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MC Béné Grenoble, 19 Janvier 2010 GC Faure Grenoble 12/12/2011

IMMUNOPHENOTYPAGE EN CYTOMETRIE DE FLUX ,[object Object],[object Object],[object Object]

CONTRAINTES ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Quels échantillons? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Cellules vivantes ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Cellules vivantes ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

La suspension cellulaire ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Ficoll et sélection cellulaire : une vieille énigme!! ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Autres méthodes de séparation et d’enrichissement ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Lyse et sélection cellulaire : une autre énigme!! ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Autres méthodes de lyse ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Les marquages ,[object Object],[object Object]

La membrane ,[object Object],Ac palmytique Azote Ac Oléique Oxygène Phase aqueuse/oxygène Phosphore H Heller et al. J Phys Chem 1993

La membrane ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Une phase fluide et des protéines

Marquages membranaires ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],CD23 CD20 CD45 CD22 Leu13 CD81 CD19 CD21 CD79a/b sIgM CD40

Quelle surface cellulaire? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Les cellules qui se cachent ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Fixations non spécifiques? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Cellules fixées ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Le cytoplasme ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

La perméabilisation ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Perméabilisants du commerce ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Et le noyau??? ,[object Object],[object Object]

Mortes ou vives? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Immunofluorescence indirecte ou directe Première incubation Lavage Deuxième incubation + Lavage Incubation des cellules avec l’anticorps ou le mélange d’anticorps Pas de lavage nécessaire Marquages concomitants membranaires et intracellulaires Marquage membranaire + lavage Perméabilisation Marquage intracellulaire

Au total ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Amélioration des techniques de cytométrie ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Les nouveaux fluorochromes ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Attention aux tandems ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Réglages des PMT et compensations ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Règle d’or d’une bonne compensation Les cellules négatives ont la même MFI sur un axe donné Elles sont préférentiellement dans la première décade

Analytique : post acquisition ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Multimarquages… ….standardisation nécessaire

Cartographie des suspensions cellulaires en hématologie : le scattergramme SSC/CD45 Stetler Stevenson Wood Stachursky Xu Cherian GTLLF

Stratégie GTLLF : d’abord les cellules matures ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Analyse CD45 SSC FSC SSC CD14 SSC CD16 SSC CD45 CD11b

Marquages complexes : retour à la cartographie ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

Stratégie Granulober CD45 SSC FLn SSC CD45 SSC FLx FLy CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC FLx FLy FLx FLy

CD11b/CD117/CD34 Gating CD11b+ Gating CD117+ Granulober FLx FLy CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC FLx FLy FLx FLy

FLn SSC Stratégie FL3+ FL2+ FL1+ FLn+ Granulober CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC FL1 FL2 CD45 SSC FL1 FL3 FL2 FL3

Gating CD13 Gating CD34 Gating CD33 Crossgating II.12 CD45 SSC CD45 SSC FL1 FL2 CD45 SSC FL1 FL3 FL2 FL3 FL3 + FL2 + FL1 +

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