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Laboratório de Resistência Microbiana- LRM 
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HISTÓRICO 
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inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito ...
O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA PELA 
DNA POLIMERASE?
OBJETIVO DA PCR 
É a obtenção de muitas cópias de uma sequência 
específica de ácido nucléico, a partir de uma fita 
molde...
COMO É FEITO? 
Em primeiro lugar, deve-se extrair o material 
genético(DNA) da célula ou outro material a ser 
estudado.
COMO É FEITO?
REAGENTES PARA A REAÇÃO 
• DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a 
catalisadora da extensão dos primers; Aum...
REAGENTES PARA A REAÇÃO 
• MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são 
cofatores indispensáveis para a atividade da...
REAGENTES PARA A REAÇÃO 
COMO ESCOLHER O 
PRIMER?
PRIMER/INICIADOR 
• Sintetizados quimicamente; 
• 15 a 25 bases ; 
• Define limites alvo a amplificar; 
• Serve como ponto...
COMO É FEITO? 
Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina 
termocicladora que possui como função fazer ciclos 
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COMO É FEITO?
ETAPAS DO CICLO 
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PRODUTO FINAL DA PCR 
• DNA primeira copia 
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DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR 
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PCR 
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• Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar 
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PCR 
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SUGESTÃO 
• Reduza a quantidade de DNA; 
• Diminuir o tempo de anelamento da reação; 
• Aumente a temperatura de anelament...
BANDAS INESPECÍFICAS
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SUGESTÃO 
• Tenha certeza que todos os componentes estão na reação 
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• Teste um novo Master Mix o...
VANTAGENS DA TÉCNICA 
• Capacidade de amplificar uma sequência precisa de 
DNA; 
• Rápida; 
• De baixo custo;
LIMITAÇÕES 
• Necessidade de conhecer a sequência de DNA a 
amplificar para que possam ser 
sintetizados primers específic...
PRINCIPAIS USO DA PCR
PCR- Reação em cadeia pela DNA POLIMERASE!
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PCR: sua principal função, os principais reagentes e suas funções e os pontos importantes que levam a falha no resultado final da PCR.

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PCR- Reação em cadeia pela DNA POLIMERASE!

  1. 1. Universidade de Pernambuco – UPE Laboratório de Resistência Microbiana- LRM PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE HEMILLY RAYANNE F. SILVA
  2. 2. HISTÓRICO • 1987 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary Mullis; • 1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo; • 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.
  3. 3. O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE?
  4. 4. OBJETIVO DA PCR É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro.
  5. 5. COMO É FEITO? Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético(DNA) da célula ou outro material a ser estudado.
  6. 6. COMO É FEITO?
  7. 7. REAGENTES PARA A REAÇÃO • DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua concentração pode resultar na diminuição da sua especificidade; • SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições da reação;
  8. 8. REAGENTES PARA A REAÇÃO • MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são cofatores indispensáveis para a atividade da enzima; • dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do primer.
  9. 9. REAGENTES PARA A REAÇÃO COMO ESCOLHER O PRIMER?
  10. 10. PRIMER/INICIADOR • Sintetizados quimicamente; • 15 a 25 bases ; • Define limites alvo a amplificar; • Serve como ponto de início para a replicação; • Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas direções (para frente e para trás); • Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database (www.insdc.org) • GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory (EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
  11. 11. COMO É FEITO? Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina termocicladora que possui como função fazer ciclos de temperaturas pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para as reações seguintes da análise.
  12. 12. COMO É FEITO?
  13. 13. ETAPAS DO CICLO • 1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita do DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador irá elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio. 5’ 3’ 3’ 5’ 92C 5’ 3’ + 3’ 5’
  14. 14. ETAPAS DO CICLO • 2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. 5’ 3’ Forward primer Reverse primer 3’ 5’
  15. 15. ETAPAS DO CICLO • 3-Extensão:Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.
  16. 16. PRODUTO FINAL DA PCR • DNA primeira copia • PCR
  17. 17. DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose ou acrilamida.
  18. 18. PCR PONTOS IMPORTANTES PARA O BOM FUNCIONAMENTO DA PCR
  19. 19. PONTOS IMPORTANTES: • Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas. Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não específicos, reduzindo a concentração do produto desejado. Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da reação, resultando em baixa concentração do produto desejado; • A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição dos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em anelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica. Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzida concentração do produto.
  20. 20. PONTOS IMPORTANTES: • Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar intacta. Uma qualidade pobre de DNA, irá frequentemente conter iniciadores que deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas dentro do molde; • A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveria ser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária para uma PCR ótima; • Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser suficientemente amplificado em 30 ciclos. A pureza do molde também influencia no resultado da reação.
  21. 21. PCR APARECIMENTO DE BANDAS INESPECÍFICAS NA PCR O QUE FAZER?
  22. 22. SUGESTÃO • Reduza a quantidade de DNA; • Diminuir o tempo de anelamento da reação; • Aumente a temperatura de anelamento; • Reduza a concentração da enzima; • Reduza a concentração de Mg²⁺; • Aumento do tempo de desnaturação; • Aumento da temperatura de desnaturação; • Reduza o tempo de extensão; • Reveja os desenhos dos primers.
  23. 23. BANDAS INESPECÍFICAS
  24. 24. PCR A REAÇÃO ESTAVA FUNCIONANDO ANTES, MAS AGORA EU NÃO OBTENHO NENHUM PRODUTO. O QUE FAZER?
  25. 25. SUGESTÃO • Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…); • Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos); • Utilize um estoque novo de primers; • Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.
  26. 26. VANTAGENS DA TÉCNICA • Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA; • Rápida; • De baixo custo;
  27. 27. LIMITAÇÕES • Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos; • Facilidade de contaminação da amostra; • Extensão limitada da sequência a se amplificar; • Limitada extensão da sequência; • Incorporação errônea de bases durante a replicação.
  28. 28. PRINCIPAIS USO DA PCR

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