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Curso de Ciências Biológicas
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gloeosporioides.
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Agradeço a Deus por todas as
vitórias concebidas em minha
vida.
SUMÁRIO
RESUMO...............................................................................................................
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
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nome ci...
RESUMO
MATA NETO, A.R. Caracterização bioquímica de isolados de Colletotrichum
gloeosporioides. Trabalho de Conclusão de C...
ABSTRACT
MATA NETO, A.R. Biochemical characterization of Colletotrichum gloeosporioides.
Course Final Report. 2014.
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INTRODUÇÃO
O gênero Colletotrichum gloeosporioides, é um dos mais importantes fungos
fitopatogênicos do mundo, principalme...
germinaram e o micélio resultante, com prévia formação de apressórios, penetra diretamente
através da cutícula pela emissã...
REVISÃO LITERATURA
Esta espécie bastante polífaga e presente e muitas hospedeiras é considerada uma
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O consumo de C e N representa um dos principais componentes inorgânicos
metabolizados pelas hifas fúngicas, desta forma o ...
MATERIAIS E MÉTODOS
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Nome científico Família botânica Local de coleta
1 Abacate Persea americana Lauraceae Urutaí/GO
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fatorial. Além da ANOVA foi realizado o teste Tukey, para identificar a significância das
medidas dos fatores individuais ...
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todos os isolados estudados foram identificados como pertencentes a espécie
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crescimento micelial (AACPCM) nos ...
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micelial (AACPCM) de oito isola...
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CONCLUSÕES
Através desse trabalho foi verificado uma variabilidade quanto ao uso de fontes de C e
N, evidenciando a combin...
BIBLIOGRAFIA
BERGER, R.D. The analysis of the effects of control measures on the development of
epidemics. In: KRANZ, J.; ...
JOHNSTON, PR & JONES, D Relationships among Colletotrichum isolates from fruit-rots
assessed using rDNA sequences. Mycolog...
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A nutrição de C/N exerce efeito nos processos fisiológicos de fungos, principalmente
aqueles relacionados ao crescimento, produção de conídios, germinação, peso seco e
permite também, estabelecer diferenças bioquímicas entre Colletotrichum gloeosporioides,
pela sua habilidade em usar determinada fonte de carbono e nitrogênio. Vinte e quatro
isolados oriundos de 24 hospedeiras distintas foram incubados em meio, contendo os
seguintes tratamentos (fontes de carbono x nitrogênio): i) dextrose x asparagina, ii)
dextrose x triptona, iii) dextrose x nitrato de potássio, iv) sacarose x asparagina, v) sacarose
x triptona, vi) sacarose x nitrato de potássio, vii) sorbitol x asparagina, viii) sorbitol x
triptona, ix) sorbitol x nitrato de potássio, x) controle [BDA] crescidos sob duas repetições.
As placas foram incubadas sob 12 horas de luz, a 25 oC, num delineamento inteiramente
casualisado, sendo o fator fontes CN constituídos de 10 tratamentos, fator isolados 24
tratamentos, duas repetições, totalizando 480 UE. Foi avaliado o crescimento micelial,
durante o período de sete dias, sendo calculado através de regressão a taxa de crescimento
micelial (mm.dia-1) e a área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial
(AACPCM). A combinação sorbitol x nitrato de potássio promoveu as maiores taxas de
crescimento para os isolados de arvore da fortuna, amora e banana. Com relação às
combinações C/N, a análise estatística revelou diferença significativa entre os isolados, sob
efeito da interação C/N, bem como dos fatores independentes, sobre o crescimento micelial,
produção de esporos e peso seco do micélio. Os isolados de iuca e mandioca foram os que
resultaram maior crescimento micelial. Através desse trabalho podemos verificar que
isolados como de iuca e mandioca possuem atividade metabólica mais elevada em relação
aos demais, e a fonte de C originada de dextrose é aque promove maior produção de
micélio. Nenhuma fonte de N mereceu destaque.

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Trabalho de Conclusão de Curso - Gaby Cardoso de Lima - Orientador: Milton Luiz da Paz Lima

  1. 1. INSTITUTO FEDERAL GOIANO câmpus URUTAÍ Curso de Ciências Biológicas ABDIAS RODRIGUES DA MATA NETO CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE ISOLADOS DE Colletotrichum gloeosporioides. URUTAÍ, GO, 16 de dezembro de 2014 1
  2. 2. ABDIAS RODRIGUES DA MATA NETO CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE ISOLADOS DE Colletotrichum gloeosporioides. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado para obtenção do grau de Licenciado em Ciências Biológicas ao Instituto Federal Goiano – Câmpus Urutaí. Orientador: Prof. D.Sc. Milton Luiz da Paz Lima. URUTAÍ, GO, 16 de dezembro de 2014 2
  3. 3. ABDIAS RODRIGUES DA MATA NETO CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE ISOLADOS DE Colletotrichum gloeosporioides. COMISSÃO EXAMINADORA ______________________________ D.Sc. Milton Luiz da Paz Lima Orientador (Instituto Federal Goiano campus Urutaí) ______________________________ D.Sc. Gleina Costa Membro avaliador (Instituto Federal Goiano campus Urutaí) ______________________________ M.Sc. Gesiane Ribeiro Guimarães Membro avaliador (Universidade Estadual de Goiás UnU Ipameri) Urutaí, 16 de dezembro de 2014 3
  4. 4. 4 Agradeço a Deus por todas as vitórias concebidas em minha vida.
  5. 5. SUMÁRIO RESUMO..................................................................................................................................7 ABSTRACT..............................................................................................................................8 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................17 CONCLUSÕES.......................................................................................................................24 5
  6. 6. LISTA DE TABELAS E FIGURAS Tabela 1. Informações dos hospedeiros por onde os isolados foram obtidos considerando o nome científico, família botânica e local de coleta. ________________________________15 Tabela 2. Valores F da análise de variância dos fatores hospedeiros de origem e tratamentos e os valores dos parâmetros das variáveis dependentes peso seco de micélio e área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM).____________________________18 Tabela 3. Médias dos pesos secos de micélio (PS) e dos Valores de área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) dos isolados submetidos a diferentes concentrações de carbono e nitrogênio (C/N).____________________________________________________________________19 Tabela 4. Médias dos pesos secos do micélio (PS) e área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) nos diferentes tratamentos contendo fontes de carbono e nitrogênio.________________________________________________________________20 Figura 1. Efeito dos tratamentos 1 a 5 na área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) de oito isolados apresentados.________________________________21 Figura 2. Efeito dos tratamentos 6 a 9 na área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) de oito isolados apresentados.________________________________21 Figura 3. Efeito dos tratamentos 1 a 5 na taxa de crescimento de oito isolados.___________22 Figura 4. Efeito dos tratamentos 6 a 9 na taxa de crescimento de oito isolados.___________22 6
  7. 7. RESUMO MATA NETO, A.R. Caracterização bioquímica de isolados de Colletotrichum gloeosporioides. Trabalho de Conclusão de Curso. 2014. A nutrição de C/N exerce efeito nos processos fisiológicos de fungos, principalmente aqueles relacionados ao crescimento, produção de conídios, germinação, peso seco e permite também, estabelecer diferenças bioquímicas entre Colletotrichum gloeosporioides, pela sua habilidade em usar determinada fonte de carbono e nitrogênio. Vinte e quatro isolados oriundos de 24 hospedeiras distintas foram incubados em meio, contendo os seguintes tratamentos (fontes de carbono x nitrogênio): i) dextrose x asparagina, ii) dextrose x triptona, iii) dextrose x nitrato de potássio, iv) sacarose x asparagina, v) sacarose x triptona, vi) sacarose x nitrato de potássio, vii) sorbitol x asparagina, viii) sorbitol x triptona, ix) sorbitol x nitrato de potássio, x) controle [BDA] crescidos sob duas repetições. As placas foram incubadas sob 12 horas de luz, a 25 o C, num delineamento inteiramente casualisado, sendo o fator fontes CN constituídos de 10 tratamentos, fator isolados 24 tratamentos, duas repetições, totalizando 480 UE. Foi avaliado o crescimento micelial, durante o período de sete dias, sendo calculado através de regressão a taxa de crescimento micelial (mm.dia-1 ) e a área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM). A combinação sorbitol x nitrato de potássio promoveu as maiores taxas de crescimento para os isolados de arvore da fortuna, amora e banana. Com relação às combinações C/N, a análise estatística revelou diferença significativa entre os isolados, sob efeito da interação C/N, bem como dos fatores independentes, sobre o crescimento micelial, produção de esporos e peso seco do micélio. Os isolados de iuca e mandioca foram os que resultaram maior crescimento micelial. Através desse trabalho podemos verificar que isolados como de iuca e mandioca possuem atividade metabólica mais elevada em relação aos demais, e a fonte de C originada de dextrose é a que promove maior produção de micélio. Nenhuma fonte de N mereceu destaque. Palavras-chave: crescimento micelial, carbono, nitrogênio, peso seco, nutrição. 7
  8. 8. ABSTRACT MATA NETO, A.R. Biochemical characterization of Colletotrichum gloeosporioides. Course Final Report. 2014. The nutrition using Carbon and nitrogen has an effect in the physiological processes of fungi, especially those related to growth, conidia production, germination, dry weight, it is enabling to establish biochemical differences between Colletotrichum gloeosporioides. For their ability to use certain carbon source and nitrogen. Twenty-four from 24 isolates from different hosts were incubated in medium containing the following treatments (carbon x nitrogen sources): i) asparagine x dextrose, ii) dextrose x tryptone, iii) dextrose x potassium nitrate, iv) sucrose x asparagine, v) sucrose x tryptone, vi) x sucrose x potassium nitrate vii) sorbitol x asparagine, viii) sorbitol x tryptone, ix) sorbitol x potassium nitrate, x) control [PDA] grown in two replications. The plates were incubated under 12 hours of light at 25 °C, in a completely randomized design, with the factor consisting C/N sources of 10 treatments, isolated factor 24 treatments, two replicates, totaling 480 experimental unit. Mycelial growth was evaluated during the seven-day period, calculated by regression mycelial growth rate (mm.dia-1 ) and the area under the mycelial growth progress curve (AACPCM). The combination sorbitol x potassium nitrate promoted the highest growth rates for the árvore-da-fortuna isolated, mulberry and banana. Regarding the C/N combinations, the statistical analysis revealed significant differences among the isolates, under the effect of C/N interaction, as well as independent factors, mycelial growth, sporulation and dry weight of the mycelium. Isolates of yucca and cassava were the resulting higher mycelial growth. Through this work we can see that isolated as yucca and cassava have higher metabolic activity than the other, and the source of C originated dextrose is promoting increased production of mycelium. No N source was highlighted. Palavras-chave: micelial raise, carbon, nitrogên, dry weight, nutrition. 8
  9. 9. INTRODUÇÃO O gênero Colletotrichum gloeosporioides, é um dos mais importantes fungos fitopatogênicos do mundo, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais. Suas espécies ocasionam doenças de grande expressão econômica em leguminosas, cereais, hortaliças e culturas perenes, incluindo diversas frutíferas (SERRA et al., 2008; SUTTON, 1992). Existem registros por volta de 688 táxons, representados por variedades e formeae speciales pertencentes ao gênero Colletotrichum gloeosporioides. Este fungo pertence ao Reino Fungi, grupo dos Fungos Mitospóricos e sub-grupo dos Coelomicetos, e sua fase teleomórfica pertencente ao gênero Glomerella sp. incluindo-se no Reino Fungi, Divisão Ascomicota (KIRK et al.,2001). Espécies de Colletotrichum gloeosporioides, são tradicionalmente diferenciados com base em caracteres morfológicos e culturais, que devem ser considerados simultaneamente e nunca isoladamente. Morfologicamente o fungo apresenta acérvulos circulares, conidióforos curtos e simples. Conídios hialinos, gutulados, ovais, oblongos ou falcados. A massa de conídios possui coloração rósea à salmão, e pode estar presente no acérvulo. Suas setas podem ser longas, septadas e pigmentadas (GALLI, 1978). A antracnose é o nome da doença causada por este patógeno, afeta principalmente frutíferas, hortaliças e as cultivares atacando ramos novos, folhas, inflorescências e frutos. Nas folhas há o aparecimento de manchas escuras, enegrecimento de nervuras e de contornos irregulares. As inflorescências afetadas apresentam flores escuras, ou manchas petalares esparsas, apresentando aspecto de requeima, crestamento ou morte do limbo em sua totalidade. As lesões na ráquis podem levar a queda dos frutos, antes da maturação fisiológica, ou mumificação quando ainda novos. No período de maturação, há o aparecimento de lesões escuras e deprimidas na superfície da planta, que podem atingir também a polpa. A doença pode ocasionar prejuízos que variam em função do grau de suscetibilidade da planta hospedeira e das condições ambientais (BERGER, 1998; SERRA et al., 2008). As antracnoses podem provocar perdas de até 100% na produção quando os fatores cultivar suscetível, ambiente favorável ao patógeno e sementes infectadas estiverem simultaneamente presentes durante o período de cultivo (SILVA, 2004). A disseminação planta ocorre principalmente através dos respingos de chuva, pois os conídios estão aglutinados por uma substância gelatinosa hidrossolúvel, e não são facilmente carregados pelo vento. Os conídios uma vez em contato com o hospedeiro, sob condições de umidade, 9
  10. 10. germinaram e o micélio resultante, com prévia formação de apressórios, penetra diretamente através da cutícula pela emissão do tubo de infecção (GALLI et al.,1978). O carbono (C) e nitrogênio (N) são os mais importantes e essenciais elementos para nutrição dos fungos, sendo utilizados no processo infectivo, crescimento e reprodução (SANGEETHA & RAWAL, 2008). A nutrição de C/N exerce efeito nos processos fisiológicos de Colletotrichum gloeosporioides, principalmente aqueles relacionados ao crescimento, produção de conídios, germinação e peso seco. Podem ocasionar diferenças bioquímicas entre Colletotrichum spp., pela sua habilidade em usar determinada fonte de carbono e nitrogênio (COUTO & MENEZES, 2004). As populações de C. gloeosporioides podem responder de forma diferenciada aos diferentes tipos de fontes de C ou N ou podem preferir um tipo de elemento químico específico. O objetivo desta monografia é caracterizar quanto ao uso de fontes de carbono e nitrogênio dos isolados de Colletotrichum gloesporioides, que foram coletados de diferentes hospedeiros. 10
  11. 11. REVISÃO LITERATURA Esta espécie bastante polífaga e presente e muitas hospedeiras é considerada uma espécie complexa devido apresentar imensa variabilidade genética dentre os isolados analisados, contudo apresenta imensa variabilidade biológica e molecular (BROWN et al., 1996; OHNSTON e JONES, 1997).Este táxon pertencente ao subgrupo dos Coelomicetos apresenta como teleomorfo o ascomiceto Glomerella cingulata (Stonem). Spauld. e Von Schrenk (1903) (INDEX FUNGORUM, 2014). Em meio de cultura possui colônias variáveis, de coloração cinza claro a cinza escuro, seu micélio é aéreo, formando aglomerações associadas ao acérvulo, no lado reverso da placa também possui coloração branca acinzentada com a idade. As setas podem ou não estarem presentes. Escleródios são ausentes. Apressórios clavados, sua forma pode apresentar-se como ovados, obovados, algumas vezes lobados, de coloração marrom escura, apresenta dimensões de 6-20 x 4-12 μm, seus conídios formados em massas de colorações salmão, possuem formato reto, cilíndrico, ápice obtuso, base truncada, 12-17 x 3,5-6 μm. A produção de conídios é bastante heterogênea em meio de cultura (SUTTON, 1992). A variabilidade fisiológica de C. gloeosporioides é representada por 21 formas especiales e variedades [C.gloeosporioides (C.g.) f.sp. alatae, C.g.f.sp. gloeosporioides, C.g.f.sp. heveae, C.g.f.sp. melongenae, C.g.f.sp. nectrioides, C.g.f.sp. aeschynomenes, C.g. f.sp. clidemiae, C.g.f.sp. cucurbitae, C.g.f.sp. cuscutae, C.g.f.sp. manihotis, C.g.f.sp. pilosae, C.g. f.sp. uredinicola, C.g. var. aleritidis, C.g. var. cephalosporioides, C.g. var. gloeosporioides, C.g. var. gomphrenae, C.g. var. hederae, C.g. var. minus, C.g. var. minus, C.g. var. nectrioidea] registradas em literatura (INDEX FUNGORUM, 2014). Os conídios germinam de seis a nove horas após o contato inicial com o hospedeiro, se as condições lhes forem favoráveis. Há formação do tubo germinativo, seguido do apressório, que penetra mecanicamente pela cutícula e pela epiderme da plantas. O aparecimento de sintomas pode ser observado a partir de sexto dia após o início da infecção (SUTTON, 1992; FREEMAN et al., 1998; LOPES, 2001). As dificuldades encontradas na identificação das espécies de Colletotrichum sp. estão relacionadas a grande diversidade fenotípica, influência de fatores ambientais na estabilidade de critérios de identificação. O círculo de hospedeiros ou hospedeiro de origem não é um critério confiável para identificação de espécies, por exemplo, como C. gloeosporioides e C.acutatum que infectam as mesmas hospedeiras em complexos (FREEMAN et al., 1998; 11
  12. 12. PERES et al. 2005). É frequente a ocorrência de mais de uma espécie de Colletotrichum associada a uma mesma hospedeira e uma mesma espécie pode atacar múltiplas hospedeiras (FREEMAN et al., 1998). As três espécies causam antracnose, mas podridão do pedúnculo, inflorescências e frutos conhecida como “flor preta” e atribuída a C.acutatum outras culturas como a amêndoa (Prunus amygdalus L.) (FOSTER &ADASKAVEG, 1999), maçã (Malus domestica Borkh.) (BERNSTEIN et al., 1995), abacate (Persea americana Mill.) (JOHNSTON & JONES, 1997), pêssego (Prunus persica (L.) Batsch) (ADASKAVEG & HARTIN, 997); citros (BROWN et al., 1996; GOES & KIMATI, 1997) e algumas solanáceas (TOZZE Jr. et al., 2006) são infectadas por C. acutatum e C gloeosporioides. A nutrição de C/N exerce efeito nos processos fisiológicos de fungos, principalmente aqueles relacionados ao crescimento, produção de conídios, germinação e peso seco (COCHRANE, 1958) e permite também, estabelecer diferenças entre os isolados e Colletotrichum spp. pela habilidade em usar determinada fonte de carbono e nitrogênio. A caracterização de populações de patógenos permite-nos identificar fontes de variabilidade fisiológica e morfológica, indicando surgimento de subpopulações ou táxons infra-supra-específicos que podem ser responsáveis por quebra de resistência ao hospedeiro. Esta identificação implica na descoberta do processo de co-evolução do patógeno sobre o hospedeiro sendo esta descoberta uma importante ferramenta em programas de melhoramento. Os complexos de espécies atuando sobre os hospedeiros podem resultar em mecanismos de ação diferenciados e expressando fenotipicamente o que se conhece por resistência a fungicidas quando que na verdade são nichos de parasitismo modificados e que não são afetados pela atividade química de fungicidas. A divergência existente em espécies ou populações de Colletotrichum spp. existentes na natureza é bastante ampla, tornando aspectos da identificação utilizando critérios morfológicos um procedimento complexo e impreciso. A própria espécie de Colletotrichum gloeosporioides que apresenta ampla gama de hospedeiras (inespecificidade), não apresenta diferenças morfológicas para pode apresentar diferenças fisiológicas de interação planta- patógeno. Agregar outros métodos de diferenciação bioquímica permite separar, e reconhecer estas diferenças fisiológicas e/ou bioquímicas que está população desenvolve permitir maior robustez na caracterização e reconhecimento das populações presentes no ambiente. 12
  13. 13. O consumo de C e N representa um dos principais componentes inorgânicos metabolizados pelas hifas fúngicas, desta forma o consumo diferencial permitirá separar grupos de fungos com similaridades fisiológicas e bioquímicas, e por meio de analogias estas similaridades apresentarão confluências com outros critérios de caracterização da população estudada. 13
  14. 14. MATERIAIS E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Microbiologia e Fitopatologia do Instituto Federal Goiano Campus-Urutaí, sendo representado pelos fatores tratamento (nove tipos de combinações C/N), fator hospedeiro de origem 24 tipos (mangaba, negramina, conde, abacate, banana, manga, goiaba folha, falso-massambará, caqui, antúrio, árvore-da-fortuna, uva, cana, mandioca, goiaba fruto, amora, banana fruto, iuca, chuchu, soja, tomate, coco, mamão e dracena), sendo assim um experimento inteiramente casualizado em fatorial (fator tratamento e fator hospedeiro de origem) com duas repetições e duas testemunhas. As fontes de carbono utilizadas neste estudo (dextrose, sacarose e sorbitol) foram combinadas com três fontes de nitrogênio (asparagina, peptona e nitrato de potássio), na proporção de 10:1 (10 g de C para 1 g de N). O meio basal para adição das combinações carbono/nitrogênio foi composto de: 0,5 g de MgSO4.7H2O; 1,0 g de KH2PO4; 17 g de ágar, 1.000 mL de água destilada (LILLY & BARNETT, 1951), sendo o pH ajustado para 5,5. Após a autoclavagem, os meios foram vertidos em placas de Petri, num volume aproximado de 20 mL/placa. Discos de micélio (6,0 mm de diâmetro) dos 24 isolados (Tab. 1), oriundos de colônias matrizes jovens (cinco dias de crescimento), foram transferidos para o centro das placas de Petri contendo os tratamentos (CxN), e as culturas foram incubadas em condições de claro contínuo e temperatura de 25 °C, durante sete dias. A avaliação do crescimento micelial consistiu na determinação do diâmetro das colônias (mm) de cada isolado e combinações de C/N (Tab. 4), usando-se a média de duas leituras efetuadas em dois sentidos diametralmente opostos. Para a determinação do peso seco, os isolados foram cultivados individualmente durante cinco dias em frascos de Erlenmeyer, sem agitação das culturas, contendo 50 mL de cada combinação C/N, adicionados ao meio líquido basal. As condições de incubação foram as mesmas anteriormente citadas. Ao final do período de incubação, as culturas foram filtradas em gaze dupla, e as massas micelial coletadas foram depositadas em caixas de papel alumínio, com peso previamente determinado e isentas de umidade. As caixas foram colocadas em estufa a 50 °C, durante quatro dias e, ao final deste período, foram determinadas por diferença o peso seco da massa micelial de cada isolado, o qual foram expressos em mg. 14
  15. 15. Nome científico Família botânica Local de coleta 1 Abacate Persea americana Lauraceae Urutaí/GO 2 Amora Morus nigra Moraceae Urutaí/GO 3 Antúrio Anthurium andraeanum Araceae Ipameri/GO 4 Árvore da Fortuna Polycias frusticosa Araliaceae Urutaí/GO 5 Banana Musa paradisiaca Musaceae Brasília/DF 6 Banana (folha) Musa paradisiaca Musaceae Brasília/DF 7 Cana Saccharum officinalis Poaceae Urutaí/GO 8 Caqui Diospyros kaki Ebenaceae Urutaí/GO 9 Chuchu Sechium edule Cucurbitaceae Brasília/DF 10 Coco Cocos nucifera Arecaceae Urutaí/GO 11 Conde Annona coriacea Annonaceae Urutaí/GO 12 Dracena Dracena fragans Liliaceae Urutaí/GO 13 Falso Massambará Sorghum arundinaceum Poaceae Urutaí/GO 14 Goiaba Psidium guajava Myrtaceae Brasília/DF 15 Goiaba (folha) Psidium guajava Myrtaceae Brasília/DF 16 Iuca Yucca elephantipes Agavaceae Brasília/DF 17 Mamão Carica papaia Caricaceae Brasília/DF 18 Mandioca Manihot esculenta Euphorbiaceae Urutaí/GO 19 Manga Anacardium mangiferae Anacardiaceae Brasília/DF 20 Mangaba Hancornia speciosa Apocynaceae Goiânia/Go 21 Negramina Sipurana guianensis Siparunaceae Urutaí/GO 22 Soja Glycine max Fabacaeae Urutaí/GO 23 Tomate Solanum lycopersicum Solanaceae Urutaí/GO 24 Uva Vitis vinifera Vitaceae Brasília/DF Hospedeiro Tabela 1. Informações dos hospedeiros por onde os isolados foram obtidos considerando o nome científico, família botânica e local de coleta. O diâmetro micelial foi avaliado diariamente durante um período de 7 dias, resultando no progresso temporal. A integralização dos valores de dias e diâmetro da colônia matematicamente resultou no valor de AACPCM. Com os dados do diâmetro da colônia coletados em diferentes avaliações, nos tratamentos, calculou-se a taxa de crescimento (TC) e a área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) pelo método da integralização trapezoidal (BERGER, 1988). Para o cálculo da AACPCM, utilizou-se a seguinte fórmula: , em que: n = número de avaliações, y = diâmetro da colônia (mm), t = tempo quando da avaliação do diâmetro da colônia, (yi + yi + 1) = altura média do retângulo entre os pontos yi e yi + 1, ti + 1 = diferença da base do retângulo entre os pontos ti + 1 e ti. A curva de progresso do crescimento micelial pode ser expressa pela proporção de diâmetro micelial x tempo. Os valores do peso seco micelial e de AACPCM foram utilizados para a realização da análise de variância (ANOVA), os fatores individuais e as interações do experimento em 15
  16. 16. fatorial. Além da ANOVA foi realizado o teste Tukey, para identificar a significância das medidas dos fatores individuais utilizando o programa “SAS for windows”. 16
  17. 17. RESULTADOS E DISCUSSÃO Todos os isolados estudados foram identificados como pertencentes a espécie Colletotrichum gloeosporioides. A principais fonte de carbono para os isolados testados continha em suas combinações dextrose e sorbitol, pois os maiores valores de AACPCM e taxa de Crescimento (TC), foram para tratamentos que continham essas fontes de C. A sacarose não demonstrou uma fonte de C eficiente para a morfofisiologia dos isolados (Fig 1). Cinquenta % dos isolados (árvore-da-fortuna, banana fruto, caqui e conde) apresentaram maiores valores de AACPCM para a combinação dextrose e nitrato de potássio. Trinta e oito % dos isolados (banana folha, banana fruto e caqui (folha), tiveram TC maiores para isolados também submetidos a combinação de dextrose e nitrato de postássio (Fig 1). Os isolados de conde, chuchu e árvore da fortuna apresentaram os menores valores médios de AACPCM e TC. Em geral, as médias do crescimento micelial dos isolados nas combinações das fontes de carbono (dextrose, sacarose, sorbitol) e como fontes de nitrogênio (asparagina, peptona e nitrato de potássio), demonstram a diferenças na habilidade em utilizar diferentes fontes de carbono e nitrogênio, entre isolados de uma mesma espécie, e esta informação também foi constatada por, Tandon & Chandra (1962), para C. gloeosporioides. As combinações dextrose/ peptona e sacarose/peptona foram as que induziram maiores médias de peso seco da massa micelial, 5,3 mg e 5,4 mg, respectivamente, destacando-se significativamente das médias das demais fontes C/N. Na combinação sacarose/peptona, não ocorreram diferenças significativas entre os isolados, o mesmo acontecendo nas combinações de dextrose/asparagina (T1) e sorbitol/peptona(T8). (Tabela 2, 3 e 4). Mata Neto et al. (2011) registraram o efeito de C/N no crescimento de isolados de Colletotrichum gloesporioides. E verificaram esses resultados. Analisando-se os dados do crescimento micelial e peso seco do micélio, constatou-se uma correlação positiva entre o crescimento micelial e o peso seco do micélio, r(Pearson) = 0,5121, ou seja, os isolados que demonstraram maior habilidade de crescimento no meio sólido, tiveram também maior peso seco da massa micelial no meio líquido. Segundo Tandon & Chandra (1962), um bom crescimento micelial está associado a uma boa esporulação. No presente estudo foi verificado que alguns isolados apresentaram boa produção de conídios, aliada a elevado crescimento em meio sólido e líquido, 17
  18. 18. confirmando os dados dos autores mencionados. Às vezes, um meio ótimo para o crescimento rápido resulta na exaustão dos nutrientes e os metabólitos secundários liberados pelo fungo nesse meio, inibem a produção de conídios (GRIFFIN,1994). Por outro lado, o crescimento micelial reduzido pode estimular a esporulação naquele substrato. As principais fontes de carbono para os isolados testados continham em suas combinações dextrose e sorbitol, pois os maiores valores de AACPCM e TC, foram para tratamentos que continham essas fontes de C. A sacarose não demonstrou uma fonte de C eficiente para a morfofisiologia dos isolados. Tabela 2. Valores de F da análise de variância dos fatores hospedeiros de origem e tratamentos e os valores dos parâmetros das variáveis dependentes peso seco de micélio e área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM). NS não significativo **significativo a 1%. A análise de variância para o arranjo fatorial para os fatores (variáveis independentes) hospedeiros de origem, tratamentos com carbono e nitrogênio e a interação das variáveis independentes analisou-se as medias e os desvios padrões das variáveis dependentes peso seco de micélio e dos valores de área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM), sendo que rejeitou-se a hipótese de nulidade (~0,001) para a variável independentes apenas para o fator tratamento C/N (F=7,52**), não rejeitando para diferenças entre hospedeiros de origem (F= 1,48ns ) e interação (F=0,000002ns ). Para a variável dependente AACPCM rejeitou-se a hipótese de nulidade para as variáveis hospedeiros de 18 Fatores Valor F Peso Seco do micélio AACPCM Hospedeiro de origem 1,48ns 8,35** Tratamentos (C/N) 7,52** 3,23** Interação 0,02ns 3,27 ns
  19. 19. origem (F=8,35**) e tratamentos C/N (F=3,23**), não rejeitando-se a hipótese de nulidade para interação entre os dois fatores (Tab. 2) 19
  20. 20. Tabela 3. Médias dos pesos secos de micélio (PS) e dos Valores de área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) dos isolados submetidos a diferentes concentrações de carbono e nitrogênio (C/N). Or. Hospedeiros de origem PS (g)* Hospedeiros de origem AACPCM* 1 Mangaba 3,16 a Iuca 16,4 a 2 Negramina 3,16 ab Mandioca 15,89 a 3 Conde 3,16 ab Antúrio 15,7 ab 4 Abacate 3,16 ab Tomate 15,6 bc 5 Banana 3,16 ab Uva 15,6 bc 6 Manga 3,16 ab Chuchu 15,5 bc 7 Goiaba (folha) 3,16 ab Soja 15,3 bc 8 Falso massambará 3,16 ab Árvore da fortuna 16,3 cd 9 Caqui 3,16 ab Abacate 15,1 de 10 Antúrio 3,16 ab Coco 14,8 ef 11 Árvore da Fortuna 3,16 ab Manga 14,6 fg 12 Uva 3,16 ab Cana 14,3 fg 13 Cana 3,16 ab Dracena 14,3 gh 14 Mandioca 3,16 ab Negramina 14,1 gh 15 Goiaba (Fruto) 3,16 ab Conde 13,4 gh 16 Amora 3,16 ab Mangaba 13,4 gh 17 Banana (fruto) 3,16 ab Amora 13,1 gh 18 Iuca 3,16 ab Goiaba (fruto) 12,8 gh 19 Chuchu 3,16 ab Falso massambará 12,8 gh 20 Soja 3,16 ab Goiaba 12,7 gh 21 Tomate 3,16 ab Mamão 12,5 gh 22 Coco 3,16 ab Banana (fruta) 12,2 gh 23 Mamão 3,16 ab Banana 12,2 gh 24 Dracena 3,16 ab Caqui 11,9 h *Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si ao teste Tukey (P~0,05) 20
  21. 21. Tabela 4. Médias dos pesos secos do micélio (PS) e área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) nos diferentes tratamentos contendo fontes de carbono e nitrogênio. Trat. Combinação de fonte de carbono e nitrogênio PS(g)* Trat. Combinação de fonte de carbono e nitrogênio AACPCM T3 Dextrose-nitrato de potássio 3,16 a T2 Dextrose-triptona 15 a T2 Dextrose-triptona 3,16 ab T1 Dextrose-asparagina 14,5 ab T6 Sacarose-Nitrato de potássio 3,16 ab T9 Sorbitol-Nitrato de potássio 14,4 ab T5 Sacarose-Triptona 3,16 ab T3 Dextrose-nitrato de potássio 14,4 ab T1 Dextrose-asparagina 3,16 ab T8 Sorbitol-Triptona 14,3 ab T4 Sacarose-Asparagina 3,16 bc T7 Sorbitol-Asparagina 13,9 ab T8 Sorbitol-Triptona 3,16 bc T5 Sacarose-Triptona 13,8 b T7 Sorbitol-Asparagina 3,16 c T4 Sacarose-Asparagina 13,5 b T9 Sorbitol-Nitrato de potássio 3,16 c T6 Sacarose-Nitrato de potássio 13,4 b *Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si ao teste Tukey (P~0,05); medias transformadas por √ x+ 10. 21
  22. 22. Figura 1. Efeito dos tratamentos 1 a 5 na área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) de oito isolados apresentados. Figura 2. Efeito dos tratamentos 6 a 9 na área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) de oito isolados apresentados. 22
  23. 23. Figura 3. Efeito dos tratamentos 1 a 5 na taxa de crescimento de oito isolados. . Figura 4. Efeito dos tratamentos 6 a 9 na taxa de crescimento de oito isolados. 23
  24. 24. CONCLUSÕES Através desse trabalho foi verificado uma variabilidade quanto ao uso de fontes de C e N, evidenciando a combinação dextrose e nitrato de potássio, excluindo o uso de sacarose. Foi verificado uma imensa variabilidade não tendenciosa por isolados e não padronizada para o gênero C.gloeosporioides. quanto ao uso de fontes de C e N, evidenciando a combinação dextrose e nitrato de potássio como mais promissora para crescimento e esporulação de Colletotrichum sp. A ferramenta de crescimento de C/N mostrou-se um promissor marcador de variabilidade para identificação de características distintivas para trabalhos de caracterização de população de isolados. Através desse trabalho podemos verificar que isolados como de iuca e mandioca possuem atividade metabólica mais elevada em relação aos demais, e a fonte de C originada de dextrose é a que promove maior produção de micélio. Nenhuma fonte de N mereceu destaque dextrose x triptona. 24
  25. 25. BIBLIOGRAFIA BERGER, R.D. The analysis of the effects of control measures on the development of epidemics. In: KRANZ, J.; ROTEM, J. (Ed.). Experimental techniques in plant disease epidemiology. Heidelberg: Springer-Verlang, p.137-151.1988. BROWN, A.E., SREENIVASAPRASAD, S. & TIMMER, W.L. Molecular characterization of slow-orange key lime anthracnose strains of Colletotrichum from citrus as C. acutatum. Phytopathology 86:523-527. 1996. COCHRANE, V.W. Physiology of fungi. New York. John Wiley & Sons Inc. 1958. COUTO, E.F. MENEZES, M. Caracterização fisiomorfológica de isolados deColletotrichummusae. FitopatologiaBrasileira, v.29, p.406-412, 2004. FORSTER, H. & ADASKAVEG, J.E. Identification of subpopulations of Colletotrichumacutatum and epidemiology of almond anthracnose in California. Phytopathology 89:1056-1065. 1999. FREEMAN, S., KATAN, T. & SHABI, E. Characterization of Colletotrichum species responsible for anthracnose diseases of various fruits. Plant Disease 82:596-605. 1998. GALLI, F., TOKESHI, H., CARVALHO, P.C.T., BALMER, E., KIMATI, H., CARDOSO, C.O.N.SALGADO, C.L. Manual de Fitopatologia: doenças das plantas e seu controle. 2ª ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1978. GOES, A. & KIMATI, H. Caracterização morfológica de isolados de Colletotrichum acutatum e C.gloeosporioides associados à queda prematura dos frutos cítricos. SummaPhytopatologica 23:5-13. 1997. GUNNEL, P & GUBLER, WD Taxonomy and morphology of Colletotrichum species pathogenic to strawberry. Mycologia 84:157-165. 1992. INDEX FUNGORUM, Disponível em http://www.indexfungorum.org/Names/Names.aps, acessado em abril de 2010. 25
  26. 26. JOHNSTON, PR & JONES, D Relationships among Colletotrichum isolates from fruit-rots assessed using rDNA sequences. Mycologia 89:420-430, 1997. KIRK, P.M., CANNON, P.F., DAVID, J.C., STALPERS, J.A. Dictionary of the Fungi. 9th Ed. CABI Publishing, Wallingford, UK, 2001. LILLY, VG & BARNETT, HC Physiology of fungi. New York. McGraw-Hill, 1951. LOPEZ, A.M.Q. Taxonomia, patogênese e controle de espécies do gênero Colletotrichum. Revisão Anual de Patologia de Plantas 9:291-337. 2001. PERES, NA, TIMMER, LW, ADASKAVEG, JE & CORRELL, JC. Lifestyles of Colletotrichumacutatum. Plant Disease 89:784-796. 2005. SANGEETHA, C.G., RAWAL, R. D. Nutritional Studies of Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Penz. andSacc. The incitant of Mango Anthracnose. World Journal of Agricultural Sciences,vol. 4 n.6,p.717-720, 2008. SUTTON, B. C The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum.In BAILEY, J.A, JEGER, M. J. Colletotrichum: Biology pathology and control. British Society for Plant Pathology, CAB International, 1992. TANDON, R.N. & CHANDRA, S. The nutrition of Colletotrichum gloeosporioides PENZ. Mycopathology et. Mycology Applied 18:213-224. 1962. TOZZE JR., H.J., MELLO, M.B.A. & MASSOLA JR., N.S. Morphological and physiological characterization of Colletotrichum sp. isolates from solanaceous crops. Summa Phytopathologica 32:71-79. 2006. 26

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