Hemocianina

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Hemocianina

  1. 1. Trabalho realizado por:João RibeiroNuno BastosGrupo 4 P5Química BioinorgânicaLicenciatura em BioquímicaAno lectivo 2012/2013
  2. 2. Traços GeraisA hemocianina é uma metaloproteína cuja principal funçãoé transportar o oxigénio em alguns artrópodes e moluscos.• Contém 2 átomos de cobre que seligam reversivelmente ao O2.• Encontra-se suspensa na hemolinfa.• A forma desoxigenada é incolor e aforma oxigenada é azul.
  3. 3. Por estar presente nas mais diversas espéciesde moluscos e artrópodes, através do PDB,encontram-se várias estruturas, obtidas porcristalografia de raios-X da hemocianina. Cada umadas estruturas está associada a uma única espécie.Citar-se-ão as estruturas que têm comoidentificação 1OXY, 1NOL e 1LLA, por serem asprimeiras a serem inseridas no PDB, ou seja, querepresentam os primeiros estudos cristalográficosdesta proteína.Traços Gerais
  4. 4. As hemocianinas fazem parte do grupo das proteínas de cobre de tipo IIIdo qual também pertencem, por exemplo, a catecol oxidase e a tirosinase.Alinhamento das sequências de aminoácidos dos sítiosactivos da catecol oxidase da batata doce, tirosinase humanae hemocinina do caracol (adaptada de Eicken et al, 1999).Centro activo de várias proteínas de cobre do tipoIII: A e C correspondem à hemocianina de límulo epolvo-gigante-do-pacífico, respetivamente; B,catecol oxidase de batata doce e D tirosinase deum microorganismo (Li et al, 2009)Traços Gerais
  5. 5. A unidade básica de organização das hemocianinas é um conjunto deseis subunidades, com um peso aproximado de 450000 Da.A hemocianina circulante pode ser composta por uma, duas, quatro ouoito desses hexâmeros, pelo que o seu peso é crescente e a sua solubilidade é,consequentemente, maior.x6Traços Gerais
  6. 6. Hemocianina de Limulus polyphemus. A sua estruturasecundária é 33% α-hélices , 18% folhas-β, 19% β-turn e30% sem estrutura específica.Incorpora um centro decobre binuclear do tipo III. Rasmol, 1OXYCentro ativo da Hemocianina deLimulus polyphemus. Composta por dois átomos decobre, assinalados a amarelo, estando no centro amolécula de oxigénio. A amarelo estãorepresentados os resíduos de Histidina quecoordenam com os centros metálicos, pelo átomo deazoto. DeepView, 1OXYEstrutura da proteína e do centroativo
  7. 7. Na forma desoxigenada, os iõescobre estão sob a forma de Cu+.Geometria do centro metálicoDesdobramento de orbitais,para um complexo degeometria trigonal planad¹⁰transições d-d proibidas por spinOrbitais completamente preenchidasComplexo incolor
  8. 8. Os centros de cobre(I) na desoxihemocianina têm uma geometria trigonalplanar com 3 ligações Cu-N(His).Há 2 estruturas cristalinas (R e T) da desoxihemocianina que diferem emgrande parte na distância Cu-Cu e na distorção piramidal desta geometria.Estado T - tensoEstado R - relaxadoFormas R e T
  9. 9. A ligação reversível ao oxigénio é feita através de umcentro de cobre binuclear geralmente referido como centro decobre de ‘tipo III’.Mecanismo de transporte
  10. 10. Durante a coordenação do O₂,há uma reorientação dos ligandos quealtera a geometria de coordenaçãopara piramidal quadrada. Estaalteração do campo de ligando alterae destabiliza as orbitais ativas docobre, favorecendo a transferênciaeletrónica.Mecanismo de transporte
  11. 11. Ligação/ Libertação do O₂
  12. 12. ΔHLigação/ Libertação do O₂
  13. 13. Na oxihemocianina os dois iões cobre estão soba forma Cu2+, levando a que o O₂ seja reduzido pelos 2eletrões, para O₂²¯.No complexo binuclear, ambos os cobres(II) têmum geometria piramidal quadrada com duas ligações de2,0 Å a 2 histidinas, pelo átomo de azoto, no planoequatorial. Cada uma das outras histidinas está emposição trans-axial aos centros de cobre a uma distânciade 2,4 Å.Alterações Estruturais
  14. 14. Estrutura do sítio ativo daoxihemocianina da espécie L.polyphemus. Os azotos ligadosdirectamente ao centro de cobreestão numerados. Os maisdistanciados são os ligandos trans-axiais. Rasmol, 1OXY.Estrutura do sítio ativo dadesoxihemocianina da espécie L.polyphemus. Rasmol, 1LLA.Alterações Estruturais
  15. 15. O espectro de absorção da oxihemocianina exibeuma transição muito intensa a 350 nm (ε≈20000M¯¹cm¯¹) e uma banda mais fraca a 550 nm (ε≈1000 M¯¹cm¯¹) que são atribuídas às transferênciade carga Ligando-Metal, O₂²¯ Cu(II)Geometria do centro metálico
  16. 16. A banda de maior energia é atribuída àtransição πσ*(O22-) dx2-y2 (Cu(II)) e a maisbaixa à transição πv*(O22-) dx2-y2(Cu(II)),onde πσ* é a orbital da espécie O22- no planoCu₂O₂ (ligação σ aos centros metálicos deCu(II)) enquanto a orbital πv* éperpendicular a esse plano.Geometria do centro metálico
  17. 17. EPR- Silencioso na forma oxigenadae desoxigenadaEXAFSDistância entre catiões de cobreOxihemocianina - 3,6 ÅDesoxihemocianina - 3,5 a 4,6 ÅEsfera de coordenaçãoOxihemocianina - 3 átomos de azoto e 2àtomos de oxigênioDesoxihemocinanina - 3 átomos deazotoOxihemicianinaDesoxihemocianinaRessonância Paramagnética Eletrónica (EPR) eEspetroscopia Alargada da Estrutura Fina deAbsorção de Raios X (EXAFS)
  18. 18. • Theodor SvedbergDescobriu a metaloproteína na espécie decaracol, Helix pomatia.• Anne VolbedaPrimeira investigadora a estudar a estruturada hemocianina.• Edward SolomonPrincipal investigador da geometria do centrometálico da Hemocianina.PrincipaisInvestigadores
  19. 19. A KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin, é uma metaloproteína,composta por várias subunidades da hemocianina, encontradana hemolinfa do molusco californiano, Megathura crenulata.Megathura crenulata, molusco deonde é retirado a KLH.AplicaçõesBiotecnológicasAplicações:• Transporte de proteínas• Terapia em cancro
  20. 20. • Sullivan B., Bonaventura J., Bonaventura C., Functional Differences in the Multiple Hemocyanins of the HorseshoeCrab, Limulus polyphemus L., Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 71, No. 6, pp. 2558-2562, June 1974.• Elena Borghi, Pier Lorenzo Solari, et. al, Oxidized Derivatives of Octopus vulgaris and CarcinusaestuariiHemocyanins at pH 7.5 and Related Models by X-rayAbsorption Spectroscopy, Biophysical Journal, Volume82, pp. 3254–3268, June 2002.• Bonaventura J., Bonaventura C., et. al, Cristal Structure of deoxygenated Limulus polyphemus subunit IIhemocyanin at 2.8 Å resolution: Clues for a mechanism for allosteric regulation, Cambridge University Press,Protein Science, 2, pp. 597-619, 1993.• Edward I. Solomon, Electronic And Geometric Structure-Function correlations of the coupled binuclear copperactivesite, Pure & Appi. Chem., Vol. 55, No. 7, pp. 1069-1088, 1983.• Metz M.,Solomon E. I. J Am. Chem. Soc., 123, 4938-4950, 2001.• Solomon E. I. Pure & Appi. Chem., 55, 1069-1088, 1983.• Rubino J. T.; Franz K. J. J. Inor. Chem., 107, 129-143, 2012.• Frieden E., Osaki S., Kobayashi H., Correlations between structure and function of the copper oxidases, The Journalof General Physiology, pp. 213-252, 1964.• W. Tröger, et al., Coordination Studies of the Metal Center of Hemocyanin by 199mHg Nuclear QuadrupoleInteraction, Z. Naturforsch., 57 a, 623–626, 2002.• Grace O. Tan, X-RAY Absorption Spectroscopic Studies of the Active sites of Nickel and Copper containingMetalloproteins, June 1993• Ali S.A., et. al, Oxygen transport proteins III: Structural studies of the scorpion (Buthus sindicus) hemocyanin, partialprimary structure of its subunit Bsin1, Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol., 126(3), pp 361-376, Julho 2000.• Harris J.R., Markl J., Keyhole limpet hemocyanin (KLH): a biomedical review, Micron, 6, pp. 597-623, Dezembro1999Referências Bibliográficas

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