرب Hemiscorpios
lepturusسایر گونه های این خانواده چندان مورد توجه
قرار نگرفته اند.
: Vaejovidaeاهمیت کمتری نسبت به بوتیده دارند. گزش گونه های
. Vaejovus spو . Hadrurus spتنها با اثرات موضعی و درد در محل گزش
همراه است.
6
7. مهمترین جنس های عقرب در پزشکی
تقریبا اکثر این جنس ها در تیره بوتیده هستند.
بوتوس ): (Buthus
Buthus occitanusمهمترین گونه این جنس است.
مزوبوتوس (:)Mesobuthus
گزش Mesobuthus tamulusیا عقرب قرمز هندی عمدتا باعث مشکالت قلبی عروقی ( ازدیاد
فشار خون ، آریتمی ، آدم ریوی) می شود .
لیوروس (:)Leiurus
:Leiurus quinquestriatusیکی از شناخته شده ترین عقربهای سمی دنیا است.گزش آن
بسیار خطر ناک است.
پارابوتوس (: )Parabuthus
مهمترین گونه های آن در افرقای جنوبی و زامیبیا یافت می شود. درد در موضع و اثرات سیستمیک و
گزش
با
تواند
می
مرگ
حتی
P.transvaalicus,P.pallidus,P.liosoma,P.granulatusو P. fulvipes
اتفاق بیفتد.
7
8. سنتروئیدس (: )Centruroides
این جنس شامل گونه های مهم متعلق به نسل جدید عقرب ها می باشد ,C.sculpturatus
C.suffusus ,Centruroides suffusesمهمترین گونه های این جنس که اندازه برخی از
آنها تا 9 سانتیمتر نیز می رسد و دارای رنگ زرد تا قهوه ای تیره هستند.
تیتیوس (: )Tityus
این جنس بیش از 001گونه دارد که مهمترین گونه آن T.serrulatusبومی برزیل است.
8
11. عقربهای ایران
انواع عقربهای ایران در 2 تیره ( 2 )familyزیر تیره ( 17 )Subfamilyجنس (23 )Genus
گونه (7 )Speciesزیر گونه و 4 فرم وجود دارد.
عقربها گاها ً دارای یک نام محلی و یا با یک مشخصه اصلی نامیده می شود. به عنوان مثال
عقرب سیاه به جنس آندروکتونوس ( )Androctonusگفته می شود. انواع بوتاکوس
( )Buthacusو ادونتوبوتوس ( )Odonthobuthusبه عقرب جراره معروفند. به
عقربهای پوشیده از پرز یعنی انواع بوتاکوس ( )Buthacusو سیمونوئیدس
( )Simonoidesعقرب پشمالو میگویند. همی اسکرپیوس لپتوروس نیز گادیم یا عقرب
هفت دم نامیده می شود .
در ایران دو خانواده از عقرب ها به نامهای بوتیده و اسکورپیونیده وجود دارد.
11
14. خصوصیات کلی عقربها
عقربها گوشت خوارند و همنوع خواری به مقدار زیادی در بین آنها رایج است. مقاومت این
جانوران در مقابل گرسنگی زیاداست و قادرند چند ماه حتی یکسال بدون غذا زنده بمانند.
عقربها پوست اندازی می کنند . این عمل در محل تاریک و یا در شب انجام می شود. نیاز به
اکسیژن این جانور کم است و معموال به سن ، جنس و شرایط محیط زیست آنها بستگی دارد.
در عقربها جنس نر از جنس ماده جداست و گاها ً اختالف ظاهری چندا نی بین نرو ماده دیده
نمی شود جفت گیری در آنها معموال در فصل بهار صورت می گیرد و زنده زا می باشند.
تعداد نوزادان بر حسب نوع عقربها متفاوت و از 6 تا 9 عدد گزارش شده است.
41
15. دستگاه سمی عقربها
دستگاه سمی عقربها در انتهای دم قرار گرفته و شامل دو غده سمی است که در پوشش ضخیم کیتینی قرار
دارد. این پوشش در انتها، نیش تیزی را تشکیل می دهد. دو غده سمی اغلب در سطح داخلی به یکدیگر
چسبیده اند. هر غده معموال دارای کانال خروجی مستقلی است. هر یک از دو کانال کمی خمیده و دارای
مجرای کوچکی هستند که در نزدیکی نوک نیش ، در قسمت خارجی و طرفین آن بوسیله سوراخی بیض ی
شکل به بیرون باز می شوند.
بافت ترشحی غده ها از جنس اپی تلیوم ساده ای است که دو دسته سلول در آن دیده می شود. یک دسته
سلولهای کوچک غیر فعال به شکل نیمه مکعب که الیه نازکی را تشکیل می دهند و بعدا جایگزین سلولهای
اصلی و فعال ترشحی می شوند. دسته دوم سلولهای اپی تلیال فعالند که دارای نوکلئوس و گرانولهای سمی
قابل رویت هستند.
شکل ساختمان غده سمی در تیره های مختلف ، اختالف هایی را نشان می دهند. سلولهای مولد سم در
عقربها از نوع آپوکرین می باشند و تا وقتی سیتوپالسم در آنها وجود داشته باشد و نوکلئوس در آنها فعال
باشد سم ترشح می شود
51
17. عقرب ادونتوبوتوس دوریه
از میان این 44 گونه ، 7 گونه عقرب ایران خطرناک و دارای اهمیت پزشکی
هستند که عقرب ادونتوبوتوس دوریه ( )O.doriaeیکی از آنهاست. این عقرب
متعلق به خطرناکترین خانواده عقربها یعنی Buthidaeجنس Buthusبا دو زیر
گونه doriaeو Odonthurusاست که در ایران وجود دارند. رنگ این عقرب
زرد و دارای اندازه حدود 8 سانتیمتر در حالت بلوغ میباشد
71
18. پراکندگی:
این عقرب بیشترین میزان پراکندگی شناخته شده در میان عقربهای ایران را داراست و
در مناطق مرکزی ، جنوب و شمال شرقی ایران بیشتر یافت می شود.
81
19. ویژگی های زهر عقرب
زهر زیر گروهی از سم می باشد که برای ایجاد اثرات مخرب باید از یک ارگانیسم
به ارگانیسم دیگر تزریق شود. سم به تمام موادی اطالق می شود که بر مبنای
تغییرات بیوشیمایی باعث بروز صدمه در موجودات زنده می گردد.
بطور دقیق تر ، زهر ترکیب پیچیده ای از موادی است که برخی از آنها سمی اند و
بقیه به عنوان حامل ، توزیع کننده و هضم کننده در ساختمان زهر به کار رفته اند.
زهر معموال توسط سلولهای اپی تلیال ترشح می شود و در قسمت لومینای غدد
اگزوکرین ذخیره می گردد
91
20. خصوصیات و اجزای زهر عقرب
زهر عقرب ماده ای پروتئینی است که در حالت تازگی و خلوص ، شفاف و بی رنگ و
با pHخنثی تا اسیدی است. پودر آن سفید تا کرم روشن و کریستال آن زرد رنگ است.
فاکتورهای فعال و خالص زهر عقرب در محلولهایی از قبیل متانول یا اتانول ، اتر ،
کلرفورم ، بنزن ، گزیلن ، غیر قابل حل است. در صورتی که در آب به راحتی حل می
شود. محلول این فاکتور ها در حرارت 001 درجه سانتی گراد به مدت 03-51 دقیقه ،
تنها بخشی از فعالیت خود را از دست می دهد.
اجزای تشکیل دهنده زهر عقرب و مقدار آنها به نوع عقرب و شرایط بوم شناسی محیط
بستگی دارد. توکسین ها مهمترین اجزاء زهر عقرب بوده که اساسا پروتئین های بافری
پایین در حدود 0007 دالتون هستند. پایداری باالی این سموم نیز به علت وزن مولکولی
باشد. در ساختمان این توکسین ها ، یک زنجیره پلی پپتیدی منفرد با 3-4 پل دی
این پروتئین ها را فاکتور های سمی از قبیل نرو توکسین ، کاردیوتوکسین ، هموتوکسین
می دهند.
02
21. از فاکتورهای سمی دیگر زهر عقرب می توان به آنزیم ها اشاره کرد. تنها آنزیمی که از نظر کمی به مقدار
قابل توجهی در زهر عقرب یافت شود ، آنزیم هیالورونیداز می باشد ، گرچه در بعض ی از گونه ها نظیر
بوتوس تامولوس ، فعالیت فسفودی استراز قابل توجه می باشد. انواع دیگر آنزیم ها با کمیتهای متفاوت
در زهر انواع مختلف عقرب دیده می شود از جمله : فسفولیپاز 2 ، aفسفومنواستراز و 5’ نوکلئونیداز ،
لیستیناز ، استیل کولین استراز و آنزیم های با اثر انعقادی و ضد انعقادی.
در زهر عقرب اسیدهای آمینه آزاد و ترکیبات حلقوی هتروسیکل نظیر آمین ها نیز مشاهده می شود. از این
ترکیبات می توان به هیستامین و سروتونین اشاره نمود .
مطالعات نشان می دهد که سروتونین که جزیی از زهر عقرب می باشد ، باعث انقباض رگهای خونی در
پستانداران می شود. با توجه به اینکه سروتونین باعث افزایش برانگیختگی ماهیچه ها می گردد، لذا
موجب ایجاد درد می شود.
هم چنین سروتونین موجود در زهر عقرب باعث انقباض رحمی و در نتیجه سبب سقط جنین در موش
صحرایی می گردد. لذا عامل سقط جنین خود به خودی در سه ماهه اول بارداری در زنان عقرب گزیده را به
سروتونین نسبت می دهند.
12
22. تقسیم بندی سموم عقرب
در جامع ترین تقسیم بندی سموم بر اساس سنجش بیولوژیک ( )Bioassayبه هنگام خالص سازی
، توکسینهای عقرب به سه گروه ذیل تقسیم شده اند(52) :
1. سموم موثر بر پستانداران ()Mammalian toxins
2.
سموم موثر بر حشرات ()Insect toxins
3.
سموم موثر بر سخت پوستان()Crustaceous toxins
در خانواده بوتیده که مهمترین عقربهای سمی دنیا در این خانواده قرار دارند ، تاکنون دو گروه اصلی
از توکسین ها پیدا شده اند:
1-پپتیدهایی که حاوی 07-16 اسید آمینه هستند (سموم موثر بر کانالهای سدیمی).
2-پپتیدهایی که حاوی 93-63 اسید آمینه هستند (سموم موثر بر کانالهای پتاسیمی).
22
23.
از لحاظ تاثیر بر روی نوع کانالها ، می توان سموم پپتیدی عقرب به 4 گروه عمده تقسیم
کرد:
1)پپتیدهایی با 07-06 اسید آمینه که دارای 4 پیوند دی سولفیدی هستند و بر روی کانالهای
سدیمی تاثیر می گذارند(سموم αو سموم.)β
سموم αباعث آهسته تر شدن روند غیر فعال سازی کانالهای سدیمی می شوند. این
توکسینها بر روی کانالها ی سدیمی تاثیر می گذارند و سبب :
الف) غیر فعال شدن جزیی کانال سدیم در حالت باز (طوالنی شدن پتانسیل عمل) و
افزایش ورود یون سدیم به داخل سلول می شوند.
ب) باعث تغییر کینتیک جریان ورود یون سدیم می شوند.
سموم βعقرب 06-56 اسید آمینه با چهار باند دی سولفیدی دارند. این سموم باعث
تغییر وابستگی به ولتاژ فعالسازی کانالهای سدیمی (شیفت منفی) و کاهش دا منه پیک
جریان سدیمی می شوند
32
24. 2)گروه دوم شامل دو زیر گروه یکی با زنجیره کوتاه 04-03 و دیگری با زنجیره بلند 46-06 اسید آمینه با 3تا
4 پیوند دی سولفیدی است که کانالهای پتاسیمی را مهار می کنند (سموم .)βاین سموم باعث تغییر
فعالیت وابسته به ولتاژ کانال به سمت هیپر پالریزاسیون می شوند.
3)گروه سوم سموم پپتیدی ، بیشتر دارای 04-63 اسید آمینه با 4 پیوند دی سولفیدی هستند که می توانند
کانالهای کلری را مهار می کنند.
4)گروه 4 سموم عقرب ، پپتیدی موثر بر کانالهای کلسیمی حساس به رایونودین
( )Ryanodine- sensitive ca+2 channelsهستند که ساختمان دقیق آنها تاکنون شناسائی
نشده است.
42
25. کانال های سدیمی
کانال های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ مسئول ایجاد پتانسیل عمل در سلولهای
تحریک پذیر مثل سلول های ماهیچه های اسکلتی ، اعصاب و سلول های قلبی هستند. کانال
های سدیمی پروتئین های سرتاسری غشایی هستند که مسئول نفوذ پذیری وابسته به ولتاژ
سدیم هستند که پتانسیل عمل را آغاز می کند. کانال های سدیم از یک زیر واحد آلفا سازنده
ی منفذ با وزن ملکولی 260 KDبه همراه 2 یا 3 زیر واحد کمکی 1 β3, β2,βتشکیل شده
اند.
زیر واحد آلفا از 4 ناحیه مشابه )(I-IVتشکیل شده است که هر کدام دارای 6 قطعه
سرتاسری غشایی )6(S1-Sو یک قطعه داخل شونده (2 )SS1/SSمی باشند که با لوپ
های پلی پپتیدی داخلی و خارجی ارتباط دارند.
نروتوکسین هایی که بر روی کانال های سدیمی عمل می کنند ، توکسین هایی زنجیره بلند با
67-06 توالی اسید آمینه و چهار پیوند دی سولفیدی درون زنجیره ای می باشند. این توکسین
ها به سه دسته آلفاتوکسین ها ، بتاتوکسین ها و گاماتوکسین ها تقسیم می شوند.
52
27. انواع نروکسین های اثر کننده بر کانال های سدیمی
آلفا توکسین ها
آلفا توکسین ها ، توکسین های پلی پپتیدی هستند که هر کدام از 07-06 توالی اسید آمینه با 4 پیوند
دی سولفیدی تشکیل شده اند.
آلفا توکسین ها را می توان بر حسب اثر بر روی موجودات به چهار گروه تقسیم کرد:
1- آلفا توکسین های کالسیک ، که برای پستانداران خیلی اختصاص ی هستند.
2- آلفا توکسین های حشرات ، که بر روی حشرات اثر دارند.
3- شبه آلفا توکسین ها ، که بر روی هر دوی پستانداران و حشرات عمل
می کنند.
4- آلفا توکسین های بینابینی، که هم بر روی حشرات و هم بر روی پستانداران موثر هستند اما اثر آنها
بر روی پستانداران بیشتر است
72
28. بتا توکسین ها
بتا توکسین ها پلی پپتیدی هایی با 56-06 توالی اس ی آمینه می باشند که مستقل از پتانسیل غشا، به
گیرنده نوع 4 کانال های سدیمی متصل می شوند و بر فعال شدن این کانال ها تاثیر می گذارند. بتا
توکسین های عقرب ، هم تغییر در وابستگی ولتاژی فعال شدن کانال سدیم در هیپرپالریزه شدن
مستقیم و هم کاهش دامنه جریان سدیم را القا می کنند.
از میان بتاتوکسین ها دوگروه مجزای توکسین های تحریکی و تضعیفی به حشرات اختصاص دارند.
توکسین های تحریکی سبب یک فلجی سریع در حیوانات و القا تحریک مکرر اعصاب در حشرات می
شوند. که همراه با کمی افزایش در هدایت سدیم و کند شدن روند غیر فعالسازی کانال سدیم می
باشد.
توکسین های تضعیفی سبب بلوک پتانسیل عمل های منتقل شده می شود و یک فلجی ضعیف
ناش ی از دپالریزاسیون غشای عصبی و توقف انتقال سدیم در آکسون ها ایجاد می کند
82
29. گاما توکسین ها
گاما توکسین ها ، در عقرب برزیلی تیتیوس سروالتوس یافت شده است و هر دوی این عملکردها
دارا می باشند ، یعنی باز شدن و بسته شدن کانال های سدیمی را مهار می کنند.
92
30. عملکرد نروتوکسین های سم عقرب
عملکرد آلفا توکسین ها:
آلفا توکسین ها ی عقرب به گیرنده نوع 3 در کانال های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ متصل
می شوند . این محل اتصال در لوپ خارج سلولی بین قطعات 3 Sو 4 Sدر ناحیه IVکانال های
سدیمی قرار دارد. این محل گیرنده با محل گیرنده توکسین های شقایق دریایی و توکسین های
عنکبوت فانل وب مشترک است. نکته مشترک بین این توکسین ها این است که سبب کند شدن
روند غیرفعال سازی در کانال های سدیمی و در نتیجه طوالنی شدن پتانسیل عمل می شوند. از
نظرمکانیکی روند غیر فعال شدن کانال سدیم عمدتا از جفت شدن وابسته به ولتاژ روند فعال
شدن توسط حس گرهای ولتاژی (قطعات 4)Sحاصل می گردد.
03
31. عملکرد بتا توکسین ها
بتا توکسین ها معموال در گونه های عقرب دنیای جدید (مانند سنتروروئیدس و تیتیوس) یافت شده
، و سبب ممانعت و یا تاخیر در باز شدن کانال های سدیمی و در نتیجه مهار هدایت عصبی می
گردند.
بتاتوکسین ها سبب یک تغییر منفی در وابستگی ولتاژی فعال شدن می شوند و دامنه ی جریان برای
کانال های سدیمی مغز و ایزوفرم های ماهیچه اسکلتی را کاهش می دهند.
13
32. کاربردهای درمانی سم عقرب
علی رغم آثار زیان بار سم عقرب در بدن از سال 0791 میالدی به بعد که محققان موفق به خالص
سازی توکسین های موجود در سم عقرب شدند و شناسایی مکانیسم مولکولی آنها انجام گرفت امید
استفاده از این توکسین ها برای درمان سرطان مغز و اعصاب هر روز بیشتر می شود.
با تزریق مستقیم نوعی از این توکسین ها همراه با رادیوتراپی ، تعدادی از بیماران مبتال به سرطان مغز
مورد مداوا قرار داده اند. این توکسین ها به سلول های سرطانی حمله کرده و در آن ها ایجاد چسبندگی
می نمایند. همین امر باعث می گردد سلول های سرطانی قدرت پخش شدن بیشتر را نداشته باشند و لذا
رادیوتراپی برای کشتن سلول های سرطانی آسانتر می گردد ، در حالی که به سلول های سا لم صدمه ای
وارد نمی گردد.
در کشور کوبا داروی ضد سرطانی را از سم عقرب به نام اسکوزول تهیه نموده اند. این دارو نه تنها برای
درمان سرطان مورد استفاده قرار می گیرد ، بلکه به صورت خوراکی برای درمان بیماری های دیگر مانند
بیماری پارکینسون ، مشکالت کلیوی و التهاب لگن خاصره نیز به کار می رود. با اینکه سم عقرب برای
انسان خطرناک می باشد ، اما ظاهرا این دارو در غلظت مورد استفاده خطرناک نیست و آن را به
صورت خوراکی تجویز می کنند.
23
33.
دانشمندان در مجله آکادمی ملی آمریکا مدعی شده اند که در سم عقرب موادی وجود دارد که
قابلیت سرکوب سیستم ایمنی مربوط به سلول های Tرا دارا بوده و به همین دلیل احتمال
استفاده از آن ها برای بیمارانی که پیوند عضو در آن ها صورت می گیرد وجود دارد.
همچنین بعض ی از محققین در دانشگاه کالیفرنیا معتقد هستند که سم عقرب ممکن است بتواند
است بتواند به عنوان دارویی بر علیه بیماری هایی مانند سل جلدی ، مولتی پل اسکلروسیز ()MS
33
34. OD1 اولین سم شبه آلفا جدا شده از زهر عقرب ایرانی موثر بر روی کانالهای سدیم
وابسته به ولتاژ)VGSCS
) پستانداران و حشرات می باشد. میزان بازیافت این سم از
زهر در حدود تنها 2% می باشد. با استفاده از تکنیک ولتاژ – کالمپ دوالکترودی ،
اثرات این سم بر روی سه کانال سدیمی )( 1.2/ β1 ، 1 NAV.β1 /5،PARA/TIPE
NAVبیان شده بر روی اووسیت قورباغه) ) Xenopus laevis oocytesمطالعه
شد. توانست پروسه غیر فعالسازی کانال حشره para/tipeرا به میزان زیادی مهار
نماید ( .)EC50= 80 ±14 nMدر حالیکه بر روی کانال سدیمی 5.1 Navتنها در
غلظتهای میکروموالر موثر بود و بر روی کانال سدیمی مغزی 2.1 Navتاثیری
نداشت(3). در مطالعه دیگر ، مشخص شد که این سم می تواند باعث آهسته و طوالنی
شدن پروسه غیر فعالسازی و افزایش میانگین Open-stateکانال 7.1 Navشود. به
همین دلیل این سم از معدود سموم طبیعی موثر بر روی این کانال است که دارای اثرات
اختصاصی بر روی درد مزمن ، و درد های التهابی و همچنین شرایط پاتولوژیک مانند
سرطان پروستات می باشد.
43
35. افزایش ورود یون سدیم توسط 1 ODمی تواند منجر به
دپالریزاسیون غشاء ) (in vivoباقیمانده کانالهای 7.1 Navدر
حالت غیر فعال و از دست رفتن تحریک پذیری الکتریکی
نرونهای ادراک کننده درد )(Nociceptorو احساس بی دردی
) (Neuroligicمی شود. باتوجه به اینکه 1 ( ODبا بازیافت کم
تنها 2% از زهر) یک پروب فارماکولوژیک و فیزیولوژیک
اختصاصی موثر بر روی کانالهای خاص خصوصا سدیمی
پستانداران 7.1 Navو حشرات para/tipEشناخته شده است
و همچنین بسیاری از اعمال بدن توسط کانالهای سدیمی
میانجیگری می شود، اهمیت دسترسی به مقادیر مناسب این سم
برای ادامه بررسی ها معلوم می شود..
53
39. مقایسه ترتیب اسید آمینه 1 ODبا سموم عقرب مشابه:
مقایسه ساختمان اولیه تعدادي از سموم آلفا، شبه آلفا و سموم حشرات عقرب با 1 ODانجام
شده است. 61 آمینه اسید در موقعیت مشابه 1 ODبا بقیه سموم تكرار شده است. ترتیب
هاي اسید آمینه بر اساس اسید آمینه سیستئین ( )Cتراز شده است.
آلفا، شبه آلفا و سموم حشرات تقسیم شده اند .
ترتیب 1 ODبا استفاده از وب سایت ( (http://www.ebi.ac.uk/clustalو
برنامه ClustalWبا سایر سكونس ها تراز و مقایسه شد. سموم ( LqqIVسم آلفا
از Leiurus quinquestriatusبا 29% تشابه)، ( LqhIVسم آلفا از Leiurus
quinquestriatus hebreausبا %19 تشابه)، ( BjαITیك سم حشره آلفا از
Buthus judaicusبا 97% تشابه) و 2 ( BmK M1/BmK Mیك سم شبه آلفا از
Buthus martensii Karschبا 57% تشابه) و( LqhαITیك سم شبه آلفا
از Leirus quinquestriatus hebreausبا 37% تشابه ) حداكثر تشابه با ترتیب
اسید امینه 1 ODرا دارد.
93
40. مقایسه ترتیب اسید آمینه 1 ODبا سموم مشابه است. در سمت راست، درصد مشابهت اسید
آمینه سم با 1 ODبر حسب درصد آمده است. ساختمان ثانویه در قسمت باالي سموم آمده
است ( (*) .)B= β-sheet, T= turn, H= α-helixنشاندهنده اسید آمینه هائي است كه در
تمام سموم حفظ شده است
04
41. به بيان برخي تفاوتهاي موجود در ساختمان شبه آلفا 1 ODدر مقايسه با برخي سموم
شناخته شده:
-1 اسيدهاي آمينه آروماتيك 1(Tyr5, Tyr14, Tyr21, Tyr35, ( BmK M
74 )Trp38, Tyr42 and Trpهمانند 1 ODمي باشد.
-2 جايگزيني 8 Lysبا Aspدر 1( BmK Mكه در 1 ODوجود دارد) مانند سموم كالسيك
آلفا توكسین 2 Lqh2 ،AaHو 5 Lqqباعث كاهش چشمگیر در ميل اتصالي با كانالهاي
سديم حشرات شده است در حاليكه در 1 ODاين چنین نيست.
-3 اسيد هاي آمينه بازي 26-85 در ناحيه )58-64( C-terminusشديدا بر ميل اتصالي
1 BmK Mبر تمام كانالها از جمله حشرات تاثیر دارد. جابجائي هيستدين (5.0+) با آرژنین
(1+) در موقعيت 46 در ترتيب اسيد آمينه 1 ODبايستي مورد توجه قرار گیرد. جالب آنكه
ناحيه 1 C-terminus ODعلیرغم دارا بودن اثر قوي بر كانال حشرات، شباهت تام با
سموم كم اثر بر حشرات 4 Lqqو 4 Lqhدارد.
14
42. -4 جایگزیني موقعیت 46 (اغلب هیستیدین (5.0+) در سموم شبه آلفا) با اسید
آمینه فاقد بار آالنین در 1 BmK Mسبب كاهش اتصال با كانالهاي حشرات شده
است. در توافق با مطلب باال مي بایست ببینیم كه آیا جایگزیني هیتیدین با آرژنین
(1+) در 1 ODفعالیت آنرا بر روي كانال حشرات حفظ خواهد كرد؟. اگر چه
4 Lqqو4 Lqhبا فعالیت اندك بر حشره داراي آرژنین در موقعیت 46 هستند. به
نظر میرسد كه این موقعیت نقش مهمي در اتصال به كانالهاي حشرات نداشته باشد.
5-اسید هاي آمینه 1 ODدر سطح هیدروفوبیك مانند 5 Tyrو اطراف آن 35 Asp
(نزدیك به این سطح و نیز اسید هاي آمینه )N-terminalو 12 Tyrو 82 Lysدر
سطح ( Bدر آلفا-هلیكس 82-91 در مقابل سطح هیدروفوبیك قرار دارد) مشابه
سموم شبه آلفا است. با توجه به جایگزیني K28Eكه منجر به كاهش اتصال كانالهاي
سدیم ماهیچه و حشرات مي شود، میتوان حدس زد كه فعالیت اتصالي 1 ODبیش از
سموم 7 Lqhو 3 Lqhباشد.
24
43. -6 موتاسیون K8/Dدر ( LqhαITكه در 1 ODو 1 BmK Mوجود دارد) سبب تاثیر
باالئي بر محل اتصال كانال حشرات و تغییر در ساختمان ثانویه ( LqhαITشاید به دلیل
تغییر بار در این محل) شده است (فعالیت 1 ODبر روي كانال حشرات میتواند با دو سم
مقایسه شود).
-7 جایگزیني R/Aدر موقعیت 81 LqhαITتایید كننده اثر بار در فعالیت سموم بوده است
(87% فعالیت بر روي كانال حشرات حفظ گردید). R/Aدر1 ODوجود دارد. با بررسي
اثر 1 ODبر كانال حشرات میتوان اثر موقعیت 81 داراي بار بر فعالیت سم بررسي شود.
خالصه اینكه به نظر میرسد كه سم شبه آلفا 1 ODداراي تفاوتهاي تقریبا باالئي از لحاظ
ساختمان اولیه و در نتیجه ساختمان ثانویه با سایر سموم شبه آلفا دارد. شاید مطالعات
موتاژنز بر روي این سم میتواند نقاط و نواحي دیگر مهم دیگر موجود در سموم شبه آلفا كه
نقش آنها در اعمال سموم شبه آلفا داراي اهمیت بیشتر و یا ناشناخته مانده باشد، روشن
نماید.
34
47. آنزیم های مورد استفاده شده:
مارکر
مارکر )1/0μg/μl( 50bpکه محصول شرکت Fermentaseبود، در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت
74
48. طرز تهیه ی محلول ها و بافر های مورد استفاده:
آب تیمار شده با DEPC
DEPCیک عامل بسیار قوی در غیر فعال سازی آنزیم RNaseاز طریق تشکیل گروه های هیستیدیل می باشد. بسته
به حجم آب مقطر، به میزان 0/1درصد DEPCبه آب افزوده می شود. سپس ظرف آب به شدت تکان داده می شود تا
DEPCکامال در آب توزیع شود. پس از قرار گرفتن ظرف به مدت 21 ساعت در دمای اتاق، به منظور غیر فعال
کردن DEPCبه مدت 51 دقیقه اتوکالو می شود.
بافر )10X(TBE
801 گرم از تریس، 55 گرم بورات و 9/3 گرم از EDTAرا بعد از توزین در یک لیتر آب مقطر حل
کرده و بعد در مواقع نیاز از 10Xبه مقدار 1Xرقیق می شود و در تانک الکترو فورز استفاده
می شود.
84
49.
ژل آگارز 1/5 درصد
73/. گرم آگارز در 52 میلی لیتر از بافر 1X TBEحل شده و استفاده می شود.
محلول رنگ اتیدیوم بروماید ))10 mg/ml
01 میلی گرم اتیدیوم بروماید را با 1 میلی لیتر آب مقطر مخلوط کرده و در زیر هود و
قرار داده و پس از حل شدن کامل، محلول در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری می
بافر بار گذاری ()6X
در این تحقیق از بافر بار گذاری ( )6Xکه محصول شرکت Fermentaseبود استفاده شد.
این بافر حاوی )6.7 %03/0 ،10 mM Tris-HCl(pHبرومو فنول بلو، 0/30% زایلن
سیانول %60،FFگلیسرول و EDTA 60mMمی باشد.
94
50. روش ها:
نمونه گیری
محل نمونه گیری به خوبی توسط الکل ضد عفونی شد و پنس و قیچی های مورد استفاده به همراه نوک سمپلر ها و
میکروتیوب های حجم های مختلف دوبار اتوکالو گردید. نمونه های عقرب ادنتوبوتوس دوریه از بخش جانوران
سمی موسسه رازی کرج تهیه شد. غدد زهری عقربها با استفاده از پنس و قیچی استریل جدا شده و جهت فریز کردن
و آسان تر شدن عمل له کردن، نمونه ها در نیتروژن مایع قرار داده شد، سپس با استفاده از مورتار و پیستل
نمونه ها له گردید.
استخراج RNA
استخراج RNAبا استفاده از کیت استخراج ) Total RNA (QIAGENصورت گرفت.
مشکل RNaseها؟
05
51. مراحل استخراج Totol RNAاز غده ی سمی عقرب 1OD
1- به اندازه ی 03 میلی گرم از بافت تازه حیوانی جدا شد( نباید بیش از 03 میلی گرم باشد). سپس در میکروتیوب مناسب
قرار داده شد.
وزن میکروتیوب خالی: 0.93 g
وزن میکروتیوب + بافت: 0.95 g
2- بافت را به وسیله مورتار و پیستل کامال له کرده و به آن 600 μlاز بافر RTLاضافه شد.
3- بافت به خوبی له شده و به همراه بافر اضافه شده خوب مخلوط شد به طوری که کامال یکنواخت گردید.
این کار روی یخ و در کمترین زمان ممکن انجام شد تا RNaseها فعال نشوند.
4- مخلوط به دست آمده یا lysateبه مدت 3 دقیقه و با بیشترین سرعت سانتریفوژ شد.
5- محلول رویی با استفاده از پیپت به دقت به یک تیوب سانتریفوژ جدید منتقل گردید. دقت شد که همراه محلول رویی
چیزی وارد نوک سمپلر نشود.
6- به اندازه ی حجم محلول رویی به آن اتانول 07% اضافه شد. حجم آن بین 350-600lμبود. حجم اتانول به حجم محلول
رویی بستگی دارد. در این مرحله نباید از سانتریفوژ استفاده شود و مخلوط کردن فقط از طریق چند بار پیپت کردن انجام
شد.
15
52.
6- به اندازه ی حجم محلول رویی به آن اتانول 07% اضافه شد. حجم آن بین 350-600lμبود. حجم
اتانول به حجم محلول رویی بستگی دارد. در این مرحله نباید از سانتریفوژ استفاده شود و مخلوط کردن
فقط از طریق چند بار پیپت کردن انجام شد.
7- از مخلوط به دست آمده به اندازه ی 700lμیا بیشتر برداشته و در یک ستون ریخته شد. ستون در
یک تیوب 2 میلی لیتری قرار گرفت. در ستون محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش از
10000rpmسانتریفوژ شد. این مخلوط با خود رسوباتی به همراه داشت.
8- محلول خارج شده از ستون پس از سانتریفوژ دور ریخته شد.از همان تیوب 2 میلی لیتر برای مرحله
ی بعد استفاده شد که در زیر ستون قرار داده شد.
9- 700lμاز بافر 1RWبه ستون اضافه شد. در آن محکم بسته شده به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش از
10000 rpmسانتریفوژ شد.
01- محلول خارج شده از ستون دور ریخته شد. از تیوب 2 میلی لیتری برای مرحله ی بعد استفاده
گردید.
11- 500lμاز با فر RPEبه ستون اضافه شد، در آن محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش
از 10000 rpmسانتریفوژ شد.
25
53.
7- از مخلوط به دست آمده به اندازه ی 700lμیا بیشتر برداشته و در یک ستون ریخته شد. ستون در
یک تیوب 2 میلی لیتری قرار گرفت. در ستون محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش از
10000rpmسانتریفوژ شد. این مخلوط با خود رسوباتی به همراه داشت.
8- محلول خارج شده از ستون پس از سانتریفوژ دور ریخته شد.از همان تیوب 2 میلی لیتر برای
مرحله ی بعد استفاده شد که در زیر ستون قرار داده شد.
9- 700lμاز بافر 1RWبه ستون اضافه شد. در آن محکم بسته شده به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش
از 10000 rpmسانتریفوژ شد.
01- محلول خارج شده از ستون دور ریخته شد. از تیوب 2 میلی لیتری برای مرحله ی بعد استفاده
گردید.
11- 500lμاز با فر RPEبه ستون اضافه شد، در آن محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت
بیش از 10000 rpmسانتریفوژ شد.
21- محلول خارج شده از ستون دور ریخته شد. از تیوب 2 میلی لیتری برای مرحله ی بعد استفاده
35
54.
31- مجددا ً 500lμاز بافر RPEبه ستون اضافه شده مرحله ی قبل تکرار شد.ولی مدت سانتریفوژ
به 2 دقیقه افزایش داده شد.
41- در این مرحله ستون از تیوب زیر آن به آرا می بر داشته شد و دقت گردید که با محلول درون
آن که حاوی اتانول است برخورد نکند.
51- ستون درون یک تیوب جدید 2 میلی لیتری قرار گرفت. در آن محکم بسته شده و به مدت 1
دقیقه با آخرین دور سانتریفوژ شد.( این مرحله برای اطمینان از خروج بافر های مراحل قبل از
ستون انجام گردید.)
61- ستون را درون یک تیوب 5-1 میلی لیتری جدید قرار داده و به اندازه ی 30-50lμآب بدون
RNaseبه ستون مستقیما ً اضافه گردید. در ستون محکم بسته شده و به مدت یک دقیقه با سرعت
10000 rpmسانتریفوژ گردید.( برای Eluteکردن .)RNA
45
55. تهیه cDNA
الگوی RNAمی تواند به عنوان هدف در تکنیک RT-PCRبه کار گرفته شود به شرطی که RNAی استخراج
شده با استفاده از آنزیم ترا نس کریپتاز معکوس به cDNAتبدیل گردد.
پارامترهای سنتز cDNA
55
56. مراحل سنتز cDNAاز :Total RNA
1- RNAی الگو پس از در آوردن از فریزر 07- درجه ی سانتی گراد روی یخ قرار داده شد.
محلول پرایمر ،بافر ،RTمخلوط dNTPو آب بدون RNaseدر دمای اتاق قرار داده شد. (بهتر
است این کارروی یخ انجام شود. )
2- RNase Inhibitorبا استفاده از بافر )1x( RTرقیق شد به طوری که غلظت نهایی آن
10 Unit/mlگردید. خود بافر RTبا استفاده از آب بدون RNaseبه صورت ( )1xرقیق شد.
محلول رقیق شده ی RNase Inhibitorبا Vortexبه مدت کمتر از 5 ثانیه مخلوط شد. و به
مدت کمتر از یک دقیقه سانتریفوژ گردید.
3- یک Master mixمطابق جدول 2-3 تهیه گردید. به وسیله ی Vortexمیکس حاصل
مخلوط گردیده و به مدت کمتر از یک دقیقه سانتریفوژ شده وروی یخ قرار داده شد.
4- RNAی الگو به میکس مورد نظر اضافه گردید.( Vortexکمتر از 5ثانیه و سانتریفوژ کمتر
از یک دقیقه انجام شد).
5- به مدت یک ساعت در دمای 73درجه سانتیگراد قرار گرفت.
65
57. تکثیر ژن 1 ODتوسط واکنش PCR
)(polymerase chain reaction
تکنیک PCRدر اواسط دهه 0891 بوسیله کری مولیس معرفی شد. PCRاز نظر اصول علمی شباهت زیادی به
همانند سازی DNAدارد و در واقع برگرفته از آن است. PCRروش ی حساس ، انتخابی و بسیار سریع برای
ازدیاد یک توالی مورد نظر DNAمی باشد. ترکیبات ضروری برای انجام یک واکنش PCRشامل مولکول های
DNAالگو ، آغازگرها ، DNAپلیمر از مقاوم به حرارت و dNTPمی باشد. مخلوط واکنش طی واکنش PCR
به سرعت درون دستگاه ترموسایکلر سرد و گرم می گردد و در مدت کوتاهی تعداد زیادی از DNAالگو فراهم می
شود. در واکنش PCRدو رشته DNAدر دمای 59 درجه سانتیگراد از هم باز شده و در دمای 56-05 درجه
سانتیگراد آغازگرها به نواحی مکمل متصل شده و در دمای 27 درجه سانتیگراد فرایند سنتز صورت می گیرد. زمان
و درجه حرارت دو پارامتر مهم در PCRمی باشند. آغازگر ها طوری طراحی می شوند که مکمل دو طرف توالی هدف
خاص در DNAالگو باشند.
-kary mullis
2
-amplification
3
-primer
4
75
58. آغازگرها طولی حدود 17-24 bpدارند. دو آغازگر رفت و برگشت نباید مکمل باشند زیرا در طی مراحل
PCRتشکیل پرایمر – دایمر می دهند و واکنش PCRبه خوبی صورت نمی گیرد. دو آغازگر باید دمای ذوب ( )Tmنزدیک به هم
داشته باشند (6). Tmبه ترکیب بازی الیگونوکلئوتید و تعداد بازها بستگی دارد. جهت محاسبه Tmبرای آغازگرهای با طول بیشتر
از 02 نوکلئوتید ، از فرمول زیر استفاده می شود(8):
طول آغازگر /005-)Tm= 63/20c + 0/410c (0/0G+C
دمای اتصال هر آغازگر 5-2 درجه کمتر از دمای ذوب آن می باشد هر چه دمای اتصال آغازگرها زیادتر باشد اختصاص ی بودن
اتصال آنها به توالی مورد نظر بیشتر می شود و هر چه دمای اتصال کمتر شود اتصال آغازگرها به نواحی مکمل غیر اختصاص ی
بیشتر شده و محصوالت ناخواسته افزایش می یابد. در هر چرخه از واکنش PCRمحصوالت چرخه قبل به عنوان الگو استفاده
می شود.
به طوری که هر چه تعداد چرخه بیشتر باشد محصوالت بیشتری بدست می آید . اما باید توجه داشت که تعداد زیاد چرخه ها باعث
ایجاد محصوالت غیر اختصاص ی شده و در نتیجه در پایان باندهای کاذب دیده می شود . جهت انجام واکنش PCRباید از DNA
پلیمراز مقاوم به گرما استفاده شود، چراکه در غیر این صورت ، این آنزیم طی هر چرخه دناتوره شدن با گرما ، تخریب می گردد
1-melting temperature
85
60. شرایط دمایی واکنش :PCR
در واکنش PCRسه دمای مختلف به کار می روند. ابتدا دمای واسرشت سازی که
حدود 59-29 درجه سانتی گراد می باشد،که برای جدا شدن دو رشته DNAبه
کار می رود. با توجه به خصوصیت DNAالگو، دما و زمان تا حد امکان کم می
باشد، به منظور بهتر باز شدن دو رشته DNAقبل از شروع سنتز به مدت
3 دقیقه و در چرخه های بعد به مدت 03 ثانیه در 49 درجه سانتی گراد قرار داده شد.
دمای دوم که به آن دمای اتصال می گویند، حدود 06-73 درجه سانتی گراد می
باشد.
هر آغازگر دمای اتصال ویزه ای دارد. در این دما آغازگرها می توانند به طور
اختصاصی به توالی مکمل مورد نظر در DNAالگو متصل شوند .دمای سوم دمای
گسترش است که حدود 27-76 درجه سانتی گراد برای آنزیم های DNAپلیمراز
می باشد.
1-Denaturation
2-Annealing
3-Extension
06
61. الکتروفورز
به منظور بررس ی محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز، 01 میکرولیتر از نمونه با 02 میکرولیتر بافر
بارگذاری 6Xمخلوط و به چاهک های ژل آگارز 1/5 درصد حاوی بافر TBEاضافه شد و با ولتاژ
ثابت 58 به مدت 03 دقیقه الکتروفورز گردید، سپس ژل در محلول 5/ . میکروگرم در میلی لیتر
اتیدیوم بروماید( )10mg/mlبه مدت 02 دقیقه قرار داده شد و سپس رنگ آمیزی گردید و با
استفاده از دستگاه ژل داک عکسبرداری شد.
.
16
62. استخراج RNA
با استفاده از کیت استخراج ، RNAاز نمونهها جداسازی شد. RNAاستخراجی در یخچال 07- درجه
سانتیگراد نگهداری و سپس از این RNAهای استخراج شده، cDNAسنتز گردید.
تکثیر ژن 1 ODبا استفاده از تکنیک RT-PCR
تهیه cDNA
با استفاده از آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (فرمنتاز) و آغازگر ،Fنمونههای RNAاستخراج شده به cDNA
تبدیل شدند.
طراحی آغازگرها
برای این منظور ابتدا توالیهای مربوط به ژنهای کد کنندة نرو توکسینهای مشابه که قبالً در عقربهای
این خانواده شناسایی شده و در بانک ژن ( )NCBIموجودند، با استفاده از نرم افزار Blast:homology
searchبا یکدیگر مقایسه شدند. پس از بررسیهای متعدد، بیشترین تشابه در مورد ژنهای کد کنندة
نروتوکسینهای متعلق به عقربهای آندروکتونوس استرالیس و مزوبوتوس مارتنزی مشاهده شد. برای
طراحی آغازگرها از توالیهای یکسان و حفظ شده در نواحی مشابه که در ابتدا و انتها به ترتیب حاوی
کدون شروع ( )ATGو کدون خاتمه ( )TGAبودند، استفاده گردید. همچنین در ادامه، تشابه توالی
اسیدآمینههای نروتوکسینهای این گونهها با استفاده از نرم افزار Blast-primer Designبررسی و
مقایسه شده و نواحی مشابه مجددا ً برای طراحی توالی آغازگرها مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت
آغازگرها به صورت Degeneratet primer
طراحی شدند.
26
63. (A)- Alignment of Amino acid sequence of OD1 Toxin with other toxins in the
gene bank NCBI.
The nomers indicate the accession number of Amino acid sequences according
the NCBI.
1NH5_A
2 DGYPVDSKGCKLSCVA.[1].NYCDNQCKM.[1].KASGGHCYAMS
CYCEGLPENA 49
OD1
4 DAYIADDKNCVYTCAS.[1].GYCNTECTK.[1].GAESGYCQWIG.[5].CWCIKLPDEV 65
gi 20140244 22 DAYIAKPHNCVYECAR.[1].EYCNDLCTK.[1].GAKSGYCQWVG.[5].CWCKELPDNV 74
1OMY_A
4 DAYIAQNYNCVYHCAR.[1].AYCNELCTK.[1].GAKSGSCPYLG.[5].CYCKDLPDNV 56
1LQH
4 DAYIAKNYNCVYECFR.[1].AYCNELCTK.[1].GASSGYCQWAG.[5].CWCYALPDNV 56
gi 20140302 11 DAYIAKNYNCVYHCFR.[1].DYCNGLCTE.[1].GADSGYCYLAG.[5].CWCINLPDDK 63
gi 134376
3 DAYIADDRNCVYTCAL.[1].PYCDSECKK.[1].GADGSYCQWLG.[5].CWCKNLPDDV 55
gi 134373
3 DGYIADDKDCAYFCGR.[1].AYCDEECKK
gi 134365
3 DGYIVDDKNCTFFCGR.[1].AYCNDECKK.[1].GGESGYCQWAS.[5].CWCYKLPDRV 55
GAESGKCWYAG.[5].CWCYKLPDWV 54
gi 20140304 22 DGYIADDRNCPYFCGR.[1].AYCDGECKK.[1].RAESGYCQWAS.[5].CWCYKLPDDA74
(B)- DNA SEQUENCE OF THE OD1 TOXIN FROM THE AMINO
ACID SEQUENCE MADE BY THE SOFTWARE OLIGOS:
GGNGTNCGNGAYGCNTAYATHGCNGAYGAYAARAAYTGYGTNTAYACNTGYGC
NTCNAAYGGNTAYTGYAAYACNGARTGYACNAARAAYGGNGCNGARTCNGG
NTAYTGYCARTGGATHGGNCGNTAYGGNAAYGCNTGYTGGTGYATHAARCT
NCCNGAYGARGTNCCNATHCGNATHCCNGGNAARTGYCGN (195 BP)
63
64. )C(-PRIMER SEQUENCES:
OD1-VF: 5- TNCGNGAYGCNTAYATHGCNGAYGAY-3
OD1-VR: 5- AYTTNCCNGGDATNCGDATNGGN-3
(D)- Degenerate alphabet used by CODEHOP:
A
A
C
C
G
G
T
T
AG
R
CT
Y
AC
M
GT
K
AT
W
CG
S
CGT
B
AGT
D
ACT
H
ACG
V
ACGT
N
بر اساس سکونس های اسید آمینهOD1 )- سکونس های سمB( با سموم همولوگOD1 (– مقایسه اسید آمینه های سمA):
)- پرایمرهای طراحی شدهC( ها
64
65. تفسیر نتایج
نتیجه ای که از گرادیان دمایی PCRحاصل شد مطابق شکل 1 در دو دمای 65 و85 درجه فقط اسمیر مشاهده
شد، به منظور اصالح و بهینه سازی PCRاز همین محصوالت به عنوان Templateاستفاده شد و مجددا
RePCRگذاشته شد. شرایط گرادیان دمایی مورد استفاده جهت بهینه سازی PCRبرای تکثیر ژن 1OD
مطابق شرایط مندرج در جدول زیر اجرا گردید.
56
66.
و طبق عکس شماره 2 در دو دمای 65و85 درجه عالوه بر باند مورد نظر چندین باند کاذب دیگر نیز مشاهده شد. به
همین منظور باند مورد نظر از روی ژل الکتروفورز cutشده و با استفاه از کیت تخلیص، از ژل خالص سازی شد و
سپس مجددا با این محصوالت تخلیص شده PCRانجام شد و نتیجه ی نهایی عکس شماره 3 به دست آمد. البته
همانطور که در شکل نشان داده شده است، ابتدا محصول تخلیص شده به نسبت 01:1 و 5:1 با آب مقطر استریل
رقیق شد و سپس در PCRاستفاده گردید، اما چون محصول PCRباند ضعیفی داد، مجددآ و بدون رقیق کردن
با حجم های 1و2 و3 و4 و5 و6 میکرو لیتر از محصول تخلیص شده PCRتکرار شد و طبق شکل مشاهده شد که
باندها به تدریج پررنگ تر و قوی تر شده، به طوری که در حجم 6 میکرو لیتر باند کامال مطلوبی به دست آمد.الزم به
ذکر است که PCRهای نهایی طبق شرایط دمایی که در جدول زیر آمده است.
66
68. برای بررسی مکانیسم اثر زهر عقرب ایرانی Odonthobuthus doriaeتاکنون 3 سم پلی پپتیدی
از زهر این عقرب جداسازی، شناسایی و اثرات فارماکولوژیک و الکتروفیزیولوژی آن بررسی شده
است. در بررسی زهر این عقرب نیز مشخص شد که زهر این عقرب دارای اثرات پیش سیناپسی
عصبی- عضال نی است که منجر به آزادسازی نروترانسمیترها مخصوصا ً استیل کولین در پایانه
های عصبی است.
اولین سم جداسازی شده از این عقرب 1 ODنامگذاری شد.مشخصات و خصوصیات این سم در بانک
اطالعاتی Swiss protبا کد 4648 Pثبت شد.تالش و پیگیری و تالیفات متعدد از این عقرب منجر
به نامگذاری اولین عقرب ایرانی شد
سم 1 ODدارای 56 اسید آمینه است و جزو سموم شبه آلفا عقرب است. سموم شبه الفا دارای اثر
مهاری بر پروسه غیر فعال سازی کانالهای سدیمی وابسته به ولتاژ ( )VGSCsهستند. این سم دارای
اثر مهاری بر روی کانال قلبی پستانداران (5.1 )Navو همچنین کانال سدیم حشرات ()para/tipE
است .از خواص مهم 1 ODاثرات مشخص و مهاری آن بر روی کانال 7 سدیمی ( 7.1)Nav
است. این کانال در پروسه درد و التهاب نقش مشخص دارد. بر همین اساس 1 ODجز معدود
ترکیبات طبیعی موثر بر روی این کانال است و به همین دلیل نقش و اهمیت آن به عنوان یک پروب
86
69. تعداد 195bpالیگونوکلئوتد برای سنتز DNAکدکننده 1 ODاستفاده شد.
طراحی این الیگو نوکلئوتیدها براساس ترتیب اسید آمینه 1 ODانجام شد.این
ترتیب نوکلئوتید با استفاده از برنامه Blast:homology searchو نرم افزار
Blast-primer Designانجام شد.سکونس های نوکلئوتید بر اساس کدون
ترجیحی برای بیان در وکتور E.coliانتخاب شدند.
این پژوهش با هدف جداسازی و تکثیر cDNAمربوط به یک نروتوکسین از
غدة زهر عقربهای متعلق به خانوادة بوتیده ،که از آزمایشگاه رفرانس عقرب
مؤسسه تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی کرج تهیه شد صورت گرفت. بدین
منظور ابتدا کل RNAبا استفاده از کیت استخراج RNAاز غده زهری
عقرب ادونتوبوتوس دوریه استخراج شد و در ادامه RNAها به cDNAتبدیل
شد و برای تکثیر ژن مربوطه در ، PCRبه عنوان الگو مورد استفاده قرار
گرفتند.
96
70. در این پژوهش، با توجه به اینکه قطعه cDNAتکثیر یافته، در محدودة مورد انتظار
( )195bpقرارگرفته بود و از آنجا که این نتیجه با تکرار واکنش مجددا ً به خوبی قابل
مشاهده بود، چنین به نظر میرسد که قطعه تکثیر یافته، همان cDNAکدکنندة نروتوکسین
هدف در غدة زهر عقرب ادونتوبوتوس دوریه باشد. نتایج بدست آمده توسط دیگر محققین
نیز میتواند گواهی بر این امر باشد. نیکخواه و همکارانش (6002) ژن کدکنندة یک
نروتوکسین به نام 1 Bsaulرا با استفاده از روش RT-PCRاز عقرب هوتنتوتا سلسئی
تکثیر کردند. قطعه cDNAتکثیر یافته توسط این محققین، 240bpطول داشت. قطعه
cDNAتکثیر یافته توسط وانگ و همکارانش (1002) نیز 200bpبود، که یک
نروتوکسین ضد صرع جدا شده از سم عقرب بوتوس مارتنزی کارش به نام BmK AEP
را کد میکند. عالوه بر این موارد، با توجه به اینکه آلفاتوکسینهای جدا شده از زهر
عقرب بوتوس مارتنزی کارش، پلیپپتیدهایی با 66-46 توالی اسیدآمینه هستند،
cDNAهای کدکنندة این نروتوکسینها در حدود 192-198bpطول دارند.
07
71.
همچنین چهار بتاتوکسین جداشده از سم این عقرب، پلیپپتیدهایی با طول 27-96 توالی اسیدآمینه
هستند که cDNAهایی با طول حدود 207-216bpخواهند داشت. زیونگ و همکارانش نیز در
سال 9991 توالی 462 جفت بازی cDNAیک نروتوکسین تحریکی اختصاصی حشرات را از
همین عقرب شناسایی کردند.
با توجه به اینکه cDNAهای مربوط به نروتوکسینهای شناسایی شده در این مطالعات همگی در
محدودة 291تا 462 جفت باز بودهاند، صحت نتیجه حاصل از پژوهش حاضر، که تکثیر cDNA
یک نروتوکسین با طول پیشبینی شدة 195bpبود، دور از انتظار نبوده است.
همچنین بنابر مطالعات مبس (2002) و گودت و همکاران (2002) آلفا توکسینها بیشتر در
گونههای عقربهای ( Old worldاز قبیل آندروکتونوس) و بتا توکسینها بیشتر در گونههای
عقربهای ( New worldاز قبیل سنتروروئیدس) یافت شدهاند و با توجه به اینکه قطعه تکثیر یافته
در پژوهش حاضر از سم عقرب ادونتوبوتوس دوریه جداسازی شده است، امکان اینکه نروتوکسین
کد شونده توسط این ،cDNAیک آلفاتوکسین باشد بیشتر است. با این وجود، تأیید قطعی اینکه آیا
cDNAتکثیر یافته همان cDNAمورد انتظار در این پژوهش بوده است یا خیر، تنها با تعیین
توالی نوکلئوتیدی آن امکان پذیر خواهد بود و به دنبال آن نیز امکان تشخیص نوع نروتوکسین
کدشونده توسط این cDNAمیسر خواهد شد.
17
72.
پیشنهادات
با توجه به نتایج بدست امده از پژوهش حاضر،پیشنهاد می شود که:
1. تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعه cDNAتکثیر یافته در این پژوهش و تعیین نوع نروتوکسین کدد شدونده توسدط
آن.
2. طراحددی و سدداخت آغازگرهددای اختصاصددیتر بدده منظددور تکثیددر cDNAمربددوط بدده نروتوکسددینهای موجددود در
سایر گونههای عقربهای خانواده بوتیده.
3. توصیه و ترغیب پژوهشگران به استفاده از تکنیدک RT-PCRبدر روی غددز زهدر سدایر عقربهدای خدانواده
بوتیده و دیگر خانوادههای عقرب ها جهت شناسایی و تکثیر ژنهای کد کننده نروتوکسینهای موجود در غددز
زهر آنها.
-4 تهیه کتابخانه ژنی از غده زهر عقربهای خانواده بوتیده.
5. با توجه به اینکه آنتدی سدرم ضدد زهدر عقربدی کده در حدال حاضدر در میسسد تحقیقدات واکسدن و سدرم سدازی
رازی تولیددد میشددود، از مجمددوع زهرخددام بدسددت آمددده و بدده صددورت پلددیواالن میباشددد، در بیمدداران بددهطور
اختصاصی عمل نمیکند و عوارض جانبی احتمالی نیز بههمراه دارد. با شناسایی ژنهای کدکنندز توکسدینهای
موجددود در غددده زهددر عقددرب ، ایددن امکددان بدسددت میآیددد تددا در آینددده در راسددتای تولیددد پددروتئین نوترکیددب، بده
منظور تولید آنتیسرم اختصاصی اقدام گردد.
27
