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Laboratorio de Reacción en cadena de la

    polimerasa PCR y ciclo de secuenciación
Dr. Giovanni González DMV, Esp, MsC

Area de Biologia Molecular



Justificación



Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser

considerados realmente como revolucionarios.



Sin embargo cuando ello ocurre, transformamos correctamente el modo en que

trabajamos y pensamos. Aunque el progreso en las diferentes ciencias parece ser

lento y su evolución resulta una letanía paso a paso, en el caso de la biología

molecular ha sucedido lo contrario. Dicha disciplina ha sido afortunada con

grandes cambios en tiempo relativamente corto. Uno de los principales cambios

tecnológicos citados ocurrió en 1985 gracias al señor Kary Mullis, con la

introducción de una de las herramientas moleculares con mayor aplicación en el

laboratorio clínico veterinario: la reacción en cadena de la polimerasa, más

conocida por siglas en inglés PCR (Polymerase Chain Reaction). Es de mi

particular interés dar a conocer las pautas y aspectos generales de las técnicas de

PCR y ciclo de la secuenciación, es necesario resaltar que para las dos, se
necesitan el uso del termociclador, siendo importante conocer su uso de forma

clara y exacta.



Objetivo.



Realizar en la práctica, un laboratorio de biología molecular usando las técnicas de

PCR y ciclo de la secuenciación, además aprender a usar y programar el

termociclador para amplificación de material genético.

Materiales:

Tubos para PCR y secuenciacion

Micropipetas

Puntas

Reactivos

Bandeja de PCR y secuenciacion

Rack para tubos

Papel microfilm



Protocolos para PCR

protocolo

   -        16.38 µl de ddH2O.

   -        2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de

            Tris-HCl, pH 8.5).

   -        0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2.
-     2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados).

   -     1 µl de cada cebador a una concentración de 20 µM.

   -     0.12 µl de Taq polimerasa (Qiagen).

   -     1 µl de ADN genómico.

Segundo protocolo.

   -     14.22 µl de ddH2O.

   -     2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de

         Tris-HCl, pH 8.5).

   -     0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2.

   -     2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados).

   -     1 µl de cada cebador, a una concentración de 20 µM.

   -     0.28 µl de Taq polimerasa (BOEHRINGER MANNHEIM).

   -     3 µl de ADN genómico.

Tercer Protocolo

   -     12.4 µl de ddH2O.

   -     2.5 µl de buffer 10x, para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de

         Tris-HCl, pH 8.5).

   -     3.0 µl de 2.5 mM de MgCl2.

   -     2.5 µl de 8 µM de cada uno de los dNTP (desoxiribonucleósidos

         trifosfatados).

   -     1.25 µl de cada cebador a una concentración de 10 µM.

   -     0.1 µl de 2.5 unidades de Ampli Taq (Perkin Elmer)

   -     2 µl de ADN genómico.
Para cada uno de los protocolos presentados con anterioridad, se utilizaron

   perfiles de amplificación diferentes, los perfiles son los siguientes:

   Primer perfil de amplificación

           Ciclo              Temperatura (ºC)             Tiempo

             1                        94                     2:00

             2                        94                     O:30

             3                        57           0:40 seg (-0.5 por/ciclo)

             4                        72                  0.3 ºC/seg

             5                        72              1:10 (+1seg/ciclo)

             6                    Ir a Ciclo 2             7 veces

             7                        94                     0.30

             8                        53                     0:40

             9                        72           1.18seg +1segundo por

                                                             ciclo

             10                   Ir a Ciclo 7             26 veces

             11                       72                    10:00

             12                       10                 Permanente

             13                       Fin                     Fin




Segundo perfil de amplificación.


           Ciclo                 Temperatura (ºC)                    Tiempo
1                            93                2:00

            2                            93                O:30

            3                            50                0.35

            4                            72             0.4 ºC/seg

            5                            72          1:10 (+1seg/ciclo)

            6                        Ir a Ciclo 2        34 veces

            7                            72                10:00

            8                            10            Permanente

            9                            fin                fin




Tercer perfil de amplificación.

          Ciclo                   Temperatura (ºC)       Tiempo

            1                            94                3:00

            2                            94                1:10

            3                            52                1.30

            4                            72                2:30

            5                        Ir a Ciclo 2        30 veces

            6                            72                5:00

            7                            10            Permanente

            8                            fin                fin
Ciclo de la secuenciación



componentes son:

   -      3 µl de ddH2O

   -      2 µl buffer 5x

   -      1 µl de cada cebador a una concentración (ver Tabla 3)

   -      1 µl Big Dye

   -      3 µl de ADNmt (gelasa)




El perfil de secuenciación cíclica programado


           Ciclo               Temperatura (ºC)              Tiempo

             1                         95                      0:15

             2                         60                      0:30

             3                         60                      4:00

             4                     Ir a Ciclo 1              29 veces

             5                         10                  Permanente

             6                         fin                         Fin
El perfil de secuenciación cíclica programado para

          Ciclo                Temperatura (ºC)       Tiempo

             1                         96               0:15

             2                         95               0:10

             3                         50               0.05

             4                         60               4:00

             5                     Ir a ciclo 2       29 veces

             6                         10            Permanente

             7                         fin              Fin




Nota.

Es necesario el uso de bata blanca y guantes es de
caracter obligatorio

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  • 1. Laboratorio de Reacción en cadena de la polimerasa PCR y ciclo de secuenciación Dr. Giovanni González DMV, Esp, MsC Area de Biologia Molecular Justificación Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser considerados realmente como revolucionarios. Sin embargo cuando ello ocurre, transformamos correctamente el modo en que trabajamos y pensamos. Aunque el progreso en las diferentes ciencias parece ser lento y su evolución resulta una letanía paso a paso, en el caso de la biología molecular ha sucedido lo contrario. Dicha disciplina ha sido afortunada con grandes cambios en tiempo relativamente corto. Uno de los principales cambios tecnológicos citados ocurrió en 1985 gracias al señor Kary Mullis, con la introducción de una de las herramientas moleculares con mayor aplicación en el laboratorio clínico veterinario: la reacción en cadena de la polimerasa, más conocida por siglas en inglés PCR (Polymerase Chain Reaction). Es de mi particular interés dar a conocer las pautas y aspectos generales de las técnicas de PCR y ciclo de la secuenciación, es necesario resaltar que para las dos, se
  • 2. necesitan el uso del termociclador, siendo importante conocer su uso de forma clara y exacta. Objetivo. Realizar en la práctica, un laboratorio de biología molecular usando las técnicas de PCR y ciclo de la secuenciación, además aprender a usar y programar el termociclador para amplificación de material genético. Materiales: Tubos para PCR y secuenciacion Micropipetas Puntas Reactivos Bandeja de PCR y secuenciacion Rack para tubos Papel microfilm Protocolos para PCR protocolo - 16.38 µl de ddH2O. - 2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5). - 0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2.
  • 3. - 2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados). - 1 µl de cada cebador a una concentración de 20 µM. - 0.12 µl de Taq polimerasa (Qiagen). - 1 µl de ADN genómico. Segundo protocolo. - 14.22 µl de ddH2O. - 2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5). - 0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2. - 2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados). - 1 µl de cada cebador, a una concentración de 20 µM. - 0.28 µl de Taq polimerasa (BOEHRINGER MANNHEIM). - 3 µl de ADN genómico. Tercer Protocolo - 12.4 µl de ddH2O. - 2.5 µl de buffer 10x, para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5). - 3.0 µl de 2.5 mM de MgCl2. - 2.5 µl de 8 µM de cada uno de los dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados). - 1.25 µl de cada cebador a una concentración de 10 µM. - 0.1 µl de 2.5 unidades de Ampli Taq (Perkin Elmer) - 2 µl de ADN genómico.
  • 4. Para cada uno de los protocolos presentados con anterioridad, se utilizaron perfiles de amplificación diferentes, los perfiles son los siguientes: Primer perfil de amplificación Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 94 2:00 2 94 O:30 3 57 0:40 seg (-0.5 por/ciclo) 4 72 0.3 ºC/seg 5 72 1:10 (+1seg/ciclo) 6 Ir a Ciclo 2 7 veces 7 94 0.30 8 53 0:40 9 72 1.18seg +1segundo por ciclo 10 Ir a Ciclo 7 26 veces 11 72 10:00 12 10 Permanente 13 Fin Fin Segundo perfil de amplificación. Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo
  • 5. 1 93 2:00 2 93 O:30 3 50 0.35 4 72 0.4 ºC/seg 5 72 1:10 (+1seg/ciclo) 6 Ir a Ciclo 2 34 veces 7 72 10:00 8 10 Permanente 9 fin fin Tercer perfil de amplificación. Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 94 3:00 2 94 1:10 3 52 1.30 4 72 2:30 5 Ir a Ciclo 2 30 veces 6 72 5:00 7 10 Permanente 8 fin fin
  • 6. Ciclo de la secuenciación componentes son: - 3 µl de ddH2O - 2 µl buffer 5x - 1 µl de cada cebador a una concentración (ver Tabla 3) - 1 µl Big Dye - 3 µl de ADNmt (gelasa) El perfil de secuenciación cíclica programado Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 95 0:15 2 60 0:30 3 60 4:00 4 Ir a Ciclo 1 29 veces 5 10 Permanente 6 fin Fin
  • 7. El perfil de secuenciación cíclica programado para Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 96 0:15 2 95 0:10 3 50 0.05 4 60 4:00 5 Ir a ciclo 2 29 veces 6 10 Permanente 7 fin Fin Nota. Es necesario el uso de bata blanca y guantes es de caracter obligatorio