Manivela

                                                                                       Suporte do bloco
        ...
Lente ocular




                                        Prisma




                                                    Le...
A                                           B




         C
    Fig. 1.3 Células da crista neural foram cultivadas e exam...
Fig. 1.4 Microscopia de luz polarizada. Um fragmento de mesen-
tério de rato foi corado com o método de picro-sirius, que ...
Alguns planos
                                                     focais possíveis

                                Lente...
Fonte
                                    de laser




                                          Rastreador da
           ...
Fig. 1.7 Fotomicrografia de células de rim de hamster em cultu-
ra, coradas com alaranjado de acridina. Por meio de um mic...
Fig. 1.8 Fotografia do microscópio eletrônico de transmissão 906E.
(Cortesia de Carl Zeiss.)
Catodo

 Anodo                                       Canhão eletrônico

Lente condensadora


     Bobina
     elétrica
   ...
Catodo

     Anodo                                          Canhão
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Fig. 1.11 Radioautogramas de glândulas salivares submandibulares de um camundongo que foi injetado com 3H-fucose 8 horas
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Fig. 1.12 Radioautogramas de cortes de órgãos de um rato que
foi injetado com 3H-timidina. Os radioautogramas foram expos-...
Fig. 1.13 Fotomicrografia de fibroblastos de galinha que foram
cultivados e infectados com Trypanosoma cruzi, que são as p...
Célula intacta
1



              Células
            dissociadas

2      Núcleos




3
     Mitocôndrias
     e lisossomo...
Fig. 1.15 Micrografias eletrônicas de três frações celulares isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. A: Fraç...
Fig. 1.16 Fotomicrografia de um corte de osso tratado por uma
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Fig. 1.17 Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método de
Gomori para demonstrar a enzima fosfatase alcalina. Os lo...
Fig. 1.18 Detecção de fosfatase ácida. Micrografia eletrônica de uma célula de rim de rato que mostra três lisossomos (L) ...
Fig. 1.19 Fotomicrografia de uma vilosidade intestinal corada pela
técnica de ácido periódico-Schiff. A intensa coloração ...
Fig. 1.20 Substâncias que têm grande afinidade por uma molé-
cula podem ser marcadas e usadas para identificar esta molécu...
Fig. 1.21 Alguns métodos de separação de proteínas: ultracentrifugação (A) e cromatografia (B). A: Uma
mistura de proteína...
B


                                                                  1           Gel




A
                              ...
Proteína X




                                           Proteína X




Fig. 1.23 Técnica direta de imunocitoquímica. (1)...
Proteína X




              Proteína X




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Fig. 1.24 Téc...
Fig. 1.25 Fotomicrografia de uma célula decidual de camundongo cultivada in vitro. A proteína desmina, que forma filamento...
Fig. 1.26 Fotomicrografia de um corte de in-
testino delgado no qual um anticorpo contra
a enzima lisozima foi aplicado pa...
Fig. 1.27 Antígeno carcinoembriônico é
uma proteína presente em vários tumores
malignos, principalmente da mama e intes-
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Fig. 1.28 Secção de uma célula acinosa do pâncreas que foi incubada com anticorpo antiamilase e em seguida incubada com pr...
Fig. 1.29 Corte de um tumor epitelial benigno (condiloma) sub-
metido a hibridização in situ. As áreas marrons são locais ...
Fig. 1.30 Como diferentes estruturas tridimensionais são obser-
vadas após serem cortadas em secções delgadas. A: Diferent...
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  1. 1. Manivela Suporte do bloco Bloco de parafina Fragmento de tecido Navalha Fig. 1.1 Micrótomo para cortar tecidos incluídos em parafina ou em resina. Acionando-se a manivela (à direita da figura), o bloco contendo o fragmento de tecido sobe e desce. Após cada volta da manivela, o bloco avança uma distância definida (geralmente 1-10 m) e, ao passar pela navalha, deixa uma fatia do tecido. (Cortesia de Microm.)
  2. 2. Lente ocular Prisma Lente objetiva Espécime Platina Condensador Filtro de luz Controles de movimento da platina Controles de ajuste de foco Lâmpada Espelho Fig. 1.2 Desenho esquemático de um microscópio de luz mostran- do seus componentes principais e o trajeto da luz desde a fonte luminosa até o olho do observador. (Cortesia de Carl Zeiss Co.)
  3. 3. A B C Fig. 1.3 Células da crista neural foram cultivadas e examinadas por meio de três sistemas ópticos diferentes. O preparado não está corado e as mesmas células aparecem em todas as fotografias – use as duas células pigmentadas para orientar-se em cada imagem. A: Microscopia de luz convencional. B: Microscopia de contraste de fase. C: Microscopia de diferença interferencial de contraste segun- do Nomarski. Grande aumento. (Cortesia de S Rogers.)
  4. 4. Fig. 1.4 Microscopia de luz polarizada. Um fragmento de mesen- tério de rato foi corado com o método de picro-sirius, que cora fibras de colágeno. O mesentério foi colocado sobre a lâmina e observado por transparência. Sob luz polarizada, as fibras de colágeno exibem intensa birrefringência e aparecem brilhantes ou em amarelo. Médio aumento.
  5. 5. Alguns planos focais possíveis Lente Espécime Detector Obstáculo com orifício Plano focalizado Fig. 1.5 Princípio da microscopia confocal. Luz originada de um plano do corte cruza o pequeno orifício existente em um obstá- culo e alcança um detector; no entanto, raios originados de ou- tros planos são bloqueados pelo obstáculo. Desta maneira, só um plano muito delgado do espécime é analisado de cada vez.
  6. 6. Fonte de laser Rastreador da Obstáculo iluminação com orifício Divisor de feixe Detector Lente Plano focalizado Espécime Fig. 1.6 Arranjo usual de um microscópio confocal. A ilumina- ção de uma fonte de laser atinge o espécime e é refletida. Um es- pelho dirige a luz refletida a um obstáculo que possui um peque- no orifício. A luz proveniente de planos do espécime que estão à frente ou atrás do plano focalizado é bloqueada pelo obstáculo. O laser varre o espécime para que uma área maior do corte possa ser observada.
  7. 7. Fig. 1.7 Fotomicrografia de células de rim de hamster em cultu- ra, coradas com alaranjado de acridina. Por meio de um micros- cópio de fluorescência, o DNA (no interior dos núcleos) emite luz amarela, enquanto o citoplasma rico em RNA aparece de cor avermelhada ou laranja. Grande aumento. (Cortesia de A Geraldes e JMV Costa.)
  8. 8. Fig. 1.8 Fotografia do microscópio eletrônico de transmissão 906E. (Cortesia de Carl Zeiss.)
  9. 9. Catodo Anodo Canhão eletrônico Lente condensadora Bobina elétrica Coluna Malha de cobre Porta-espécime com três cortes Lente objetiva Janela de vidro Lente intermediária Lente projetora Placa fluorescente Filme fotográfico Câmera CCD Fig. 1.9 Desenho esquemático de um microscópio de transmis- são com seus principais componentes.
  10. 10. Catodo Anodo Canhão eletrônico Lente condensadora Bobina elétrica Coluna Lente Rastreador Lente Amplificador Detector de sinal de elétrons Monitor Espécime Fig. 1.10 Desenho esquemático de um microscópio eletrônico de varredura com seus principais componentes.
  11. 11. Fig. 1.11 Radioautogramas de glândulas salivares submandibulares de um camundongo que foi injetado com 3H-fucose 8 horas antes do sacrifício. Em cima: ao microscópio de luz se observam grãos negros de prata (setas), que indicam as regiões celulares que estão radioativas. A maior parte da radioatividade está localizada nos grânulos citoplasmáticos das células dos ductos glandulares. Aumento médio. Embaixo: tecido preparado para observação em microscópio eletrônico de transmissão. Observe os grãos de prata que aparecem como estruturas enoveladas (setas) localizadas principalmente sobre os grânulos citoplasmáticos (G) e no lúmen (L) dos túbulos. Grande aumento. (Cortesia de T.G. Lima e A. Haddad.)
  12. 12. Fig. 1.12 Radioautogramas de cortes de órgãos de um rato que foi injetado com 3H-timidina. Os radioautogramas foram expos- tos durante um tempo muito longo e por esta razão os núcleos radioativos se tornaram fortemente marcados e aparecem cober- tos por uma grande quantidade de grânulos escuros. A: Muitas células epiteliais estavam se dividindo na base das glândulas intestinais, mas nenhuma no restante das vilosidades. B: Um corte de linfonodo mostra que a divisão de sua célula ocorre principal- mente nos centros germinativos desta estrutura. (Cortesia de Telma MT Zorn, Mauricio Soto-Suazo, Cleusa MR Pellegrini e WE Stumpf.)
  13. 13. Fig. 1.13 Fotomicrografia de fibroblastos de galinha que foram cultivados e infectados com Trypanosoma cruzi, que são as peque- nas partículas espalhadas pelo citoplasma (setas). Embora a se- paração entre as células não seja visível, os seus núcleos são fa- cilmente observados (N). Coloração pelo método de Giemsa. Médio aumento. (Cortesia de S. Yoneda.)
  14. 14. Célula intacta 1 Células dissociadas 2 Núcleos 3 Mitocôndrias e lisossomos Fig. 1.14 O fracionamento celular permite o isolamento de compo- 4 nentes da célula através de centrifugação diferencial. A coluna de desenhos na porção direita da figura mostra as organelas celulares obtidas ao fundo de cada tubo após cada centrifugação. A força Microssomos centrífuga é expressa em unidades g, equivalentes à força da gravi- dade. (1) Um fragmento de tecido é picado com uma navalha de barbear ou com tesoura e depois dissociado com um homogeniza- 5 dor ou por ultra-som. (2) O tecido dissociado permanece em repou- so durante cerca de 20 min para que grumos não dissociados e fi- bras da matriz extracelular precipitem. (3) O sobrenadante é centrifugado a 1.000 g por 20 min. Os núcleos são precipitados no Ribossomos fundo do tubo. (4) O sobrenadante é centrifugado a 10.000 g por 20 min. Mitocôndrias e lisossomos precipitam. (5) O sobrenadante é 6 centrifugado a 105.000 g por 120 min. Os microssomos precipitam. (6) Se o sobrenadante é tratado com desoxicolato de sódio antes da centrifugação, os microssomos se dissociam e precipitam separada- Membranas mente como ribossomos e membranas do retículo endoplasmático do retículo granuloso. (Redesenhado e reproduzido, com permissão, de Bloom endoplasmático W, Fawcett DW: A Textbook of Histology, 9a ed. Saunders, 1968.)
  15. 15. Fig. 1.15 Micrografias eletrônicas de três frações celulares isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. A: Fração de mito- côndrias, contaminada com retículo endoplasmático. B: Fração de microssomos. C: Fração de lisossomos. Grande aumento. (Corte- sia de P. Baudhuin.)
  16. 16. Fig. 1.16 Fotomicrografia de um corte de osso tratado por uma técnica histoquímica para demonstrar íons cálcio. O precipitado escuro indica a presença de fosfato de cálcio no osso e na cartila- gem calcificada. Tecido cartilaginoso não calcificado (corado em marrom) está na metade superior da figura. Médio aumento. (Fotomicrografia obtida por P.A. Abrahamsohn.)
  17. 17. Fig. 1.17 Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método de Gomori para demonstrar a enzima fosfatase alcalina. Os locais onde esta enzima está presente (superfícies celulares) estão es- curos devido ao precipitado de sais de chumbo (setas). Médio aumento.
  18. 18. Fig. 1.18 Detecção de fosfatase ácida. Micrografia eletrônica de uma célula de rim de rato que mostra três lisossomos (L) junto de um núcleo (N). O depósito escuro no interior destas organelas é fosfato de chumbo que precipitou nos locais onde havia fosfatase ácida. Grande aumento. (Cortesia de E Katchburian.)
  19. 19. Fig. 1.19 Fotomicrografia de uma vilosidade intestinal corada pela técnica de ácido periódico-Schiff. A intensa coloração na bordadura em escova da superfície celular (setas curtas) e no produto de secreção das células caliciformes (setas longas) é de- vida ao alto conteúdo de polissacarídeos nestas estruturas. Cor- te contracorado com hematoxilina. Grande aumento.
  20. 20. Fig. 1.20 Substâncias que têm grande afinidade por uma molé- cula podem ser marcadas e usadas para identificar esta molécu- la. (1) A molécula A tem uma afinidade intensa e específica por uma porção da molécula B. (2) Se A e B são colocadas em contacto, A se liga com a porção de B que ela reconhece. (3) Um marcador, visível em microscopia de luz ou eletrônica, pode ser ligado à molécula A. O marcador pode ser um composto fluorescente, uma enzima como a peroxidase, uma partícula de ouro ou um átomo radioativo. (4) A molécula B pode ser detectada se estiver pre- sente em uma célula ou na matriz extracelular que forem incu- badas com a molécula A.
  21. 21. Fig. 1.21 Alguns métodos de separação de proteínas: ultracentrifugação (A) e cromatografia (B). A: Uma mistura de proteínas obtida de células ou de tecidos homogeneizados é submetida a centrifugação em alta velocidade por várias horas. As proteínas se separam em bandas, de acordo com o tamanho e a den- sidade das moléculas. Em seguida, o meio em que foi feita a centrifugação é drenado e dividido em várias frações que contêm as diferentes proteínas, que podem então ser analisadas separadamente. B: Uma solu- ção contendo uma mistura de proteínas é colocada em uma coluna preenchida por partículas dotadas de diferentes propriedades. As partículas podem, por exemplo, ter diferentes cargas eletrostáticas (atraindo proteínas de acordo com suas cargas) ou podem ter poros (agindo como peneiras para moléculas de dife- rentes tamanhos). Durante a migração das proteínas pela coluna, seu movimento é retardado pela intera- ção com as partículas. Quando o líquido da coluna é recolhido, diferentes grupos de proteínas podem ser coletados separadamente.
  22. 22. B 1 Gel A Gel Proteínas de massa Amostras 1 molecular conhecida 2 Filme de raio X 2 Gel Gel 3 3 Gel Fonte de Membrana de energia nitrocelulose Fig. 1.22 Separação de proteínas por eletroforese em gel. A: Isolamento das proteínas. (1) Misturas de proteínas são obtidas de células e tecidos homogeneizados. Elas são freqüentemente tratadas com um detergente (dodecil sulfato de sódio) e com mercaptoetanol para desenovelar e separar as cadeias e subunidades de proteínas. (2) As amostras são colocadas na porção superior de uma placa de gel de poliacrilamida, a qual é submetida a uma corrente elétrica contínua. (3) As proteínas migram ao longo do gel de acordo com seu tamanho e forma. Uma mistura de proteínas conhecidas também é colocada no gel para servir como padrão de pesos moleculares. B: Detecção e identificação das proteínas. (1) Coloração. As proteínas são coradas e a intensidade de coloração é proporcional à concentração das proteínas. (2) Radioautografia. Se algumas proteínas forem radioativas, elas poderão ser reconhecidas por radioautografia. Para isto, um filme de raios X é colocado sobre o gel durante algum tempo e de- pois revelado. Proteínas radioativas serão denunciadas por manchas escuras no filme de raio X. (3) Immunoblotting. As proteínas podem ser transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose. Esta é incubada com um anticorpo que reconhece proteínas que podem estar presentes nas amostras.
  23. 23. Proteína X Proteína X Fig. 1.23 Técnica direta de imunocitoquímica. (1) Molécula de imunoglobulina (Ig). (2) Produção de anticorpo policlonal. A proteína X de um rato é injetada em um animal de outra espécie, por exemplo, um coelho. Várias Igs de coelho são produzidas contra a proteína X. (3) Marcação do anticorpo. As Igs de coelho são acopladas a um marcador. (4) Reação imunocitoquímica. As Igs marcadas reconhecem e se ligam a diferentes porções da pro- teína X presentes em um corte, que pode ser observado no mi- croscópio.
  24. 24. Proteína X Proteína X Proteína X Fig. 1.24 Técnica indireta de imunocitoquímica. (1) Produção de um anticorpo policlonal primário. A proteína X de um rato é in- jetada em um animal de outra espécie, por exemplo, um coelho. Várias Igs de coelho são produzidas contra a proteína X. (2) Pro- dução de um anticorpo secundário. Ig de um outro coelho, nor- mal e não imunizado, é isolada e injetada em um animal de uma terceira espécie, por exemplo, uma cabra. São produzidas Igs de cabra contra Igs de coelho. As Igs de cabra são purificadas e acopladas a um marcador. (3) Primeira etapa da reação imunoci- toquímica. As Igs de coelho reconhecem e se ligam a diferentes porções da proteína X. (4) Segunda etapa da reação imunocito- química. As Igs de cabra marcadas reconhecem e se ligam às Igs de coelho, indicando a presença da proteína X.
  25. 25. Fig. 1.25 Fotomicrografia de uma célula decidual de camundongo cultivada in vitro. A proteína desmina, que forma filamentos in- termediários que fazem parte do citoesqueleto, foi detectada com uma técnica de imunofluorescência (imunocitoquímica) indireta. Uma malha de filamentos intermediários fluorescentes ocupa a maior parte do citoplasma. O núcleo (N) está corado em azul. Gran- de aumento. (Cortesia de Fabiano G Costa e P.A. Abrahamsohn.)
  26. 26. Fig. 1.26 Fotomicrografia de um corte de in- testino delgado no qual um anticorpo contra a enzima lisozima foi aplicado para demons- trar lisossomos em macrófagos e em células de Paneth. A cor marrom é o resultado da reação feita para demonstrar a enzima pero- xidase, marcador acoplado ao anticorpo se- cundário. Núcleos contracorados com hema- toxilina. Médio aumento.
  27. 27. Fig. 1.27 Antígeno carcinoembriônico é uma proteína presente em vários tumores malignos, principalmente da mama e intes- tinos. Esta fotomicrografia é uma demons- tração imunocitoquímica de antígeno carcinoembriônico em uma secção de um adenocarcinoma de intestino grosso. O an- ticorpo estava marcado com peroxidase, evidenciada pela cor marrom. Contracolo- ração: hematoxilina. Médio aumento.
  28. 28. Fig. 1.28 Secção de uma célula acinosa do pâncreas que foi incubada com anticorpo antiamilase e em seguida incubada com prote- ína A marcada com partículas de ouro. A proteína A tem uma alta afinidade por moléculas de anticorpo. As partículas de ouro são vistas como pequenos pontos pretos sobre os grânulos de secreção maduros e sobre os grânulos imaturos em formação no complexo de Golgi. Eletromicrografia. Grande aumento. (Cortesia de M Bendayan.)
  29. 29. Fig. 1.29 Corte de um tumor epitelial benigno (condiloma) sub- metido a hibridização in situ. As áreas marrons são locais onde o DNA de vírus de papiloma humano tipo 2 (HPVII) está presen- te. Contracoloração: hematoxilina. Médio aumento. (Cortesia de JE Levi.)
  30. 30. Fig. 1.30 Como diferentes estruturas tridimensionais são obser- vadas após serem cortadas em secções delgadas. A: Diferentes secções de uma esfera oca e de um tubo oco. B: Um corte ao lon- go de um único tubo enovelado pode ser visto como cortes de vários tubos. C: Cortes através de uma esfera sólida e através de um cilindro sólido podem ser semelhantes.

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