Gabriel PintoJoão RibeiroPedro RuasGrupo 6 P2Laboratório de Bioquímica e BiofísicaLicenciatura em BioquímicaAno lectivo 20...
Contextualização do temaA H. pylori é uma bactéria patogénicaGram-negativa que reside no estômagohumano, podendo levar ao ...
Contextualização do temaMaturação da UreaseCarboxilação pós-tradução dosítio activo que contém umresíduo de lisinaInserção...
Construção dos vectores de expressãoSequências codificantes de UreF, UreG e UreH foram amplificadas do DNAgenómico da bact...
Purificação e ExpressãoPurificação da UreF• As bactérias cresceram a 370C e induzidas com 0,4 nM de IPTG;• Foram sujeitas ...
• Após a remoção do sedimento por centrifugação, o sobrenadante foicolocado numa coluna His-trap de 5 mL.• Após lavagem co...
• Primeiros passos seguem o mesmo procedimento que para a UreF.• O complexo UreF-UreH foi purificado, colocando o lisado n...
• GST foi separada do complexo, usando uma protease.• A mistura voltou a ser colocada na coluna, e GST ligou-se à coluna, ...
Para cristalização, a UreF e o complexo UreF-UreH foram concentrados a 10mg/mL.• Os cristais cresceram em 100mM BisTris, p...
• Os cristais do complexo UreF-UreH cresceram em 0,1mM MES, pH6.0, 16% PEG 4000, e 0,15mM sulfato de amónio.• Foram crioco...
• UreH expressa sozinha forma corpos deinclusão (pellet).• UreH, quando co-expressa com GSTpermanece insolúvel.• UreH, qua...
• Para este ensaio, a fracção solúvel foi colocada numa coluna GST-trap, equilibrada com tampão B.• Após extensiva lavagem...
• UreH elui unicamente com GST-UreF.• Na linha 1, observa-se degradação de bandas,indicando que os resíduos C-terminais nã...
Resultados – GST pulldown assay• UreH não elui com GST-UreF(ΔC20)• UreH não elui com GST-UreF(C24)• No entanto, na linha 5...
Estrutura tridimensional do complexoEstrutura da UreH - verde17 cadeias β2 α-hélices próximasdo C-terminalFolha β1 Folha β...
Estrutura tridimensional do complexo
As estruturas da UreF antes e depois daformação do complexo são largamentesobreponíveis.Alterações• Reordenação dos resídu...
Estabilização do complexo UreF-UreH
Alterações• Interacções por pontes de hidrogénio entreo grupo guanidina da Arg-250UreF, o Glu-119UreF e o oxigénio do grup...
Alterações• Desenrolamento da primeira ‘turn’ dahélice α2UreF .• Grupos amida da Ser-51 e Gly-53formam pontes de hidrogéni...
Células bacterianas expressando UreG foram misturadas com célulasCo-expressando GST-UreF e UreH Co-expressando GST-UreF un...
A UreG co-eluiu com a GST-UreF eUreH, mas não com a GST-UreF.A UreF interage com ocomplexo, e não unicamentecom a UreF.For...
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Ambas as variantes co-eluíram coma UreH, mas não com a UreG.A formação da F-cauda loop e a Tyr-48UreF são essenciais para ...
Maturação da UreaseEstudos feitos a partir de ‘static light scattering’ sugerem que o complexo UreF-UreHexiste sob a forma...
Maturação da UreaseA actividade da urease foi detectada no caso depHpA2H, mas não no caso da pHpAB.A urease foi unicamente...
Na ausência da UreF, os resíduoshidrofóbicos podem destabilizar a proteína ecausar agregação, levando à formação decorpos ...
Não se sabe ao certo como aurease interage com o complexo de pré-activação.No complexo UreF-UreD doK.aerogenes, o N-termin...
UreF-UreH comporta-secomo um dímero emsoluçãoO estado oligoméricopermanece inalteradoA simetria em 2-fold presente naUreF-...
Só existe uma única simetria 2-fold naestrutura dodecamérica da urease da H.pylori.A única explicação plausível para a lig...
A UreG tem um motivo de ligação ao ião níquel bastante conservado, comprovado pormutagénese, essencial para a entrega de n...
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Assembly of Preactivation Complex for Urease Maturation in Helicobacter pylori

  1. 1. Gabriel PintoJoão RibeiroPedro RuasGrupo 6 P2Laboratório de Bioquímica e BiofísicaLicenciatura em BioquímicaAno lectivo 2012/2013Fong, Y. H., Wong, H. C., Chuck, C. P., Chen, Y. W., Sun, H. & Wong, K.-B. (2011).Journal of Biological Chemistry, 286: 43241-43249
  2. 2. Contextualização do temaA H. pylori é uma bactéria patogénicaGram-negativa que reside no estômagohumano, podendo levar ao aparecimentode úlceras.A sobrevivência desta espécie em meioácido é feita a partir da actividade daurease.A urease transforma a ureia do ácidogástrico em amoníaco, neutralizando opH.
  3. 3. Contextualização do temaMaturação da UreaseCarboxilação pós-tradução dosítio activo que contém umresíduo de lisinaInserção dos 2 iões níquel,necessários para a catálise.Sinergia de 4 proteínas acessórias – UreE,UreF, UreG e UreHPretende-se obter um modelo topológico do complexo de pré-activaçãoUreG-UreF-UreH, responsável pela maturação da urease.
  4. 4. Construção dos vectores de expressãoSequências codificantes de UreF, UreG e UreH foram amplificadas do DNAgenómico da bactéria por PCR.UreHpRSFDuetpRSF-UreHUreGpRSFpRSF-UreGUreFpHisSUMOpHisSUMO-UreFGST-tagged UreFpGEX-6P1pGEX-UreFOs mutantes GST-UreF(ΔC20), GST-UreF(Y48A) e GST-UreF(R250A) foram obtidos apartir de GST-UreF, por PCR.
  5. 5. Purificação e ExpressãoPurificação da UreF• As bactérias cresceram a 370C e induzidas com 0,4 nM de IPTG;• Foram sujeitas a centrifugação 8000g a 40C durante 5 minutos;• Foram lisadas por sonicação no tampão A.• A HisSUMO-UreF foi expressa em E.coli. com ampicilina ecloranfenicol;Tampão A – 20 mM Tris/HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 1mM PTTA e 40 mM imidazole.
  6. 6. • Após a remoção do sedimento por centrifugação, o sobrenadante foicolocado numa coluna His-trap de 5 mL.• Após lavagem com tampão A, a HisSUMO-UreF foi eluída com300mM de imidazole.• A cauda de histidinas foi clivada por uma protease, separando-se daUreF.• A mistura voltou a ser colocada na coluna. As histidinas ligaram-se, mas a UreF não, saindo no fundo da coluna.• A UreF foi, mais tarde, purificada por cromatografia de exclusãomolecular.Purificação e ExpressãoTampão A – 20 mM Tris/HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 1mM PTTA e 40 mM imidazole.
  7. 7. • Primeiros passos seguem o mesmo procedimento que para a UreF.• O complexo UreF-UreH foi purificado, colocando o lisado numa coluna deGST-trap, equilibrado com tampão B.• Após lavagem com tampão B, o complexo GST-UreF-UreH foi eluído usando10mM de glutationa.Purificação e ExpressãoPurificação do complexo UreF-UreHTampão B – 20 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, e 5mM DTT.
  8. 8. • GST foi separada do complexo, usando uma protease.• A mistura voltou a ser colocada na coluna, e GST ligou-se à coluna, saindo ocomplexo UreF-UreH no fundo.• O complexo foi, mais tarde, purificado por cromatografia de exclusão molecular.Purificação e Expressão
  9. 9. Para cristalização, a UreF e o complexo UreF-UreH foram concentrados a 10mg/mL.• Os cristais cresceram em 100mM BisTris, pH=7,0 e 28% PGME 5000 a 16ºC.• Foram crioconservados numa imersão líquida 15% glicerol, antes de seremguardados.• Foram, depois, submetidos a um gerador de raios-X, com resolução 2.50 Å paradeterminação da sua estrutura.Cristalização e Determinação da EstruturaCristalização UreF
  10. 10. • Os cristais do complexo UreF-UreH cresceram em 0,1mM MES, pH6.0, 16% PEG 4000, e 0,15mM sulfato de amónio.• Foram crioconservados com 15% glicerol.• Foram, mais tarde, submetidos ao gerador de raios-X, com resolução 2.50Å, para determinação da sua estrutura.Cristalização e Determinação da EstruturaCristalização do Complexo UreF-UreH
  11. 11. • UreH expressa sozinha forma corpos deinclusão (pellet).• UreH, quando co-expressa com GSTpermanece insolúvel.• UreH, quando co-expressa com GST-UreF, édetectada na fração solúvelHá algum tipo de interacção entre a UreH e a UreF.ResultadosApós lise celular por sonicação, as fracção solúvel, S, e o precipitado, P, foramanalisados por SDS-12,5% PAGE com corante azul de Coomassie.
  12. 12. • Para este ensaio, a fracção solúvel foi colocada numa coluna GST-trap, equilibrada com tampão B.• Após extensiva lavagem com tampão B, foi eluída com 10mM deglutationa.• A proteína eluída foi analisada em SDS-12,5% PAGE, com corante azul deCoomassie.Resultados – GST pulldown assayTampão B – 20 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, e 5mM DTT.
  13. 13. • UreH elui unicamente com GST-UreF.• Na linha 1, observa-se degradação de bandas,indicando que os resíduos C-terminais não estavamprotegidos.Resultados – GST pulldown assay2 VariantesGST-UreF(ΔC20) GST-UreF(C24)Corte dos resíduosC-terminaisFusão dosresíduos 231-254ao C-terminal doGST
  14. 14. Resultados – GST pulldown assay• UreH não elui com GST-UreF(ΔC20)• UreH não elui com GST-UreF(C24)• No entanto, na linha 5, aparece degradação debandas.Os resíduos C-terminais nãoestavam protegidos contra adegradação
  15. 15. Estrutura tridimensional do complexoEstrutura da UreH - verde17 cadeias β2 α-hélices próximasdo C-terminalFolha β1 Folha β2β1, β2, β5, β , β11,β13 e β14β3, β4, β6, β7 , β9,β10, β12 ,β15,β16,β17• Cadeias β4-β13 dobram e formam uma β-hélice• α1 e α2 encontram-se contra as cadeiasantiparalelas β15 – β17Motivo α/β no C-terminal da β-hélice
  16. 16. Estrutura tridimensional do complexo
  17. 17. As estruturas da UreF antes e depois daformação do complexo são largamentesobreponíveis.Alterações• Reordenação dos resíduos C-terminais, formando a hélice α10UreF eum loop estruturado.• A hélice α10UreF está envolvida nainteracção com a UreH.• A estrutura em F-tail loop é estabilizadapor várias interacções.Alterações Conformacionais
  18. 18. Estabilização do complexo UreF-UreH
  19. 19. Alterações• Interacções por pontes de hidrogénio entreo grupo guanidina da Arg-250UreF, o Glu-119UreF e o oxigénio do grupo carbonilo daHis-244UreF actuam como um grampo quesegura a F-tail loop na sua posição.Os resíduos C-terminais da UreF nocomplexo UreF-UreH estão protegidoscontra a degradação, ao contrário com oque acontece na forma livre.Alterações Conformacionais
  20. 20. Alterações• Desenrolamento da primeira ‘turn’ dahélice α2UreF .• Grupos amida da Ser-51 e Gly-53formam pontes de hidrogénio com ogrupo carboxilato do resíduo C-terminal(Ser-254UreF).No complexo UreF-UreH, a Tyr-48UreFfica expostaAlterações Conformacionais
  21. 21. Células bacterianas expressando UreG foram misturadas com célulasCo-expressando GST-UreF e UreH Co-expressando GST-UreF unicamente• Após cetrifugação, o lisado solúvel foi colocado numa coluna GSTtrap.• Após lavagem extensiva, a proteína foi eluída, usando 10 mM de glutationa.• A proteína foi analisada por SDS-12,5% PAGE com corante azul de Coomassie.Formação do complexo heterotriméricoUreG-UreF-UreH
  22. 22. A UreG co-eluiu com a GST-UreF eUreH, mas não com a GST-UreF.A UreF interage com ocomplexo, e não unicamentecom a UreF.Formação do complexo heterotriméricoUreG-UreF-UreH
  23. 23. GST-UreF(R250A)Há uma quebra das duaspontes de hidrogénio queestabilizam a F-tail loopGST-UreF(Y48A)Testar se o resíduo Tyr-48UreFestá envolvido na ligação àUreG.Formação do complexo heterotriméricoUreG-UreF-UreHSubstituição dearginina por alaninaSubstituição detirosina por alanina
  24. 24. Ambas as variantes co-eluíram coma UreH, mas não com a UreG.A formação da F-cauda loop e a Tyr-48UreF são essenciais para a ligaçãoda UreG.Formação do complexo heterotriméricoUreG-UreF-UreH
  25. 25. Maturação da UreaseEstudos feitos a partir de ‘static light scattering’ sugerem que o complexo UreF-UreHexiste sob a forma de dímero, em solução.• O vector pHpAB contém os genes UreA e UreB –controlo negativo.• O vector pHpA2H contém também os genesUreF, UreG e UreH.Analisa-se a quantidade de amoníacoproduzido, proporcional à actividade a urease.
  26. 26. Maturação da UreaseA actividade da urease foi detectada no caso depHpA2H, mas não no caso da pHpAB.A urease foi unicamente activada na presença dasproteínas acessórias.pHpA2H-UreF(ΔC20)pHpA2H-UreF(Y48A)pHpA2H-UreF(R250A)A actividade diminuiusignificativamente
  27. 27. Na ausência da UreF, os resíduoshidrofóbicos podem destabilizar a proteína ecausar agregação, levando à formação decorpos de inclusão.Discussão dos ResultadosNa ligação da UreF com aUreH, ocorrem mudanças conformacionais quelevam à ligação da UreG e à formação docomplexo heterotrimérico UreG-UreF-UreH, essencial para a maturação da urease.
  28. 28. Não se sabe ao certo como aurease interage com o complexo de pré-activação.No complexo UreF-UreD doK.aerogenes, o N-terminal da UreF, localizadono lado oposto da ligação da UreG, liga com asubunidade β da urease.Discussão dos Resultados
  29. 29. UreF-UreH comporta-secomo um dímero emsoluçãoO estado oligoméricopermanece inalteradoA simetria em 2-fold presente naUreF-UreH implica que a mesmasimetria deva estar presente no localde ligação da urease.Discussão dos ResultadosEstudos feitos a partir de ‘static lightscattering’ sugerem que o complexo UreF-UreH existe sob a forma de dímero, emsolução.
  30. 30. Só existe uma única simetria 2-fold naestrutura dodecamérica da urease da H.pylori.A única explicação plausível para a ligaçãoentre o complexo UreG-UreF-UreH e a ureaseé ilustrada na figura ao lado.Observa-se, também, que o comprimentodo complexo UreF-UreH é muito próximo dadistância entre os locais activos da urease,onde se encontram os iões níquel.Discussão dos Resultados
  31. 31. A UreG tem um motivo de ligação ao ião níquel bastante conservado, comprovado pormutagénese, essencial para a entrega de níquel.A UreG está localizada a uma distância significativado sítio activo da urease.O ião níquel é transferido da UreGvia UreF-UreH para o sítio activo daurease.Análise de ‘chemical cross-linking’ sugere queo domínio β da urease sofre uma dobraaquando da ligação ao complexo UreF-UreH.Hipóteses sugeridas
  32. 32. Gabriel PintoJoão RibeiroPedro RuasGrupo 6 P2Laboratório de Bioquímica e BiofísicaLicenciatura em BioquímicaAno lectivo 2012/2013

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