Apostila prática de microbiologia industrial

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Apostila prática de microbiologia industrial

  1. 1. Universidade do Estado do Rio de Janeiro FACULDADE DE TECNOLOGIA ENGENHARIA DE PRODUÇÃO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E AMBIENTAL MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL APOSTILA DAS AULAS PRÁTICAS Professora Denise Celeste G. de A. Rodrigues
  2. 2. Índice 1. Considerações Gerais sobre Segurança no Laboratório.............................................. 1 1.1. Noções de Biossegurança ....................................................................................... 1 1.2. Normas de segurança no laboratório de microbiologia............................................ 5 2. Preparação de culturas microbianas............................................................................... 7 2.1. Procedimentos assépticos: ...................................................................................... 7 3. Aula prática 01: Presença de Microrganismos no Ambiente .........................................10 3.1. Preparo de meio nutriente em Placas de Petri.........................................................10 3.2. Exposição das placas a diferentes ambientes..........................................................11 3.3. Relatório ...............................................................................................................11 4. Considerações Gerais sobre Desinfecção e Esterilização ..............................................12 4.1. Esterilização:.........................................................................................................12 4.1.1. Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) ................................13 4.1.2. Esterilização pelo Calor Úmido ......................................................................14 5.1.3. Controle da Esterilização ................................................................................15 4.2. Desinfecção...........................................................................................................16 4.2.1. Desinfecção por agentes físicos: .....................................................................16 4.2.2. Desinfecção por agentes químicos: .................................................................16 5. Aula prática 02: Desinfecção........................................................................................20 5.1. Identificação das Placas de Petri............................................................................20 5.2. Desinfecção das mãos e inoculação das Placas de Petri..........................................20 5.3. Relatório ...............................................................................................................21 6. Aula prática 03: Testando produtos de limpeza..........................................................22 6.1. Procedimento ........................................................................................................22 6.2. Relatório ...............................................................................................................22 7. Microscopia .................................................................................................................23 8. Aula prática 04: Microscopia a Fresco..........................................................................26 8.1. Sem corante...........................................................................................................26 8.2. Com corante..........................................................................................................26 8.3. Com outras culturas...............................................................................................27 8.4. Relatório ...............................................................................................................27 9. Aula prática 05: Microscopia de Gram .........................................................................28 9.1. Esfregaço de cultura bacteriana sólida: ..................................................................28 9.2. Adição de Corantes: ..............................................................................................28 9.3. Relatório ...............................................................................................................29 10. Aula prática 06: Inoculação de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio sólido...............................................................................................................................30 10.1. Preparação de uma série de diluições decimais de uma cultura de leveduras........30 10.2. Inoculação de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio sólido..........32 10.3. Relatório .............................................................................................................33 11. Aula prática 07: Isolamento de microrganismos de tecido vegetal ..............................34 11.1. Desinfecção superficial........................................................................................34 11.2. Inoculação e incubação........................................................................................34
  3. 3. 11.3. Relatório .............................................................................................................34 12. Aula prática 08: Isolamento de microrganismos do ar.................................................35 12.1. Exposição das placas – método da sedimentação .................................................35 12.2. Relatório .............................................................................................................35 13. Aula prática 09: Estragando o mingau ........................................................................36 13.1. Procedimento ......................................................................................................36 13.2. Relatório .............................................................................................................36 14. Aula prática 10: Microrganismos em Processos Biotecnológicos................................37 14.1. Procedimento ......................................................................................................37 14.2. Relatório .............................................................................................................37 15. Confecção dos relatórios ............................................................................................38
  4. 4. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 1 1. Considerações Gerais sobre Segurança no Laboratório A segurança num laboratório de microbiologia envolve implementação de procedimentos particulares, associados às metodologias necessárias para manipular culturas microbianas. Por um lado, devido às reduzidas dimensões das células, que para nós são imperceptíveis, e por outro, pela necessidade de trabalhar com culturas celulares puras e/ou impuras, as quais podem conter um número elevadíssimo de células microbianas. Em qualquer espaço laboratorial, os procedimentos realizados devem incluir o cumprimento de regras de funcionamento, de medidas de segurança obrigatórias e o manuseamento correto e cuidadoso do material, dos reagentes químicos e do equipamento laboratorial. Atender a estes princípios contribui para a prevenção de acidentes e para impedir a existência de fontes de contágio ou de perigo no local de trabalho. 1.1. Noções de Biossegurança Conceitos de biossegurança: “Condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer a saúde humana, animal e vegetal e o meio ambiente.” (Comissão de Biossegurança em Saúde, 2002) “É o conjunto de ações voltadas para prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços, as quais possam compromete a saúde do homem, dos animais, das plantas, do ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos.” (Comissão de Biossegurança da Fundação Oswaldo Cruz, 2003) Os acidentes em laboratórios de microbiologia envolvem risco biológico em contrair infecções por microrganismos patogênicos. Estão sujeitos a estas infecções desde
  5. 5. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 2 os técnicos, pesquisadores, até o pessoal da limpeza e lavagem de materiais de laboratório, podendo ocorrer através:  da pele - projeção de culturas microbianas sobre a pele escoriada, picadas de agulhas contaminadas, mordida de animais inoculados, etc.  das vias digestivas e mucosa bucal - ingestão de alimentos e bebidas durante o trabalho, insuficiente desinfecção das mãos antes de comer ou fumar, etc.  das vias respiratórias e mucosa nasal - aspiração de aerossóis contaminados, projeção de culturas contaminadas, etc.  dos olhos e ouvidos - projeção de culturas microbianas, insuficiente desinfecção das mãos, etc. Os agentes biológicos responsáveis pelas infecções laboratoriais são classificados em grupos de risco, baseado nos seguintes fatores:  Capacidade patogênica do agenteModo de transmissão e hospedeiros susceptíveis - pode depender dos níveis de imunidade, da densidade populacional, da presença de vetores apropriados e das normas de higiene ambiental  Disponibilidade de medidas de prevenção eficazes - profilaxia (vacinas e soros); luta contra reservatórios de artrópodes vetores e importação de animais ou produtos de animais infectados  Disponibilidade de tratamento eficaz - imunização passiva e vacinação (exposição); administração de antibióticos e quimioterapia Empregando-se tais critérios tem-se a seguinte classificação dos agentes biológicos por grupo de risco:  Grupo de Risco 1 (riscos: individual e comunitário baixo) Microrganismos com pouca probabilidade de provocar doenças humanas ou doenças de importância veterinária nos animais.  Grupo de Risco 2 (riscos: individual moderado e comunitário limitado)
  6. 6. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 3 Microrganismos que podem provocar doenças humanas ou enfermidade animais, mas que possuem poucas possibilidades de causar um risco grave para: pessoal de laboratório, comunidade, agropecuária e meio ambiente. Exemplos: bactérias (clostrídios, salmonelas); parasitas (toxoplasmas, giárdias) e vírus (enterovírus, vírus da influenza)  Grupo de Risco 3 (riscos: individual elevado e comunitário baixo) Microrganismos que provocam doenças graves em humanos, mas que não se propagam de uma pessoa infectada à outra. Tratamento e medidas preventivas eficazes. Exemplos: Mycobacterium tuberculosis, vírus da raiva  Grupo de Risco 4 (riscos: individual e comunitário elevados) Microrganismos que provocam enfermidades graves em humanos e podem propagar-se de um indivíduo a outro, direta ou indiretamente. Não existe tratamento, vacinas e medidas preventivas eficazes disponíveis. Exemplos: febre hemorrágica, Congo-Crimean  Classe de risco especial (riscos: alto risco de causar doença animal grave e de disseminação no meio ambiente): Inclui agentes biológicos de doença animal não existentes no País e que, embora não sejam obrigatoriamente patógenos de importância para o homem, podem gerar graves perdas econômicas e/ou na produção de alimentos. Exemplos: Vírus da influenza A aviária ; Vírus da peste eqüina africana As ações a serem implementadas, visando a biossegurança, compreendem medidas:  educacionais – treinamento individual e coletivo  administrativas – estrutura organizacional, organização e métodos, sistemas de documentação  técnicas - programa de garantia e controle de qualidade, programa de prevenção de acidentes, sistemas de documentação  médicas – programa de medicina ocupacional Na tabela 1 encontram-se algumas recomendações para os níveis de biossegurança.
  7. 7. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 4 TABELA 1: SUMÁRIO DAS RECOMENDAÇÕES DOS NÍVEIS DE BIOSSEGURANÇA POR AGENTES INFECTANTES Nível de Biossegurança Técnicas e Práticas Equipamentos de Segurança Instalações 1 Boas práticas de laboratório microbiológico (aventais, não pipetar com a boca, autoclavar materiais infectantes) Equipamentos básicos *bancadas que permitem limpeza adequada *sala com porta *autoclave, etc básica 2 Práticas do nível 1, mais: *descontaminação de todos os resíduos infectantes *limitado acesso *proteção com luvas e sinalização de biossegurança *manipulação de seringas, agulhas *manipulação de biossegurança Requisitos do nível 1, mais: *câmara de fluxo laminar de segurança biológica classes I e II, para conduzir procedimentos e manipular amostras com alto potencial de produzir aerossóis *luvas, máscaras especiais para amostras com exposição ocupacional aumentada *sinalizações básica 3 Idem ao nível 2, mais *aventais especiais e acesso controlado com mais rigor Requisitos do nível 2, mais: *sinalização especial, luvas e máscaras *câmara de fluxo laminar pra toda manipulação do agente *linhas de vácuo protegidas com filtro *dupla porta de segurança Requerem instalações especiais: *salas com pressão negativa *exaustão para fora 4 Práticas do nível 3, mais: *entrada após troca de roupa especial na sala e remoção especial de resíduos *banho antes de sair e todos os resíduos são descontaminados antes de sair das instalações Requisitos do nível 3, mais: *câmara de fluxo laminar classe III, em combinação com pressão positiva na sala e roupa especial com respirador artificial, para todos os procedimentos e atividades Requisito máximo de segurança (chuveiro na sala, etc)
  8. 8. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 5 1.2. Normas de segurança no laboratório de microbiologia 01-O uso do guarda-pó é obrigatório. 02-Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos. 03-Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática. 04-Limpar a bancada de trabalho convenientemente com álcool etílico a 70% (v/v) e manter o material em ordem 05-Lavar e sanitizar as mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material. 06-Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise. 07-No manuseio de compostos químicos considerados perigosos, evitar o contato cutâneo ou a sua inalação, recorrendo ao uso de luvas, máscara ou óculos de proteção, consoante as características dos compostos. 08-Não pipetar com a boca. 09-Estabelecer regras bem definidas para o circuito do material de vidro e de plástico no laboratório, assim como para a sua lavagem. 10-Manusear com muita precaução certos materiais e aparelhos frágeis e/ou muito sensíveis e mantê-los devidamente limpos. 11-Utilizar exclusivamente material estéril para a análise. 12-No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 13-Não comer, beber ou fumar no laboratório. 14-Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 15-Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 16-Avisar ao professor em caso de contaminação acidental. 17-Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-o sobre a bancada. 18-Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso.
  9. 9. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 6 19-Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia. 20-Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis por perto. 21-Manter os bicos de Bunsen e as lamparinas acesas apenas enquanto são necessários. 22-Trabalhe sempre próximo ao fogo. OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a flambagem). (Figura 1). Figura 1
  10. 10. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 7 2. Preparação de culturas microbianas A preparação de culturas microbianas, e em particular a inoculação da espécie ou espécies microbianas que pretendemos fazer crescer, envolve uma série de procedimentos assépticos que deverão ocorrer em condições apropriadas. 2.1. Procedimentos assépticos: Há certas precauções que devem ser tomadas durante a inoculação de uma cultura microbiana de modo a evitar a contaminação das culturas, das pessoas ou do ambiente:  Certificar-se de que ao dar início às operações, todo o material necessário está ao alcance imediato, de forma a realizar o trabalho o mais rapidamente possível.  Desinfetar com solução apropriada e arrumar convenientemente a bancada de trabalho.  Os recipientes devem permanecer abertos o mínimo tempo possível e, enquanto abertos, todo o trabalho deve ser realizado junto à chama do bico de Bunsen.  Uma vez abertos os recipientes, como tubos, balões e frascos, o seu bocal deve ser flamejado de imediato.  A fim de evitar as contaminações durante as manipulações que envolvam placas de Petri, a exposição das superfícies internas estéreis deve durar o mínimo de tempo possível.  A extremidade da pipeta estéril que vai ser colocada em contacto com as culturas celulares, ou com os recipientes estéreis, não deve ser tocada nem entrar em contato com superfícies não estéreis, como é o caso da roupa, superfície da área de trabalho, o exterior de tubos, de balões ou quaisquer outros materiais.
  11. 11. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 8  A utilização das alças, pipetas e espalhadores, assim como a manipulação de frascos e tubos de ensaio, em condições de assepsia, envolve alguns cuidados particulares: - Alças As alças são esterilizadas pela passagem na chama do bico de Bunsen, antes e depois de serem utilizadas. Devem ser aquecidas até ficarem ao rubro para assegurar que todos os esporos sejam destruídos. Devem ser agarradas quase pelo topo num ângulo praticamente vertical. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar a tampa do recipiente. - Pipetas Para transferir culturas, meios e soluções estéreis deve-se utilizar pipetas graduadas ou pipetas Pasteur estéreis de acordo com as normas descritas a seguir: 1. Remover a pipeta de vidro do pacote pela extremidade que contém o tampão de algodão, tendo o cuidado para não tocar mais do que o necessário de modo a segurar firmemente. 2. Colocar a pro-pipete. 3. Segurar a pipeta como uma caneta, mas não apertar a pro-pipete. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar na rolha de algodão/ tampa do tubo/ frasco. 4. Apertar a pro-pipete com cuidado e retirar a quantidade de fluido necessária, mas que não atinja nem molhe o tampão de algodão. 5. Colocar a pipeta usada num contentor de plástico com desinfetante, devidamente identificado para esse fim. 6. A pro-pipete não deve ser retirada até a pipeta estar dentro do contentor de plástico, de modo a evitar que gotas de cultura contaminem a superfície de trabalho. - Frascos, balões e tubos de ensaio Quando se pretende manipular frascos, balões ou tubos de ensaio em condições assépticas deve-se proceder do seguinte modo: 1. Desapertar a tampa dos frascos/balões ou tubos de ensaio de modo a poder ser retirada facilmente. 2. Segurar o frasco/ tubo com a mão esquerda. 3. Retirar a tampa/ rolha de algodão com o dedo mindinho da mão direita.
  12. 12. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 9 4. Não pousar a tampa/ rolha de algodão. 5. Flamejar o gargalo do frasco/ tubo fazendo-o passar pela chama do bico de Bunsen. 6. Recolocar a tampa do recipiente. - Espalhadores Os espalhadores, ou alças de Drigalski, são usados para distribuir inóculos sobre a superfície de placas já preparadas com meios de cultura. Podem ser esterilizados em estufa uma vez empacotados, ou por flamejação com álcool. - Esterilização com álcool A esterilização de espalhadores com álcool envolve os seguintes procedimentos: 1. Mergulhar a extremidade do espalhador num pequeno volume de álcool a 70% (v/v) contido num recipiente com tampa ou coberto com papel de alumínio. 2. Passar rapidamente através da chama do bico de Bunsen; o álcool vai arder esterilizando o vidro. 3. Afastar o espalhador ligeiramente da chama até o álcool parar de arder. 4. Pousar o espalhador numa superfície estéril como uma caixa de Petri ou um copo graduado.
  13. 13. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 10 3. Aula prática 01: Presença de Microrganismos no Ambiente Objetivos: Mostrar a diversidade de culturas microbianas existentes no ambiente e familiarizar-se com o preparo de meios de cultura. 3.1. Preparo de meio nutriente em Placas de Petri 1. Esterilização das placas de petri: deve-se esterilizá-las secas e limpas, embrulhadas em papel manilha ou semelhante, em autoclave, a 1 atm por 20 min. 2. Preparo do meio ágar nutriente (seguir as especificações do fabricante): •Pesar a quantidade adequada de ágar nutriente em erlenmeyer de 250 mL •Adicionar a quantidade de água destilada necessária. •Levar o conjunto ao banho-maria até dissolução do gel. A seguir o ágar é colocado em recipiente próprio para esterilização e tampado •Autoclavar o meio nutriente por 15 min. 3.Após a esterilização deixar o ágar esfriar, em temperatura ambiente, até que se consiga segurar o frasco com as mãos, sem queimá-las. 4.Verter o meio nas placas assepticamente, próximo à chama. 5.Deixar o ágar solidificar em temperatura ambiente e depois estocar adequadamente as placas, para posterior utilização. OBS: as placas devem ser estocadas e/ou incubadas sempre invertidas, para que qualquer condensado, por ventura formado, não se misture ao meio de cultura.
  14. 14. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 11 3.2. Exposição das placas a diferentes ambientes 1. Expor placas de Petri contendo ágar nutriente a uma das seguintes condições: •Manter uma delas aberta durante 15 minutos em um ambiente qualquer (banheiro, sala de aula, cantina, etc) •Em outra placa, tocar os dedos no material nutriente ou expor ao contato de materiais tais como: fio de cabelo, solo, pó de giz, etc. •Falar ou tossir sobre o meio de cultura da terceira placa •Manter uma placa sem exposição, para servir como controle. 2. Identificar as placas, anotando na tampa o tipo de exposição a que foram submetidas, data, grupo, etc 3. Na estufa, incubar as placas na posição invertida à temperatura de 30°C por sete dias. Observar as placas diariamente fazendo anotações quando necessário. Não esquecer de anotar a composição do meio de cultura utilizado. 4. Após a utilização das placas estas devem ser esterilizadas na autoclave, antes do material ser descartado, e limpas. 3.3. Relatório 1. Avaliar a presença de colônias, sua abundância e diversidade e compará-la com a dos outros grupos e com o controle. 2. Pesquisar em livros ou na internet outros meios de cultura existentes para o cultivo e armazenamento de microrganismos.
  15. 15. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 12 4. Considerações Gerais sobre Desinfecção e Esterilização ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos. DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local. ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local. ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por exemplo, através do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal. LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização. 4.1. Esterilização: A melhor maneira de garantirmos a destruição de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que causam infecções em seres humanos desenvolve-se em temperaturas próximas a do corpo, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que não acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo fica apenas inibido, e não é destruído. Alguns microrganismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio inicial de infectividade,
  16. 16. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 13 portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os esporos. Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Os métodos de esterilização mais empregados em laboratório são os que utilizam o calor, seja este úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor úmido (autoclave) é melhor. 4.1.1. Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos microrganismos. A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos. Para ser eficiente, este processo depende de:  Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do material.  Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados.  A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre os objetos.  O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.
  17. 17. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 14 4.1.2. Esterilização pelo Calor Úmido O calor úmido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais através das formas de: vapor d’água, água fervente e água aquecida abaixo de seu ponto de ebulição. - Água fervente É a água levada ao ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os microrganismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados não são esterilizados com segurança pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora. - Vapor d’água O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos microrganismos, e por este motivo é mais rápido. Funcionamento da autoclave: 1- A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2- É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d’água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave; 3- A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol² , na qual a temperatura do vapor é de 121ºC.
  18. 18. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 15 A eficiência do processo de esterilização em autoclaves depende de alguns fatores:  Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados.  O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é atingida.  A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual.  Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado. 5.1.3. Controle da Esterilização É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia, conhecimento da pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente. O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do processo. Este controle deve fazer parte da rotina do laboratório para garantir a segurança de toda a equipe. Considerações importantes: 1. É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita do material antes de serem submetidos à esterilização. A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus, sangue, e outras secreções) protege o microrganismo da ação esterilizante. É adequado lavar manualmente o material com detergente e água morna antes da esterilização.
  19. 19. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 16 2. Depois de esterilizados, os materiais devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrário voltam a se contaminar com microrganismos presentes no ambiente. 4.2. Desinfecção Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química (desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de microrganismos inativados. 1- Desinfecção de alto nível: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. 2- Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa bactérias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vírus. 3- Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus. 4.2.1. Desinfecção por agentes físicos:  Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C) Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células vegetativas de microrganismos, mas não os esporos, portanto, é um método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos. 4.2.2. Desinfecção por agentes químicos: a) Método de Desinfecção de alto nível:  Glutaraldeído: é indicado para qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos.
  20. 20. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 17  Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa.  Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos.  Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos. b) Método de Desinfecção de nível intermediário:  Compostos Clorados: Causam a inibição de reações enzimáticas intracelulares, desnaturação de proteínas, e inativação de ácidos nucléicos.Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida (ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos.  Álcoois(Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% peso por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra- indicado para borracha, plásticos e acrílico.  Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular, precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,4-5% sendo que o tempo de exposição deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso é indicado para descontaminação de ambiente hospitalar, itens cirúrgicos e médicos não-críticos, sendo que devem ser consideradas as limitações devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia – crianças – berçários), e ação residual em materiais porosos.
  21. 21. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 18  Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos. c) Método de Desinfecção de baixo nível  Álcoois  Compostos Clorados  Fenólicos: em concentração menor que 5%  Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm  Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas, desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies)  Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex. Quaternários de Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e lípases, e,portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras (ex: Endozime) Na tabela 2 encontram-se os principais compostos utilizados em desinfecção e assepsia.
  22. 22. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 19 Tabela 2: Principais Compostos Utilizados em Desinfecção e Assepsia Agente Espectro de ação* Uso Modo de ação Tempo de exposição Desvantagens Álcoois (70- 80%) Gram-positivas Gram-negativas BAAR** Antissépticos Desinfectantes Desnaturação protéica dissolução de lipídeos Curto (10-15 min) Pouco ativo contra esporos Fenóis Gram-positivas Gram-negativas BAAR Desinfectantes Desnaturação protéica Efeito imediato Fenol puro é corrosivo e de odor desagradável Compostos Quaternários de amônio Gram-positivas Gram-negativas Antissépticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirúrgicos) Alteração da membrana celular bacteriana Curto (10-30 min) Não age sobre BAAR e esporos Cloro Gram-positivas Gram-negativas BAAR Tratamento da água Inativação enzimática agente oxidante Efeito imediato Odor irritante pouco ativo contra esporos Iodo Gram-positivas Gram-negativas BAAR Antissépticos Desinfectantes Inativação enzimática Efeito imediato Odor irritante pouco ativo contra esporos Iodóforos Gram-positivas Gram-negativas BAAR Antissépticos Desinfectantes Inativação enzimática Efeito imediato Pouco ativo contra esporos Aldeídos*** Gram-positivas Gram-negativas BAAR Desinfectantes (instrumentos e superfícies) Desnaturação protéica agente alquilante Curto (formas vegetativas) Prolongado (esporos) Tempo de exposição longo Metais pesados Gram-positivas Gram-negativas Antissépticos Inativação enzimática Só agem enquanto em contato Não atuam sobre BAAR e esporos *- Formas vegetativas; Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991. **- Bacilos álcool-ácido resistentes; ***- Ativos contra esporos
  23. 23. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 20 5. Aula prática 02: Desinfecção Objetivo: verificar a ação de antissépticos sobre a microbiota das mãos. 5.1. Identificação das Placas de Petri 1- Pegar uma placa de Petri contendo ágar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a divisão na parte de baixo da placa. 2- Identificar cada quadrante com os respectivos títulos: Controle (C), Mão Suja (MS), Detergente (Det), Álcool 70% (A), Água (água ) e Sabonete (S). Devem ser preparadas 2 placas seguindo o esquema abaixo. 5.2. Desinfecção das mãos e inoculação das Placas de Petri 1- No quadrante identificado como “ Mão Suja” o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no ágar por 1 minuto. 2- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mãos com detergente, secá-las levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “Detergente” por 1 minuto. 3 -O mesmo aluno deve então lavar as mãos com álcool, secá-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “álcool” por 1 minuto. águaS
  24. 24. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 21 4- Proceder de maneira semelhante para a outra placa, substituindo o detergente por água e o álcool por sabonete (protex). 5- As placas devem ser levadas para incubação, a 30C por 7 dias. OBS: Nada deve encostar no quadrante identificado como “Controle”. 5.3. Relatório 1- Faça uma representação esquemática dos resultados obtidos na avaliação da microbiota das mãos. Crescimento Bacteriano - + ++ +++ ++++ Controle Mão Suja Detergente Placa I Álcool 70% Controle Mão Suja água Placa II Sabonete 2. Discuta os resultados encontrados. 3. Como você interpreta os resultados obtidos? Qual a importância da antissepsia das mãos no seu dia-dia?
  25. 25. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 22 6. Aula prática 03: Testando produtos de limpeza Objetivo: verificar a eficácia de desinfetantes e outros produtos que prometem acabar com os microorganismos. 6.1. Procedimento 1. Raspe um pouco dos microrganismos que estão nas placas já contaminadas de uma das práticas anteriores; dilua-as em alguns mililitros de água estéril (use um tubo de ensaio). 2. Espalhe 1 ml da mistura de água com microrganismos nas placas de Petri com meio de cultura, com auxílio da pipeta automática e da alça de Drigalski. 3. Com a pinça, molhe o filtro de papel em um dos produtos (desinfetante, água sanitária, detergente e antibiótico) 4. Coloque cada círculo no meio de uma das placas previamente contaminadas e guarde-as na estufa. 5. Aguarde alguns dias. Quanto melhor o produto, maior será a auréola transparente que aparecerá em volta do papel; se for ruim, nada acontecerá. 6.2. Relatório Relate as observações realizadas durante a semana, comparando as placas e os produtos entre si. Pesquise sobre a forma de atuação de cada produto utilizado. Auréola transparente: quanto mais eficiente o produto, maior ela será.
  26. 26. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 23 7. Microscopia O microscópio foi inventado em 1590 por Hans Janssen e seu fiIho Zacharias, dois holandeses fabricantes de óculos. Tudo indica, porém, que o primeiro a fazer observações microscópicas de materiais biológicos foi o neerlandês Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Os microscópios de Leeuwenhoek eram dotados de uma única lente, pequena e quase esférica. Nesses aparelhos ele observou detalhadamente diversos tipos de material biológico, como embriões de plantas, os glóbulos vermelhos do sangue e os espermatozóides presentes no sêmen dos animais. Foi também Leeuwenhoek quem descobriu a existência dos “micróbios”, como eram antigamente chamados os seres microscópicos, hoje conhecidos como microorganismos. Dividem-se basicamente em duas categorias:  Microscópio Luminoso ou ótico •Microscopia de Campo Claro •Microscopia de Campo Escuro •Microscopia de Fluorescência •Microscopia de Contraste de Fase  Microscópio Eletrônico (alemão Ernest Ruska) •Microscópio Eletrônico de Transmissão - MET (para observação de cortes ultrafinos) •Microscópio Eletrônico de Varredura – MEV (para observação de superfícies) •Microscópio Eletrônico de Tunelamento - ME (para visualização de átomos) Dentre as técnicas empregadas em microscopia destacam-se: 1. Microscopia de fundo escuro É uma aplicação do princípio de Tyndall. Assim os corpúsculos a examinar são fortemente iluminados por feixes luminosos que penetram lateralmente, o que é conseguido com condensadores especiais. Deste modo, a única luz que penetra na objetiva
  27. 27. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 24 é a difratada pelas partículas presentes na preparação, pelo que passam a ser visíveis em fundo escuro. 2. Microscopia de fluorescência Permite observar microorganismos capazes de fixar substâncias fluorescentes. A luz UV, ao incidir nessas partículas, provoca a emissão de luz visível e observa-se os microorganismos a brilhar em fundo escuro. Como exemplo, o bacilo da tuberculose fixa a auramina, pelo que o diagnóstico da doença pode ser feito por microscopia de fluorescência. 3. Microscopia de contraste de fase Permite a observação de microrganismos vivos, sem coloração, através do contraste devido à diferença de fase dos raios luminosos que atravessam o fundo relativamente à fase da luz que atravessa os microrganismos. Esta diferença de fase é conseguida por utilização de uma objetiva de fase, que consiste num disco de vidro com um escavação circular, de modo que a luz que atravessa a escavação tem diferença de 1/4 de fase em relação à que travessa a outra porção do vidro. Assim, os objetos não corados podem funcionar como verdadeiras redes de difração, pois os pormenores da sua estrutura resultam de pequenas diferenças nos índices de refracção dos componentes celulares, e estes originam diferenças de fase nas radiações que os atravessam Microscópio óptico Porção mecânica Pé ou base – serve de apoio dos restantes componentes do microscópio. Coluna ou Braço – fixo à base, serve de suporte a outros elementos. Platina – onde se fixa a preparação a observar; tem uma janela por onde passam os raios luminosos e também parafusos dentados que permitem deslocar a preparação. Tubo ou canhão – suporta a ocular na extremidade superior. Revólver – peça giratória portadora de objetivas de diferentes ampliações. Parafuso macrométrico – a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina, rápidos e de grande amplitude.
  28. 28. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 25 Parafuso micrométrico – a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina, lentos e de pequena amplitude, permitem aperfeiçoar a focagem. Charriot - Movimenta a lâmina de um lado para o outro, permitindo uma análise da lâmina como um todo. Parte óptica: Condensador – conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e espalham regularmente a luz emitida pela fonte luminosa sobre o campo de visão do microscópio. Diafragma – permite regular a intensidade da luz que incide no campo de visão do microscópio. Objetivas – permitem ampliar a imagem do objeto 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x. As objetivas de 10x, 40x e 50x são designadas objetivas secas, pois entre a preparação e a objetiva existe somente ar. As objetivas de 90x e 100x são designadas objetivas de imersão, uma vez que, para as utilizar, é necessário colocar uma gota de óleo de imersão entre elas e a preparação, a qual, por ter um índice de refração semelhante ao do vidro, evita o desvio do feixe luminoso para fora da objetiva. Oculares – sistema de lentes que permitem ampliar a imagem real fornecida pela objetiva, formando uma imagem virtual que se situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do observador. As oculares mais utilizadas são as de ampliação 10x, mas nos microscópios binoculares também existem oculares de 12,5x, 8x e 6x. Fonte luminosa –luz artificial, fornecida por uma lâmpada de tungstênio ou de halogênio, incluída no aparelho juntamente com um interruptor com reostato, que permite regular a intensidade da luz emitida
  29. 29. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 26 8. Aula prática 04: Microscopia a Fresco Objetivos: utilizar o microscópio para visualizar lâminas de microrganismos preparadas pela técnica a fresco e verificar a morfologia celular. Sabemos que as bactérias são seres microscópicos, portanto a sua observação direta depende do uso do microscópio. Essa observação pode ser feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem coloração. A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural dos microrganismos e atividades celulares como a mobilidade bacteriana. A utilização do azul de metileno como corante permite verificar a viabilidade celular. Células coradas indicam que as células estão mortas. As células vivas permanecem incolores quando submetidas a esse tratamento, pois usa atividade metabólica reduz o corante tornando-o incolor. 8.1. Sem corante 1. Misturar fermento biológico em água estéril. 2. Com auxílio de uma alça de platina ou alça de inoculação estéril, transferir uma gotícula da cultura para o centro de uma lâmina. 3. Recobrir a cultura com uma lamínula e levar a microscópio para focalização. 8.2. Com corante 1. Adicionar algumas gotas de azul de metileno à preparação de fermento e aguardar 2 min. 2. Proceder como nos itens 2 e 3 do procedimento (8.1). 3. Observar se as células estão coradas ou não.
  30. 30. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 27 8.3. Com outras culturas 1.Escolher culturas microbianas em meio sólido, isoladas em práticas anteriores. 2.Transferir com auxílio da alça de platina ou de inoculação uma gota de água estéril para o centro de uma lâmina. 3.Com auxílio da alça de platina retirar um pouco da cultura sólida de uma placa de Petri e transferir para a gota de água sobre a lâmina. Se desejar colocar uma gota de azul de metileno sobre a preparação e aguardar 2 min. 4.Proceder como nos itens 2 e 3 do procedimento (8.1). 8.4. Relatório 1. Desenhe o que foi visualizado na observação direta de microrganismos nas três lâminas. 2. Relatar o que aconteceu quando se utilizou o azul de metileno. 3. Pesquisar outros corantes que possam ser empregados em microscopia.
  31. 31. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 28 9. Aula prática 05: Microscopia de Gram Objetivos: utilizar o microscópio para visualizar lâminas de microrganismos preparadas pela técnica de Gram e verificar a morfologia celular. A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). As Gram-positivas permanecem roxas, enquanto as Gram-negativas ficam avermelhadas. 9.1. Esfregaço de cultura bacteriana sólida: 1- Flambe uma alça, deixa esfriar, mantendo-a próximo a chama. 2- Retire uma gota da água estéril e deposite sobre a lâmina. 3- Flambe novamente a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura sólida. 4- Leve a amostra até a gota de água depositada sobre a lâmina, e homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino. 5- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. 9.2. Adição de Corantes: 1- Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte. 2- Cubra a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto. 3- Lave a lâmina em jato fraco de água corrente, do lado contrário ao esfregaço. 4- Cubra a lâmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lâmina. 5- Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona (Gram III), verifique a descoloração que deve ocorrer em cerca de 20 segundos.
  32. 32. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 29 6- Cubra a lâmina com fuccina (Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lâmina. 7- Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e a seguir seque o restante da lâmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse “cortando” a chama). 8- Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não esqueça de colocar uma gota de óleo para imersão sobre o esfregaço) 9.3. Relatório 1- Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia bacteriana e a reação tintorial. 2- Fale sobre o fundamento da técnica de Gram, relacionando-o com a estrutura celular da parede das bactérias e de outros microrganismos.
  33. 33. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 30 10. Aula prática 06: Inoculação de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio sólido Objetivos: aplicar técnica de diluição decimal para contagem de colônias microbianas e determinar o número de microrganismos por ml. O objetivo desta análise é determinar o número de microrganismos por ml, para isso:  Seleciona-se uma das placas incubadas, que contenha entre 20 e 200 colônias;  Conta-se o número de colônias;  Calcula-se a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte fórmula: * UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma vez que a contagem feita é referente às colônias e não às células presentes. ** 10 é um fator de correção. EXEMPLO: Se são contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita diluição de 10-2 , o cálculo final será: UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/ml 10.1. Preparação de uma série de diluições decimais de uma cultura de leveduras 1. Preparar tubos de ensaio contendo 9 ml de água destilada. 2. Esterilizar em autoclave durante 20 minutos a 120ºC e a 1 atm. 3. Preparar uma suspensão densa da levedura S. cerevisiae num tubo contendo água estéril (Figura 1). UFC* = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem)
  34. 34. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 31 4. Agitar o tubo de ensaio no vortex (cerca de 5 segundos). 5. Com uma pipeta estéril de 1 ml ou usando uma pipeta automática com pontas estéreis, retirar assepticamente 1 ml da suspensão microbiana. 6. Introduzir o volume de 1ml da suspensão no primeiro tubo de diluição (10 -1 ). 7. Homogeneizar a suspensão por agitação no vortex. 8. Com uma nova pipeta estéril retirar 1 ml da diluição 10 -1 e transferir para outro tubo para obter a diluição 10 -2 . 9. Continuar este procedimento até obter a diluição 10-6 . Figura 1: Diluições decimais de uma cultura microbiana e inoculação por espalhamento em meio de cultura sólido.
  35. 35. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 32 10.2. Inoculação de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio sólido 1. Antes de proceder à sementeira das placas de Petri, estas devem ser marcadas na parte marginal da sua base com as seguintes indicações: diluição, data do ensaio, identificação do grupo de trabalho. 2. Selecionar as três últimas diluições da suspensão de S. cerevisiae 10 -4 ,10 -5 e 10 -6 . 3. Agitar vigorosamente cada um dos tubos de ensaio contendo a diluição antes de proceder à sua inoculação em meio sólido. 4. Entreabrir três placas de Petri com meio YEPD e colocar 0,1 ml de cada uma das três diluições. 5. Mergulhar o espalhador no copo contendo álcool puro e passá-lo na chama do bico de Bunsen. Deixar a chama apagar no espalhador e esperar cerca de 30 segundos até ele arrefecer. 6. Passar o espalhador sobre a superfície do meio rodando as placas de Petri com cuidado. Após algum tempo nota-se uma certa resistência na movimentação do espalhador, o que indica que o inóculo foi absorvido pelo meio. 7. Todas as placas de Petri inoculadas devem ser incubadas à temperatura ambiente, durante 24 a 48 horas. Verificar se todas as placas estão devidamente identificadas antes de se colocarem na estufa (25 a 30 ºC). As diluições decimais realizadas a partir de suspensões densas de leveduras, se forem adequadas, permitem-nos obter, em placas com YEPD, colônias perfeitamente isoladas o que possibilita a sua contagem com maior rigor. É fundamental que o número de colônias desenvolvidas nas placas não seja demasiado grande porque algumas células poderão não formar colônias e a contagem não será correta. Também não deve ser demasiado pequeno de modo a inviabilizar o significado estatístico da contagem. A prática usual mais válida consiste em contar colônias apenas nas placas que tenham entre 20 e 200 colônias.
  36. 36. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 33 OBS: Composição do meio YEPD* Extrato de levedura 5 g/l Peptona 10 g/l Glicose 20 g/l Agar 20 g/l (para meios de cultura sólidos) 10.3. Relatório 1. Conte o número de colônias e calcule o número de unidades formadoras de colônias. 2. Pesquise outros procedimentos que permitam determinar a concentração de microrganismos em uma dada amostra
  37. 37. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 34 11. Aula prática 07: Isolamento de microrganismos de tecido vegetal Objetivo: isolar microrganismos de tecido vegetal. 11.1. Desinfecção superficial 1.Deixar a amostra vegetal imersa em álcool 70%, em recipiente esterilizado, por 5 min. 2.Proceder à lavagem com água destilada estéril para remoção do álcool. 11.2. Inoculação e incubação 1.Inocular em placa de petri contendo ágar nutriente. A inoculação deve ser realizada retirando-se pequenos pedaços do material, com auxílio de pinça esterilizada, que deverá ser colocado ou espalhado sobre o meio. 2.Repetir o procedimento para a placa de petri contendo ágar dextrose. 3.Repetir o procedimento para a placa de petri contendo ágar carne 4.Incubar em estufa a 30C por alguns dias. Atenção: não esquecer de anotar a composição e pH dos meios utilizados na prática, bem como o fabricante. 11.3. Relatório 1.Avaliar o crescimento e, se possível contar o número de colônias diferentes que possam ter aparecido, em cada uma dos meios utilizados. 2.Comparar os resultados observados para cada placa. OBS: É importante verificar quais os microrganismos normalmente isolados em cada meio empregado, para melhor discutir os resultados obtidos.12. Aula prática 08: Isolamento de microrganismos do ar
  38. 38. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 35 12. Aula prática 08: Isolamento de microrganismos do ar Objetivo: isolar microrganismos do ar. 12.1. Exposição das placas – método da sedimentação 1.Escolher o local de coleta 2.Colocar uma placa de petri contendo o meio ágar nutriente, uma contendo ágar dextrose e duas contendo ágar carne. 3.Após 5 minutos fechar as placas de ágar nutriente, ágar dextrose e uma de ágar carne. 4.Após 10 minutos, fechar a segunda placa de ágar carne. 5.Incubar a 30 C por 48 h. Atenção: não esquecer de anotar a composição e pH dos meios utilizados na prática, bem como o fabricante. 12.2. Relatório 1.Avaliar o crescimento e, se possível contar o número de colônias diferentes que possam ter aparecido, em cada uma dos meios utilizados para os microrganismos isolados do ar. 2.Comparar os resultados observados para cada placa do item 2, destacando as diferenças observadas em ralação ao tempo de exposição das placas contendo ágar carne. OBS: É importante verificar quais os microrganismos normalmente isolados em cada meio empregado, para melhor discutir os resultados obtidos.
  39. 39. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 36 13. Aula prática 09: Estragando o mingau Objetivo: Perceber a necessidade de guardar bem os alimentos para que eles não se contaminem. 13.1. Procedimento 1. Prepare o mingau com o amido de milho e 1 copo de água. Misture bem e leve ao fogo até engrossar. 2. Coloque o mingau ainda quente até a metade dos bécheres numerados de 1 a 5. 3. Deixe o bécher 1 aberto, em cima da pia do laboratório. 4. Cubra o 2 com o filme plástico, vede-o, e deixe-o também sobre a pia. 5. O 3 é completado com 1 colher de sopa de óleo. 6. E o 4, completado com 1 colher de sopa de vinagre. 7. O 5 é colocado na geladeira, sem cobertura. 13.2. Relatório 1. Observe em qual mingau apareceram as primeiras alterações. Depois de uma semana, descrever a aparência de cada bécher. 2. Discuta os resultados obtidos. 3. Faça pesquisas sobre técnicas antigas de conservação de alimentos compare com as modernas.
  40. 40. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 37 14. Aula prática 10: Microrganismos em Processos Biotecnológicos Objetivo: Identificar os microrganismos presentes em produtos comerciais obtidos pela atividade microbiana. 14.1. Procedimento 1.Preparar lâminas a fresco e coradas pelo método de Gram, a partir de fermento de pão, iogurte, yakult, vinho, etc. 2.Visualizar através de microscópio óptico. 3.Identificar os microrganismos presentes. 14.2. Relatório Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia microbiana e a reação tintorial.
  41. 41. Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 38 15. Confecção dos relatórios  Começar os relatórios com uma breve introdução, de forma a deixar claro os objetivos e as técnicas que serão empregadas na prática em questão. Não é necessário incluir o procedimento constante do roteiro.  Mostrar os resultados obtidos.  Pesquisar o que foi pedido no roteiro, neste caso colocando a bibliografia utilizada.  Fazer uma conclusão. OBS: A data de entrega do relatório será sempre uma semana após a conclusão da prática. O não cumprimento do prazo implicará na diminuição do valor do mesmo.

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