Cepas causadoras de doenças Moko de Ralstonia solanacearum do
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INTRODUÇÃO
Fonte:CellierePrior(2011)
Fonte:EMBRAPA
Fonte:EMBRAPA
Ralstonia solanacearum
INTRODUÇÃO
 Cepas R. solanacearum raça 2 biovar 1
 Praga quarentenária : - Amazonas,
Presente (A2) - Pará,
- Rondônia,
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INTRODUÇÃO
Cosmopolita + Diversidade genética
classificados características fenotípicas e propriedades
genéticas
Raça e bi...
INTRODUÇÃO
PORÉM...
COMPLEXO
Ralstonia solanacearum
R. syzygii Doença Bactéria Sangue (BDB)
INTRODUÇÃO
 2000 - Fegan e Priore : Classificação hierárquica
 quatro filotipos e 52 sequevars
- Fiotipo I = linhagens d...
INTRODUÇÃO
Moko :
- Filotipo II e subdivididos em linhagens IIA e IIB
- Quatro sequevars distintas:
II-6,
II-24,
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INTRODUÇÃO
SINTOMAS
amarelecimento e murcha das folhas
Frutos deformado
polpa podridão seca
Fonte:EMBRAPA
OBJETIVO
Explorar a diversidade patogênica e
filogenética de linhagens de R.
solanacearum que se origina no Brasil
MATERIAIS E MÉTODOS
Cepas
QUANTIDADE ORIGEM LOCAL
27 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia MANAUS
7
Coleção de Culturas de Fitobacterias...
TIPAGEM DE DNA
Culturas bacterianas cultivadas em meio
Kelman a 29 º C durante 48 h
Fonte:EMBRAPA
EXTRAÇÃO
 Kit AxyPrep bacteriana Genomic DNA Miniprep
 reação em cadeia da polimerase multiplex específico-
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 DNA parcial da endoglucanase (EGL)
 Amplificação da região de 750 bp do gene EGL:
- Endo-F (5'-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3 ...
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- RsF1570-(5'--ACAGCGCCTTGAGCCGTACA 3 ')
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TIPAGEM DE DNA
 electroforese sobre um gel de agarose
 Sequenciamento por Macrogen (Seul, Coreia do Sul).
TIPAGEM DE DNA
 Árvores filogenéticas: software ARB
 A reconstrução filogenética das linhagens: software PhyML
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Teste de patogenicidade
BANANA
 Micropropagação
 As mudas foram cultivadas em vasos de plástico de 500 ml
 Inoculadas p...
Teste de patogenicidade
TOMATE
 mudas da cultivar Santa Clara
 Cultivadas em potes de plástico 500 ml
 inoculados pelo ...
A patogenicidade do isolado foi gravado utilizando um
critério qualitativo, ou seja, (-) para as plantas livres de
sintoma...
RESULTADOS
282 bp e 372 bp
IIB-25 : Batata (Peru)
IIA-53
IIA-41: Tomate
(Camarões)
mutS: IIA-24
EGL: IIA-53
Distinto no
cluster IIB –
Banana
(Indonesia,
Honduras e
Costa Rica
1= IIA-6
5= IIA-24
6= IIA-41
CONCLUSÃO
 Todas as cepas de R. solanacearum brasileira causadoras da doença do
Moko testados neste estudo foram patogêni...
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Cepas causadoras de doenças do moko de

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  • Essas cepas são historicamente conhecidos como R. solanacearum raça 2, biovar 1, que é uma praga quarentenária (EPPO lista A2) encontrado no Brasil que só ocorre no Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima, Pernambuco e Sergipe
  • com uma ampla gama de hospedeiros e incomum diversidade genética
    Devido a essa extraordinariamente grande diversidade de estirpes, R. solanacearum foi historicamente classificados de acordo com características fenotípicas e propriedades genéticas
  • O complexo de espécies Ralstonia solanacearum inclui R. solanacearum, R. syzygii, ea doença Bactéria Sangue (BDB). Todos colonizar vasos do xilema da planta e causar doenças murcha, mas com diferenças biológicas significativas. R. solanacearum é uma bactéria que infecta habitantes do solo nas raízes de uma vasta gama de plantas. R. syzygii causa a doença Sumatra de árvores de cravo e está ativamente transmitida por insetos cercopoid. BDB também é patogênico para um único host, banana, e é transmitida por insetos polinizadores.Estudos de hibridização e seqüenciamento de DNA-DNA indicaram que, apesar de suas diferenças fenotípicas, esses três patógenos de plantas são realmente muito intimamente relacionados, caindo no subgrupo Phylotype IV do R. complexo de espécies solanacearum.
  • raça e biovar classificações não pode espelhar a ampla diversidade genética das diferentes cepas que compõem o complexo de espécies R. solanacearum
    Esta questão foi abordada na década de 2000 e resultou em um esquema de classificação hierárquica por Fegan e Prior (3). Esta classificação consistiu em quatro filotipos que tiveram como base as origens geográficas das cepas e 52 sequevars, que são grupos de cepas com regiões altamente conservadas em uma endoglucanase parcial (EGL) seqüência nucleotídica (26) e clones. Os filotipos foram correlacionados com a sua origem geográfica: phylotype I incluído linhagens da Ásia, phylotype II incluiu cepas da América, phylotype III cepas incluídas da África e do Oceano Índico e phylotype IV incluído cepas da Indonésia, Japão e Austrália (22). A classificação como filotipos e sequevars são definições de trabalho (22) que são actualmente aceites pela comunidade científica como
    Os filotipos pode ser determinada a partir de uma análise filogenética do gene da endoglucanase (EGL) ou gene de reparo do DNA (mutS) e rotineiramente por multiplex PCR com oligonucleotídeos série Nmult (sua região do 16S-23S rRNA), que foi proposto por Fegan e Prior (3).
  • Todas as cepas causadoras de doenças Moko são filogeneticamente distribuído dentro phylotype II (origem americana) e subdivididos em linhagens IIA e IIB (1, 4). Mais especificamente, a literatura indicou a natureza do agente patogénico parafiléticos Moko que é distribuída em quatro sequevars distintas: II-6, II-24, II-B e II-B-3-4 (1, 3, 4). As sequevars são também uma definição funcional e subdivisão das filotipos e baseiam-se em menos de um desvio de 1% da sequência nucleotídica do gene egll (3, 21). A detecção de rotina do ecótipo Moko pode ser conseguido por PCR multiplex (Mmx-PCR), que distingue cada sequevar das estirpes da doença Moko: II-6, II-24, II-B e II-B-3-4 (3).
  • Os sintomas típicos da doença Moko na natureza incluem amarelecimento e murcha das folhas internas causadas pela infecção, que inicia nos rizomas e se move em direção ao pseudocaule e frutos são então deformado, ficar preta e murchar. Bananas perto de maturidade pode não apresentar sintomas aparentes, mas a polpa interior ainda pode apresentar podridão seca e as plantas podem morrer.
  • Estudos de diversidade são essenciais para a adaptação de estratégias ou desenvolvimento de novas estratégias baseadas em germoplasma de resistência que ainda têm de ser desenvolvidas de controle. Determinar a variabilidade genética e fenotípica das cepas causadoras de doenças Moko é de extrema importância; no entanto, esta variabilidade continua a ser descrito na América do Sul (4), principalmente no Brasil (20). O objetivo deste estudo é explorar a diversidade patogênica e filogenética de linhagens de R. solanacearum que se origina no Brasil, onde murcha recente apareceu de banana (Musa sp.) E helicônia (Heliconia sp.) Plantas em diferentes áreas de produção.
  • A extração do DNA genômico bacteriano foi realizada com o Kit AxyPrep bacteriana Genomic DNA Miniprep (Axygen Biosciences, Union City, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. Estirpe tipagem foi realizada por uma reacção em cadeia da polimerase multiplex específico-phylotype (Pmx-PCR), que caracterizou a espécie pertença a do complexo de R. solanacearum e filotipos (3); estirpes pertencentes ao phylotype II foram ainda caracterizados por PCR multiplex específico para as estirpes causadoras de doenças Moko (Mmx-PCR) (3, 28).
  • Amplificação por PCR e sequenciamento de DNA parcial da endoglucanase (EGL) e reparo do DNA (genes) mutS. A amplificação por PCR de uma região de 750 pb do gene egll foi realizada utilizando o par de iniciadores de Endo-F (5'-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3 ') e Endo-R (5'-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3') (21). A mistura de reacção (volume total de 50 ul) continha 1x PCR Master Mix (Thermo Scientific, San Jose, EUA), 0,5 uM de iniciadores e 100 ng de ADN. As misturas de reacção foram aquecidas durante 9 min a 96 º C, seguido de 30 ciclos de (95 º C durante 1 min, 55 º C durante 40 s e 72 º C durante 2 min), com um passo de extensão final de 10 min a 72 º C. A amplificação do fragmento de 758 pb do gene mutS foi realizada num volume total de 50 pi que continha 1x PCR Master Mix, DMSO a 2,5%, 100 ng de ADN e 1 fiM de primers mutS RsF1570-(5'--ACAGCGCCTTGAGCCGTACA 3 ') e mutS-RsR1926 (5'-GCTGATCACCGGCCCGAACAT-3') (28). As misturas de reacção foram aquecidas durante 5 min a 96 º C, seguido de 35 ciclos de (94 º C durante 1 min, 66 º C durante 1 min e 72 º C durante 90 s) com um passo de extensão final de 5 min a 72 º C.
  • Os produtos de PCR foram submetidos a electroforese sobre um gel de agarose a 1,5% em tampão TBE 0,5 x, juntamente com o segmento de ADN GeneRuler pb 100. A purificação dos produtos de PCR foi realizada com o PCR Clean-up Kit (Axygen Biosciences, Union City, EUA) e cadeias duplas foram sequenciados por Macrogen (Seul, Coreia do Sul).
  • amplamente cultivada no Brasil e suscetíveis à murcha bacteriana.
    SUBSTRATO COMERCAL
    mantidos em uma estufa com temperatura média e os valores de umidade relativa de 38 ± 2 º C e 88%
  • Cepas causadoras de doenças do moko de

    1. 1. Cepas causadoras de doenças Moko de Ralstonia solanacearum do Brasil ampliando a diversidade conhecida no filotipo parafiléticos II Greecy M. R. Albuquerque, et al Apresentação: Lourdes Regina Lopes Batista
    2. 2. INTRODUÇÃO Fonte:CellierePrior(2011) Fonte:EMBRAPA Fonte:EMBRAPA Ralstonia solanacearum
    3. 3. INTRODUÇÃO  Cepas R. solanacearum raça 2 biovar 1  Praga quarentenária : - Amazonas, Presente (A2) - Pará, - Rondônia, - Roraima, - Pernambuco - Sergipe Fonte:EMBRAPA
    4. 4. INTRODUÇÃO Cosmopolita + Diversidade genética classificados características fenotípicas e propriedades genéticas Raça e biovar
    5. 5. INTRODUÇÃO PORÉM... COMPLEXO Ralstonia solanacearum R. syzygii Doença Bactéria Sangue (BDB)
    6. 6. INTRODUÇÃO  2000 - Fegan e Priore : Classificação hierárquica  quatro filotipos e 52 sequevars - Fiotipo I = linhagens da Ásia, - Fiotipo II = cepas da América - Fiotipo III = cepas da África e do Oceano Índico - Fiotipo IV = cepas da Indonésia, Japão e Austrália
    7. 7. INTRODUÇÃO Moko : - Filotipo II e subdivididos em linhagens IIA e IIB - Quatro sequevars distintas: II-6, II-24, II-B II-B-3-4
    8. 8. INTRODUÇÃO SINTOMAS amarelecimento e murcha das folhas Frutos deformado polpa podridão seca Fonte:EMBRAPA
    9. 9. OBJETIVO Explorar a diversidade patogênica e filogenética de linhagens de R. solanacearum que se origina no Brasil
    10. 10. MATERIAIS E MÉTODOS
    11. 11. Cepas QUANTIDADE ORIGEM LOCAL 27 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia MANAUS 7 Coleção de Culturas de Fitobacterias do Instituto Biológico SÃO PAULO 2 Coleção de Culturas do Laboratório Fitobacteriologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco RECIFE 1 Embrapa Tabuleiros Costeiros ARACAJU
    12. 12. TIPAGEM DE DNA Culturas bacterianas cultivadas em meio Kelman a 29 º C durante 48 h Fonte:EMBRAPA
    13. 13. EXTRAÇÃO  Kit AxyPrep bacteriana Genomic DNA Miniprep  reação em cadeia da polimerase multiplex específico- phylotype (Pmx-PCR): - Espécie do complexo de R. solanacearum e filotipos - Estirpes pertencentes ao Filotipo II causadoras do Moko TIPAGEM DE DNA
    14. 14.  DNA parcial da endoglucanase (EGL)  Amplificação da região de 750 bp do gene EGL: - Endo-F (5'-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3 ') - Endo-R (5'-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3')  A mistura de reação: - Aquecidas durante 9 min a 96 º C, seguido de 30 ciclos de (95 º C durante 1 min, 55 º C durante 40 s e 72 º C durante 2 min), com um passo de extensão final de 10 min a 72 º C. TIPAGEM DE DNA
    15. 15.  A amplificação do fragmento de 758 bp do gene mutS  primers mutS: - RsF1570-(5'--ACAGCGCCTTGAGCCGTACA 3 ') -RsR1926 (5'-GCTGATCACCGGCCCGAACAT-3')  As misturas de reação: -Aquecidas durante 5 min a 96 º C, seguido de 35 ciclos de (94 º C durante 1 min, 66 º C durante 1 min e 72 º C durante 90 s) com um passo de extensão final de 5 min a 72 º C. TIPAGEM DE DNA
    16. 16. TIPAGEM DE DNA  electroforese sobre um gel de agarose  Sequenciamento por Macrogen (Seul, Coreia do Sul).
    17. 17. TIPAGEM DE DNA  Árvores filogenéticas: software ARB  A reconstrução filogenética das linhagens: software PhyML  GenBank
    18. 18. Teste de patogenicidade BANANA  Micropropagação  As mudas foram cultivadas em vasos de plástico de 500 ml  Inoculadas por injecção de 1 ml de uma suspensão de R. solanacearum  Temperatura média de 36 ± 2 º C e umidade relativa média de 85%  Observações por 40 dias
    19. 19. Teste de patogenicidade TOMATE  mudas da cultivar Santa Clara  Cultivadas em potes de plástico 500 ml  inoculados pelo método ferida raiz  temperatura média 38 ± 2 º C e umidade relativa de 88%,  avaliadas durante 30 dias.
    20. 20. A patogenicidade do isolado foi gravado utilizando um critério qualitativo, ou seja, (-) para as plantas livres de sintomas e (+) para murcha ou plantas mortas.
    21. 21. RESULTADOS
    22. 22. 282 bp e 372 bp
    23. 23. IIB-25 : Batata (Peru) IIA-53 IIA-41: Tomate (Camarões)
    24. 24. mutS: IIA-24 EGL: IIA-53 Distinto no cluster IIB – Banana (Indonesia, Honduras e Costa Rica
    25. 25. 1= IIA-6 5= IIA-24 6= IIA-41
    26. 26. CONCLUSÃO  Todas as cepas de R. solanacearum brasileira causadoras da doença do Moko testados neste estudo foram patogênicos a plantas de banana e apresentaram sintomas característicos da doença  Estes resultados salientam a grande diversidade de estirpes de Moko no Brasil,  reforçar a eficiência do gene EGL ao revelar as relações de diversidade genética causadoras da doença do Moko de R. solanacearum onde os grupos genéticos distintos foram descritos

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