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Fundo científico

  1. 1. Fundo científicoCélulas maduras podem ser reprogramadas para se tornar pluripotentesO Prêmio Nobel de 2012 de Fisiologia e Medicina é atribuído ao Dr. John B.Gurdon e ao Dr.ShinyaYamanaka por suas descobertas de que células adultasdiferenciadas, podem ser reprogramados para conter um estado celularpluripotente. Isso representa uma mudança de paradigma na nossacompreensão da diferenciação celular e da plasticidade do estadodiferenciado. Diferenciação celular aparece como um processounidirecional,onde as células indiferenciadas amadurecem para váriosdestinos de células especializadas, tais como os neurónios, músculos e célulasda pele. A opinião prevalente durante a primeira metade doséculo 20foi a deque as células maduras forampermanentemente bloqueadas no estadodiferenciado, e se tornaram incapazes de voltar para um estado totalmenteimaturo,estado de células pluripotentes estaminais. Em 1962, John B. Gurdonmudou radicalmente este ponto de vista, demonstrando queo núcleo de umacélula epitelial intestinal diferenciada de rã foi capaz de gerar um girinototalmentefuncional após o transplante para um óvulo sem núcleo. Estadescoberta quebrou o dogma de que a diferenciação celular só podia ser umprocesso unidirecional. A descoberta de Gurdon foi oponto de partida para oesforço da clonagem em vários organismos. No entanto, a questão, seumacélula intacta diferenciadapode ser totalmente reprogramada para se tornarpluripotentepermaneceu. Em 2006, por umprocedimento surpreendentementesimples, ShinyaYamanaka mostrou que a introdução de um pequeno conjuntodefatores de transcrição numa célula diferenciada era suficiente parareverter a célula para um estado pluripotente.As células resultantes foramchamadascélulas -troncopluripotentes induzidas (iPS). Juntos, Gurdon eYamanakatransformaram nossa compreensão da diferenciação celular. Elesdemonstraram que oestado diferenciado, geralmente muito estável , pode serdesbloqueado, porque abriga um potencial de reversãoa pluripotência. Essadescoberta introduziu fundamentalmente novas áreas de pesquisa, e oferecenovas oportunidades emocionantes para estudar mecanismos da doença.IntroduçãoDurante o desenvolvimento normal, as células procedem a partir do estadoinicial indiferenciado do ovo e de célulasno embrião inicial para um estadomais especializado. No organismo adulto uma gama de células diferenciadasde vários tipos são necessárias para executar as funções específicas realizadasno corpo adulto (Figura 1A). Oovo fertilizado e as células no zigoto sãototipotentes, em outras palavras, elas podem dar origem a todos os tiposdecélulas no embrião, bem como os tecidos, tais como placenta 1
  2. 2. extraembrionária. Como o desenvolvimentoprogride, as células na fase deblastocisto começam a tornar-se distinguíveis: a massa celular interna dáorigem ao embrião propriamente dito, enquanto que as células circundantestornam-se a linhagem de trofoblasto e são a fonte dos tecidos extra-embrionários. As células da massa celular interna são pluripotentes, isto é,eles podem darorigem a todas as células somáticas, bem como à linhagem decélulas germinativas: células destinadas a se tornarem gametas(Óvulos eespermatozóides).Durante esta viagem de desenvolvimento, as células tornam-seprogressivamente mais restritas em seu potencial de diferenciação e comoconsequência, elas não retêm pluripotência. A maioria das células madurassão células totalmente diferenciadas, as células-tronco, embora com potêncialimitada para permanecer em determinados locais no corpo servem como umafonte de reposição de células na medula óssea, intestino epele, porexemplo. As células diferenciadas são notavelmente estáveis e, como regra,não mudam o seu destino em outros tipos decélulas diferenciadas ou revertempara o tipo de células indiferenciadas que podem ser encontradas no início dodesenvolvimento doembrião. Por esta razão, o ponto de vista predominantefoio de que as células da linhagem somáticaestavam permanentemente em umestado bloqueado,de tal forma que o caminho de retorno a um estadoaltamente indiferenciado foi impossível. A percepção de que vários tipos decélulas diferenciadas foram dotadas de um padrão específico deproteínassugere que células diferenciadas podem transportar irreversíveis modificaçõesepigenéticas ou alterações genéticas que tornam impossível a indução depluripotência. Conrad Hal Waddington propôs umapaisagem epigenética demontanhas e vales como uma metáfora para o desenvolvimento. Dentro dessepanorama,células indiferenciadas, representadas como mármores, residem notopo de uma montanha. Durante a diferenciação elasescorrem em valesenergeticamente mais estáveis, de onde vêm para descansar como célulasdiferenciadas.A expectativa era de que seria difícil reverter as célulasdiferenciadas de voltaaoestado indiferenciado, movendo-as de volta para otopo da montanha (Waddington, 1957) (Figura 1B).Apesar do dogma, a noçãode que células especializadas poderiamde alguma forma ser desbloqueadas apartir de seuestado diferenciado e desdiferenciar-senão foi completamentedescartada. Várias estratégias foram consideradaspara resolver o problemaexperimentalmente . Por exemplo, Hans Spemann (Prêmio Nobel deFisiologiaou Medicina 1935) alimentaram a idéia de transferência de núcleos de célulasdiferenciadas paraum meio imaturo citoplasmático para testar seu potencial dedesenvolvimento. Ele se referiu a esta abordagem como uma"Experiênciafantástica". 2
  3. 3. Figura 1 O desenvolvimento normal de um ser humano a partir de um ovo fertilizadoque ilustra o processo unidirecional da maturação através do ovo e embrião para umser humano adulto. B, Waddington ilustraa diferenciação celular como uma paisagemepigenética no qual as células são vistas como bolinhas rolando em vales para chegarao seu destino final como células diferenciadas. A metáfora visualiza bem odesenvolvimento unidirecional do processo de desenvolvimento normal. As célulasnormalmente não voltam para o topo da montanha para chegar ao estadoindiferenciado, e também normalmente não atravessam outros vales para sedesenvolver em linhagens independentes.Reprogramação de um núcleo de células somáticas diferenciadasA tentativa direta para testar se as células diferenciadas na linhagem de célulassomáticas foram dotadas de umapotencial desdiferenciação latente foirealizada por Robert Briggs e King Thomas, quedesenvolveram umatecnologia para a transferência de núcleos de células somáticasindiferenciadase diferenciadaspara um ovo fertilizado enucleado nosanfíbios Ranapipiens (Briggs e King, 1952).Anfíbios são particularmentesensíveis a este tipo de experiência devido ao grande tamanho do ovoe odesenvolvimento de embriões extra-uterinos. Briggs e King mostraram queum núcleo embrionário,quando transferido para um óvulo sem núcleo, poderiade fato apoiar o desenvolvimento até a fase de girino.Em contraste, quando serepetiu o procedimento, com núcleos de células mais diferenciadas, falhou-sena obtenção de embriões em desenvolvimento. Assim, eles concluíram que osnúcleos diferenciados sofreram irreversíveismudanças durante a diferenciaçãode tal forma que a capacidade de promover o desenvolvimento foi perdida(King eBriggs, 1955).John B. Gurdon, que tinha treinado em embriologia com Michael Fischberg,em Oxford, usou um diferenteanfíbio, Xenopuslaevis em vezde Ranapipiens, para abordar o tema. Em Xenopus, Gurdon podetirarvantagem de um sistema de rastreio de células, desenvolvido porFischberg ecolegas (Elsdaleet al., 1958)que lhe permitiu diferenciar inequivocamente as 3
  4. 4. células derivadas de núcleos transplantados de células do embriãohospedeiro. Num estudo chave, por irradiação ultravioleta ovos enucleadosGurdon descobriu que quando os ovos foram transplantados com núcleos deepitélio intestinal diferenciado do girino, umpequeno número de girinosnadantes foram realmente gerados (Gurdon, 1962) (Figura 2). Ele podemostrar também que a eficiência da reprogramação nuclear pode sermelhorada grandemente através da realização de transplantes seriados. Poressa estratégia, ele mostrou que uma proporção considerável de todos osnúcleos celulares de epitélio intestinal puderam ser reprogramados (Gurdon,1962). Gurdon concluiu que núcleos de células somáticas diferenciadas tem opotencial de reverter a pluripotência. No entanto,ganhou ampla aceitação nacomunidade científica somente depois de passado um tempo consideráveldepois de suadescoberta. Nas experiências subsequentes, Gurdon usou núcleosde rãs adultas para gerar girinos e, inversamente, núcleos embrionáriosdiferenciados com desenvolvimento sustentado por sapos adultos (Gurdon eUehlinger, 1966; Laskey e Gurdon, 1970).A descoberta de Gurdon foi uma mudança fundamental de paradigma,mostrando pela primeira vez que o núcleo da célulaa partir de uma célulasomática diferenciada foi dotado com a capacidade de impulsionar odesenvolvimento completo em uma gama de tipos de células somáticas etecidos após serem colocados no meio citoplasmático de uma célula de ovo.Figura 2 John Gurdonutilizou luz UV (1) para destruir o núcleo da célula num ovo derã. Ele em seguida, substituiu o núcleo do ovopelo núcleo de célula a partir de umacélula epitelial intestinal diferenciada a partir de um girino (2) Muitos ovosmanipulados não se desenvolveram, mas em vários casos os girinos de natação normalforam gerados(3). Isto mostrou que a informação genética necessária para gerar ascélulas diferenciadas em um girino permaneceram intactas na célula doadora donúcleo. Estudos posteriores demonstraram que os mamíferos também podem serclonados por esta técnica (4). 4
  5. 5. Desenvolvimento de reprogramação por transferência nuclear A descoberta de Gurdonintroduziu um novo campo de pesquisa centrado natransferência nuclear somática(SCNT) como um método para compreenderreprogramação e como alterar as células quando se tornam especializadas.Em1997, o primeiro mamífero clonado, a ovelha Dolly, nasceu depois de umaSCNT de células mamárias epiteliais adultas para um ovo enucleado deovelhas (Wilmutet al., Nature, 1997). A estratégia experimental desenvolvidapor Ian Wilmut e Keith Campbell foi baseada no trabalho Gurdonem Xenopus, mas com adicionaladaptação técnica. Por exemplo, umamodificação importante foi que os núcleos usados para transplantação emmamíferos vieram a partir de células epiteliais da glândula mamaria induzidasa entrar quiescência, o que tornou as mesmas mais adequadas para sesincronizar com o embrião em desenvolvimento. Desde a clonagem deovelhas, em 1997, até agora SCNT foi usada para clonar uma infinidade deespécies de mamíferos, incluindo rato, vaca, porco, lobo e onçasafricanas. Através da transferência nuclear de núcleos de células a partirdecélulas B - e T –do sistema imunitário, apresentou provas conclusivas deque um núcleo de célula diferenciada com rearranjo deimunoglobulinaougenes de receptores celulares T, poderia ser reprogramado para apoiarodesenvolvimento de um rato (Hochedlinger e Jaenisch, 2002).Reprogramação de uma célula somática diferenciada intacta para setornar pluripotenteGurdon revelou que um núcleo de célula diferenciada tem a capacidade de sereverter com êxito a umestado indiferenciado, com um potencial para reiniciaro desenvolvimento. No entanto manteve-se uma questão em aberto, ou seja, seseria possível induzir reversão de uma célula intacta diferenciadaaum estado altamente imaturo. Muitos cientistas consideraram esta questãoimpossível, ou no mínimo, que a mesma requereria uma reorganização muitocomplexa na célula para desbloquear o estado diferenciado. Essa foi a cenaquandoShinyaYamanaka decidiu abordar o problema da reprogramação depluripotência.Yamanaka, que havia treinado tanto em cirurgia ortopédica ebiologia molecular, tornou-se interessado pelo estado pluripotente, em parte,pelo estudo das células-tronco embrionáriaspluripotentes (ES), caracterizadasprimeiramente por Martin Evans (Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de2007).O Laboratório de Yamanaka foca-se em fatores importantes para amanutenção de pluripotência em células-tronco embrionárias, comoERas(Takahashi et al., 2003) e identificação, em paralelo com o laboratório deAustin Smith, a pluripotênciado gene Nanog (Mitsui et al, 2003;.. Chamberset al, 2003). Yamanaka então embarcou na busca de induzir pluripotência emcélulas somáticas. Em seu trabalho e outros, que ele conheceu um grande 5
  6. 6. número de fatores de transcrição que foram expressos nas células ES comconfirmação ou suspeita de funções na manutenção do estadopluripotente. Além disso, as células ES foram conhecidas porinduzirpluripotência em núcleos de células somáticas depois de fusões decélulas induzidas por entre ES e células somáticas (Tada etal.,2001). Equipado com esta informação, Yamanaka selecionou um conjunto de24 fatores de transcrição celularde ES que ele considerou como candidatospara restabelecer pluripotência em células somáticas.Em uma experiência surpreendente, todos os 24 genes que codificam estesfatores de transcrição foram introduzidos emum passo em fibroblastos da pelee alguns deles realmente geraram colônias que mostraram umanotávelsemelhança com células-tronco embrionárias. O número de genes capazes deinduzir tais colônias foram reduzidas, uma - a - uma, para identificar umacombinação de apenas quatro fatores de transcrição (Myc, Oct3 / 4, Sox2eKlf4) que foi suficiente para converter os fibroblastos embrionários de ratinhopara as células estaminais pluripotentes(Takahashi e Yamanaka, 2006) (Figura3). As células-tronco pluripotentes, que Yamanaka chamou de células-troncopluripotentes induzidas (células iPS), apareceram com uma freqüência muitobaixa, mas poderiam ser selecionadas pela expressão de uma neomicina / lacZgene de fusão (βgeo) inseridos no locus no genoma Fbx15do rato a partir doqual os fibroblastos foram obtidos. O promotor Fbx15 é ativo em células-troncopluripotentes e a ativação da expressão de βgeo nas células estaminaispluripotentes resulta em resistência a G418. As células iPS geraram váriostipos celulares em ensaios de teratoma e contribuiram para a formação dostecidosquiméricos de ratos após a injeção em blastocistosde ratos. No entanto,a linha de células iPS de transmissão de germes não foi alcançada no primeiroestudo (Takahashi e Yamanaka, 2006). Porém, um ano depois, o grupo deYamanaka, emparalelo com Rudolph Jaenisch e grupos Konrad Hochedlinger,desenvolveram um refinado sistema de seleção(Agora selecionando paraativação, quer do Oct4 ou loci Nanog de genes), e os resultantes células iPSmostraramna linha a transmissão de germes (Okita et al, 2007;. Wernig et al,2007;.. Maherali et al, 2007). Em 2007, os laboratórios de Yamanaka e JamesThomson foram os primeiros a produzir células iPS humanas (Takahashiet al,2007;. Yu et al, 2007). Nas experiências com células humanas iPS, Yamanakausou o fator quatro de combinação do papel 2006 (Myc, Oct4, Sox2 e Klf4),enquanto Thomson usou um pouco da combinação de fatores de transcriçãodiferentes (Lin28, Nanog, 04 de outubro e Sox2).A descoberta de Yamanaka de células iPS representa uma descobertaverdadeiramente fundamental, pois foi a primeira vez que uma célulasomática diferenciada intacta pode ser reprogramado para se tornarpluripotente. A descoberta de Yamanakaabriu um campo de pesquisatotalmente novo, e as iPS surpreendentemente simples são agora tecnologiautilizada em um grande número de laboratórios de todo o mundo. 6
  7. 7. Figura 3 A partir de uma coleção de 24 diferentes fatores de transcrição (simbolizadospor tubos de ensaio), (1),Takahashi e Yamanaka (2006) demonstraram que umconjunto de apenas quatro fatores de transcrição (Myc, Oct3 / 4, Sox2e Klf4) foisuficiente para converter as culturas emembriões de rato ou fibroblastos adultos (2)para se tornarem células pluripotentes capazes de produzir in vivo teratomas econtribuirpara formar os ratos quiméricos (3). As células pluripotentes foramchamadascélulas-tronco pluripotentes induzidas (células iPS).Desenvolvimentos de reprogramação celular e seu uso na pesquisamédicaDesde a descoberta inicial, a tecnologia tem sido melhorada de váriasformas. Por exemplo, os fatores de pluripotência podem agora ser entregues àcélula, sem a utilização de vectores retrovirais, os quais se integramaleatoriamente no genoma e causam desregulação dos genes endógenos nasproximidades que podem contribuir para a formação de tumores. A nãointegração de vírus estabilizados,RNAs ou proteínas, bem como plasmídeosepissomais, agora é usada para a integração - entrega gratuita dos genespluripotência. Em certostipos celulares menos de quatro fatores sãonecessários para induzir pluripotência, no rato adulto, por exemplo, células-tronco neurais requerem apenas Oct4 para indução de células iPS (Kim et al.,2009). Do mesmo modo, em moléculas pequenas foi demonstrado certoscontextos celulares para substituir alguns dos fatores de pluripotência (Li etai., 2009). É importante notar que as células iPS satisfazem os critérios maisrigorosos para pluripotência, pois elas são capazes de gerar todas as célulasiPS de ratos em ensaios de complementação tetraplóides, isto é, quando ascélulas são introduzidastetraplóidemente com 8 células na fase de mórula(Zhao et al, 2009.). Todas estas melhorias, com base na origemda descobertadeYamanaka, foram passos importantes para tornar a tecnologia mais eficientee iPS ‘úteis. 7
  8. 8. A descoberta de Yamanaka, demonstrou que mudanças dramáticas no estadodiferenciado, que é geralmente muito estável, podem ser conseguidas, tambémtem inspirado os esforços de investigação para alterar o destino das célulassemtramitava a um estado pluripotente. Experimentos de transdiferenciaçãotêm uma longa história quevolta para experiências de discos imaginaisde Drosophila, em 1960, seguindo-se a utilização de alguns únicos genes,como Antennapedia, MyoD, GATA1 ou PAX5 para induzir interruptores dedestino celular. Em particular, oMyoD descoberta que pode transdiferenciar10T1 / 2 fibroblastos de mioblastos (Davis et al., 1987) mostrou que os genesque realizaram transdiferenciação poderia ser sistematicamente identificados.Yamanaka tomou uma abordagem sistemática para definir um pequenoconjunto de fatores de transcrição, em vez de um único fator, inspirou umarecente onda de experimentos usando combinações de transdiferenciação efatores de transcrição. Por exemplo, as células exócrinas para convertercélulas endócrinas no pâncreas através da introdução de três fatores detranscrição (Zhouet al., 2008). Do mesmo modo, pode ser cardiomiócitosgerados a partir de fibroblastos in vitro através da introdução de três fatores detranscrição diferentes (Ieda et al.,2010), e um comutador de destinocorrespondente na célula foi recentemente realizado in vivo usando os mesmosfatores (Song et al, 2012;.. Qian et al, 2012). Estes exemplos fornecemevidência paratransdiferenciação dentro de uma camada germinativa, maseficientementetransdiferenciação entre camadas germinativas pode tambémser alcançada. A transdiferenciação de fibroblastos (mesoderma) para osneurônios (ectoderme) (assimchamado em células) foi realizada por expressãode fatores de transcrição em três (Panget al., 2011).As células-tronco, incluindo as células iPS, pode, potencialmente, ser usadaspara substituir células doentes ou perdidas em desordem degenerativa ,incluindo por exemplo, doença de Parkinson e na diabetes de tipo 1. Naterapia celular com substituição poriPS as células podem permitir que oenxerto autólogo de células que seria menos propenso a rejeição imunitária. Omelhor método para a geração de células iPS será importante para essesesforços. No entanto, existe a possibilidadede que os procedimentos utilizadosatualmente para a reprogramação possam introduzir mutações genômicas ououtras anomalias, que podem torná-los impróprios para a terapia celular. Apossibilidade de utilizar as células-troncopluripotentes, incluindo as célulasES, no transplante de células permanece um desafio para um número derazões adicionais. Assim, embora esta seja uma área de pesquisa muitointeressante e promissora, o trabalho adicional é necessário para assegurar quea utilização de células com origem em células estaminais pluripotentessejauma terapia segura para os pacientes.Outra, mais iminente área, para uso médico é derivar células iPS de pacientescom genética eoutras doenças e, em seguida, usar as células 8
  9. 9. iPSpara diferenciação in vitro para obter uma nova percepção noprocesso dadoença ou para a produção de células - para plataformas baseadas em testes detoxicologia ou no desenvolvimento de drogas(Onder e Daley, 2012) (Figura4). As células iPS foram produzidas a partir de um amplo espectro de doenças,incluindo esclerose lateral amiotrófica (ELA), síndrome de Rett, atrofiamuscular espinhal (AME), α1 -antitripsina, hipercolesterolemia familiar earmazenamento de glicogênio 1A. Paradoença cardiovascular, existematualmente modelos celulares para iPS Síndrome de Timothy, síndrome deLEOPARD e a síndrome do QT longo, sendo do tipo 1 ou 2 (Onder e Daley,2012). Em várias dessas células iPS - com base em modelos de doenças,doenças com fenótipos relevantes são observadas. Por exemplo, a perdaprogressiva de um neurônio automóvelé observado no modelo iPS paraSMA. Além disso, na síndrome de Rettcélulas específicas iPS mostraramreduzida densidade da coluna após a diferenciação neuronal (Marchetto et al.,2010). A hepatocíticadiferenciação de células iPS de α1 - antitripsinaempacientes com deficiência leva a acumulação elevada de lipídios e glicogênio(Rashid et al., 2010). In vitro os modelos de células diferenciadas iPS tambémpode imitar aspectos de doenças com manifestação tardia, tais como a doençade Alzheimer (Israel et al., 2012), ataxia espinocerebelar (Kochet al., 2011) edoença de Huntington (O HD iPSC Consortium, 2012). O progresso tambémtem sido feito quando se trata de doenças de modelagem com a genéticacomplexa, tais como esquizofrenia (Brennand et al.,2011). No entanto,existem também as doenças, para as quais pode ser difícil imitar com sucessoa patologia nas células iPS advindas de células derivadas. Além disso, paraalgumas doenças, na linhagem hematopoiética, estudos em protocolos dediferenciação in vitro de células iPS são escassos, limitando o progresso nestaárea. 9
  10. 10. Figura 4 As células diferenciadas podem ser obtidas a partir de um paciente com umadoença específica e reprogramadas paratornar-se células iPS. As células resultantes iPSpodem então ser diferenciadas in vitro para vários destinos de células especializadas,taiscomo neurônios, cardiomiócitos ou hepatócitos, e usadas para ganhar novaspercepções sobre o processo da doença ou como plataforma de uma célula para tentardesenvolver terapias para novas doenças.Células iPSutilizadas como base em células in vitro diferenciadas também sãocada vez mais utilizadas como plataformas de triagem para desenvolvimento evalidação de compostos terapêuticos. Em uma célula iPS - modelo baseadoem disautonomia familiar, um novo composto, cinetina, foi identificado, o quepoderia reverter parcialmente o aberrante splicing do gene IKBKAP que causaa doença (Lee et al., 2009). Da mesma forma, a iPS pode ser usada em umaSíndrome QT longa como modelo celular, beta-bloqueadores e bloqueadoresdos canais de íons mostraram-se eficazes na modulação do fenótipo (Itzhaki etal., 2011). As células iPS são valiosas tornando-se assim novas ferramentaspara obter visões sobre os processos de doenças e são agora usadas para testare validar novas terapêuticas. Além disso, mesmo doenças com genéticacomplexa e de início tardio podem ser modeladascom sucesso por esta doença" doença do prato ".Em resumo, o conceito de que maduras, as células diferenciadas podem serreprogramadas a umestado de células-troncopluripotentes é um paradigma queas descobertas estão mudando. Essa percepção tem influenciadoessencialmente todas as áreas de medicina ou fisiologia. As descobertas feitaspor John Gurdone YamanakaShinya claramente foramfundamentais eintroduziram um campo de pesquisa totalmente novo.Jonas Frisen, UrbanLendahl e Thomas Perlmann 10
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