Разработка тканеинженерных трансплантатов на основе клеток постнатального организма - Дашинимаев Эрдэм Баирович, к.б.н., Васильев Андрей Валентинович, д.б.н., профессор, Терских Василий Васильевич, д.б.н., профессор, Институт биологии развития РАН, г. Москва

1. Разработка тканеинженерных
трансплантатов на основе клеток
постнатального организма
Дашинимаев Э.Б., Васильев А.В., Терских В.В.
Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова
РАН

2. РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ БИОМЕДИЦИНА
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ СТИМУЛЯЦИЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНЕВАЯ
ТКАНЕЙ И РЕГЕНЕРАЦИИ КЛЕТОК ИНЖЕНЕРИЯ
ОРГАНОВ ПОРАЖЕННЫХ (Цитотерапия)
ТКАНЕЙ

3. Органы и Клеточные Лекарственные
ткани трансплантаты средства
Трансплантация Трансплантация Процесс
живых структур живых структур производства
без модификации после
модификации в
процессе
производства

4. Тканевая инженерия – безальтернативное
будущее трансплантологии
•Возможность подготавливать тканевые конструкции in vitro
•Возможность использовать аллогенные и аутологичные клетки,
заготовленные заранее (Biobanking)
•Возможность широко использовать живое донорство
•Отмена или снижение потребности в иммуносупрессии
•3D‐структуры
•Биосовместимый (деградируемый и недеградируемый)
матрикс
•Клеточно‐матриксные взаимодействия
•Использование многоклеточных конструкций

5. КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
И ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Плюрипотентные
стволовые клетки
(эмбриональные и
индуцированные Культивированные
стволовые клетки) клетки
Постнатальные
стволовые клетки

6. ПОСТНАТАЛЬНЫЕ
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

7. Высокий уровень
обновления
Низкий уровень обновления
Высокий регенеративный
потенциал Высокий регенеративный
потенциал
Низкий уровень
обновления
Низкий регенеративный
потенциал
Клетки крови Печень Мозг Спинной мозг
Эпидермис Скелетные мышцы Сетчатка
Эпителий кишечника, Поджелудочная железа Почка Сердце
молочной железы

8. Классификация стволовых Эмбриональные
клеток: Фетальные
Взрослые
По: M. Rao, 2004
Тотипотентные Зигота
Плюрипотентные ЭСК
Мультипотентные Мезенхимальная стволовая
клетка, Кроветворная стволовая
клетка, Эпидермальная
стволовая клетка
Унипотентные Сателлитная клетка мышц
По: Wagers, Weissman, 2004

9. КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Lajtha (1979)
1. Стволовые клетки – самоподдерживающаяся клеточная
субпопуляция
2. Стволовые клетки содержатся в тканях в состоянии
пролиферативного покоя или крайне медленно циклируют
3. Содержание стволовых клеток в тканях крайне низкое в
пределах 1-3%
4. Стволовые клетки активируются при повреждении
5. Стволовые клетки дают начало дифференцированным и
стволовым клеткам

10. Постнатальные стволовые клетки

11. МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
Максимов А.А. 1915
Фриденштейн А.Я. 1976, 1987
Каплан А. (Caplan A.) 1991
•Адгезивность к пластику в стандартных условиях in vitro;
•Способность к дифференцировке in vitro в остеобласты, хондробласты и
адипоциты;
•Экспрессия специфических поверхностных маркеров.
«+» «-»
CD105 (эндоглин, CD45 – лейкоциты
рецептор к TGFβ) CD34 – кроветворные и
CD73 (экто-5’-нуклеотидаза) эндотелиальные клетки
CD90 (Thy1 – семейство CD14 и CD11b – макрофаги
иммуноглобулинов) и моноциты
CD79a и CD19 – B лимфоциты
HLA-DR

12. Локализация стволовых клеток в различных
типах эпителия (Miller et al., 1993)

14. Стволовые клетки сердца

15. Принципы восстановления структуры
или функции тканей тканевыми эквивалентами
Аутологичные Аллогенные
•Стимуляция
•Замещение регенерации
Восстановление
структуры/функции
•Создание условий
(ниша) для замещения

16. Аутологичные клеточные
трансплантаты
Функция замещения

17. Трансплантация пласта аутологичных кератиноцитов
На 7 сутки после Гистология участка кожи после
трансплантации восстановления с помощью
трансплантации аутологичных
кератиноцитов
НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

18. Сочетанное применение аллогенных и аутологичных трансплантатов в
лечении критических и сверхкритических ожогов
Клинический случай лечения 12‐летней девочки с ожогами 60% тела.
Республиканская детская клиническая больница
Доктор А.В. Быстров

19. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЖИВОГО ЭКВИВАЛЕНТА КОЖИ С АУТОЛОГИЧНЫМИ
КЕРАТИНОЦИТАМИ
Клетки окрашены DIO
Трансплантация
в уретру
Обогащение стволовыми
кератиноцитами (Са2+ free
medium)
Кожные кератиноциты
Данные О.С. Роговой (ИБР) и д.м.н.
А.К. Файзулина (МГСУ)

20. Участок уретры в месте перехода нативного
эпителия в восстановленный с
использованием эпидермальных
кератиноцитов
Данные О.С. Роговой (ИБР) и д.м.н.
А.К. Файзулина (МГСУ)

21. РЕКОНСТРУИРОВАННАЯ УРЕТРА КРОЛИКА
(40 дней после трансплантации живого эквивалента кожи)
Di o Hoechst К7 Данные О.С. Роговой (ИБР) и д.м.н.
А.К. Файзулина (МГСУ)

22. РЕКОНСТРУИРОВАННАЯ УРЕТРА КРОЛИКА
(40 дней после трансплантации)
GFP Hoechst
Данные О.С. Роговой

23. Аллогенные клеточные
трансплантаты
Индукция регенерации

24. Трансплантация пластов Вид ран на 6-е сутки с
аллогенных кератиноцитов на момента трансплантации
гранулирующие раны (50-е аллогенных кератиноцитов
сутки с момента ожога)
Вид ран на 10-е сутки с
момента трансплантации
аллогенных кератиноцитов
Работа проведена совместно с НИИ СП
им. Н.В. Склифосовского

25. Восстановление кожного покрова трансплантацией
аллогенных выращенных эпидермальных пластов на глубокие
ожоги (IIIБ - IV степени).
НИИ скорой Военно- Всего по
помощи им. Н.В. медицинская двум
Склифосовского академия клиникам
Полное 7(32%) 2 (33,3%) 9(32.1%)
восстановление
Частичное 7(32%) 2 (33,3%) 9(32,1%)
восстановление
Отсутствие 8(36%) 2 (33,3%) 10(35%)
восстановления
Всего 22 6 28

26. Распределение компонентов внеклеточного матрикса, миофибробластов и
моноцитов/макрофагов в длительно незаживающих ранах до начала лечения
и после трансплантации аллогенного выращенного эпидермиса.
Иммуногистохимические В ране до 5-е сутки 10-е сутки 15-е сутки
трансплан- после после после
маркеры тации трансплан- трансплан- трансплан-
тации тации тации
Коллаген I типа ++ ++ ++ ++
Коллаген III типа -/+ + ++ ++
Ламинин ++ ++ + +
Тенасцин +++ ++ + -/+
CD68+ клетки +++ ++ ++ +
αSMA+ клетки + + + +
Критерии оценки: « - » – реакция отсутствует, « -/+ » - слабоположительная
реакция, « + », « ++ », « +++ » - степени выраженности положительной реакции.
Работа проведена совместно с Институтом молекулярной медицины ММА

27. Экспрессия факторов роста, провоспалительных цитокинов, MMP-9 и
TIMP-1/TIMP-2 в длительно незаживающих ранах до начала лечения и
после трансплантации аллогенного эпидермиса.
Иммуногистохимические В ране до 5-е сутки 10-е сутки 15-е сутки
трансплан- после после после
маркеры тации трансплан- трансплан- трансплан-
тации тации тации
bFGF -/+ ++ ++ ++
TGF-β - ++ + / ++ +
IL-1β +++ ++ + +
MIP-1α -/+ + + -/+
MIP-1β ++ + + -/+
MMP-9 ++ + + +
TIMP-1 - / -/+ -/+ + +
TIMP-2 - / -/+ -/+ + +
Критерии оценки: « - » – реакция отсутствует, « -/+ » - слабоположительная
реакция, « + », « ++ », « +++ » - степени выраженности положительной реакции.

28. Язва роговицы 3 недели после После двух последовательных
щелочного ожога трансплантаций фибробластов
в коллагеновом геле с
интервалом в 5 дней
Институт глазных болезней им.Г. Гельмгольца,
д.м.н. П.В. Макаров

29. Механизм регенерации роговицы
Процесс эпителизации
Миграция
фибробластов
реципиента
5‐ сутки
14‐ сутки 30 сутки
Работа проведена совместно с Институтом молекулярной медицины ММА

30. Методика резекции и пластики гортани
Схема лоскута
Костный фрагмент с
титановой пластиной
Имплантация живого
кожного эквивалента

31. Функциональный результат
Эндофото надскладочного Эндофото подскладочного
отдела гортани отдела гортани

32. Живой эквивалент кожи
как универсальный
Кожа
эпителио-мезенхимный
эквивалент
Роговица
Уретра
Гортань

33. Клеточная пластичность – новые
возможности тканевой инженерии

34. Пределы пластичности клеток для тканевой инженерии
В пределах
Во все ткани
зародышевого
организма
В пределах ткани листка
Плюрипотентные
Соматические клетки Мультипотентные стволовые клетки
стволовые клетки (эмбриональные и
индуцированные
стволовые клетки)

35. Фибробласты – миофибробласты. Контракция коллагенового
геля. Экспрессия гладкомышечного актина.
α‐SMA
Сканирующая электронная микроскопия
коллагенового геля с включенными фибробластами
культуральная чашка
Флотирующий
коллагеновый гель коллагеновый гель
фибробласты

36. Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток при культивировании в
индукционных средах
Клетки Фенотип Адипогенез Остеогенез
А/О Oil Red O Лептин Остеопонтин Остеонектин
Oil Red O/ Лептин / DAPI Остеопонтин/DAPI Остеонектин/DAPI
гематоксилин
Клетки
дермальной +-/+
папиллы
Клетки стромы +/+
жировой ткани
Фибробласты
дермы кожи +-/-
Клетки
дермальной
папиллы в -/-
контрольной
среде
Киселева и др., Цитология, 2009

37. Жизненно важные нерешенные проблемы
тканевой инженерии
•Нервная ткань
•Кардиомиоциты
•Гепатоциты
•Инсулин‐продуцирующие клетки
РЕШЕНИЕ: индуцированная плюрипотентность
или
прямая трансдифференцировка

38. Oct 3/4,
Sox2, Klf4, c‐
myc
Индуцированная плюрипотентность (iPS cells)
iPS
K. Takahashi,….., S. Yamanaka, 2007, Cell

39. Спасибо за внимание!