2. Etapas
Hígado (Muestra)
1) Extracción de RNA total 1
RNA total
2) Síntesis de cDNA 2
cDNA
3
3) PCR
Producto PCR
3. 1) Extracción de RNA total
Materiales necesarios (esterilizados)
- Tubos eppendorf de 1 ml
- Tubos eppendorf de 0.6 ml
- Tubos eppendorf de 0.2 ml
- Puntas amarillas (p200)
- Puntas azules (p1000)
- Puntas blancas (p20 y p10)
- Puntas cortadas (p200)
- Vaso precipitado
4. 1) Extracción de RNA total
Previo a iniciar la técnica de purificación debemos
asegurarnos de:
Limpiar bien el sector (mesón y materiales) donde se
va a realizar la técnica con detergente, alcohol y
solución RNAsa ZAP en spray.
Calentar la placa térmica hasta 80°C
Preparar gel de agarosa al 1%
(Sugerencia: 0,3 gr. de agarosa en 30 ml
de TAE 1x + 2 ul de Bromuro de etidio)
T°
5. Protocolo
1) Muestras* Nitrógeno líquido
2) Agregar 100 ul de Solución de Lysis a tubo eppedorf de 1 ml (fondo cónico)
3) Extraer un trozo de muestra de hígado (-80°C, 2-3 mm de diámetro, 15 mg)
4) Homogenizar con bagueta hasta obtener un macerado (enjuagar pinza y bagueta
con Agua DEPC después de ser utilizada con cada muestra).
Luego agregar 100ul más de la misma solución de lysis y continuar con la
homogenización. Dejar en hielo y centrifugar a 10000 rpm por 1 minuto.
6. Protocolo
5) En un segundo tubo eppendorf de 1 ml; agregar 200ul de etanol frío al 64%.
6) Extraer el sobrenadante del lisado con punta cortada y agregarlo a los tubos
con etanol (mezclar lento por inversión).
7) Colocar las columnas (filtro) en tubos de recolección. Humedecer con
solución de lisis o con etanol 64% (1 gota aprox.) el filtro de la columna.
*Calentar solución de elusión a 80°C (se utilizan 60uL por muestra)
8) Agregar al filtro con punta cortada la mezcla obtenida en el paso 6 (siempre
dejándola en hielo) y centrifugar a 10500 rpm durante 30 segundos, luego
eliminar el filtrado.
7. Protocolo
9) Agregar a la columna 700ul de la solución de lavado #1 (Wash Solution 1) y
dejar en hielo.
10) Centrifugar a 10500 rpm por 30 segundos. Eliminar el filtrado.
11) Agregar 500ul de solución # 2/3 (Wash Solution Concentrate).
12) Centrifugar a 10500 rpm por 30 segundos. Eliminar filtrado.
13) Repetir pasos 11 y 12.
14) Secar la columna con un pulso adicional (10500 rpm por 30 seg). Eliminar
filtrado.
8. Protocolo
15) Traspasar la columna (filtro) a otro* tubo eppendorf de recolección y
agregar 25ul de solución de elusión previamente calentada a 80°C.
16) Centrifugar a 10500rpm por 30 segundos, esta vez conservando el filtrado
(ácidos nucleicos).
17) Agregar 25 ul de la solución de elusión y volver a centrifugar a 10500rpm
por 30 segundos. También se debe conservar el filtrado.
18) Agregar 10 ul más de la misma solución de elusión y centrifugar a 10500rpm
por 30 segundos. Conservar el filtrado (contiene el RNA total).
9. Protocolo
19) Separar el filtrado en 2 tubos eppendorf con 3 ul* cada uno.
Correr en el Gel
Cuantificar RNA en Espectrofotómetro (260nm y 280nm)
Lo que queda se guarda a -80°C para ser utilizado posteriormente en la
síntesis de cDNA
10. Preparación de la muestra para determinar
integridad del RNA
5 uL de agua DEPC
2 uL de azul de bromofenol
2 uL de muestra
Cargar 9 uL de la mezcla en el gel de agarosa 1%
(30 min. / 80 Volts)
Observar en el Transiluminador UV
13. Medición de la contaminación de la muestra de
RNA con Proteínas
Blanco: 1 ml de agua bidestilada
2 uL de la muestra + 1000 ul de agua bidestilada
Diluída 500 veces
Medir la absorbancia a 260nm y 280nm.
Calcular la relación 260nm/280nm RNA/proteínas (Aceptable > 1,6).
Calcular la concentración de RNA en la muestra.
Concentración de RNA (ug/ml) = Abs 260 nm * factor de dilución (500) * 40
(ug/ml ug/ul)
14. EJEMPLO
Abs. 260nm = 0,013
[RNA] (ug/ml) = Abs260nm * 500 * 40
[RNA] (ug/ml) = 0,013 * 500 * 40
[RNA] = 260 ug/ml
260 ug 1000 ul
x 1 ul
x = 0,26 ug RNA / ul
15. 2) Síntesis de cDNA
En un tubo eppendorf de 0.2 ml, mezclar el Primer, RNA, dNTP mix y llevar a un
volumen de 12 uL con Agua DEPC:
Componente Cantidad
Primer (Random Primer)* 1 uL
RNA (10pg – 5ug)* x uL
10 Mm dNTP Mix 2 uL
Agua DEPC Llevar a 12 uL
16. El cálculo de los uL de RNA depende de la cantidad que se desee utilizar
(10pg – 5ug).
Ejemplo: x ug 1 uL
y ug z uL
x = ug calculados a partir de la absorbancia a 260 nm
y = ug elegidos para realizar la síntesis de cDNA
z = uL que se deben agregar al tubo para obtener la cantidad elegida
17. EJEMPLO
Abs. 260nm = 0,013 0,26 ug RNA / ul
ug de RNA total escogidos = 0,5 ug * (Constante)
0,26 ug RNA 1 ul Componente Cantidad
0,5 ug RNA x Primer (Random Primer) 1 uL
RNA (0,5 ug) 1,92 uL
x = 1,92 ul 10 Mm dNTP Mix 2 uL
Agua DEPC 7,08 uL
Volumen Total 12 uL
- Denaturar el RNA y los primers incubando a 65°C por 5 min.
- Poner en hielo 1
18. Preparar el Master Mix:
Componente 1 Reacción 10 Reacciones
5X cDNA Synthesis Buffer 4 uL 40 uL
0.1 M DTT 1 uL 10 uL
RNase OUT (40u/uL) 1 uL 10 uL
Agua DEPC 1uL 10 uL
ThermoScript RT (15 1uL 10 uL
units/uL)
Vortexear el 5X cDNA Synthesis Buffer por 5 seg. justo antes de usar
19. • Pipetear 8 uL del Master Mix y agregar en cada uno de los tubos que contienen el
RNA (siempre en hielo)
8 uL
Master Mix 5X*
1 2 3 4
20. Transferir los tubos a un termociclador según el siguiente programa*:
Random Primer: 25°C por 10 min.
Corresponde al Programa E29
55°C por 40 min. (R1HEXAM) del Termociclador
85°C por 5 min. Thermo
4° C por 000*
*El programa depende del primer usado (Random Primer, oligoDT, GSP)
Una vez obtenido el cDNA, guardar los tubos a -20°C para ser utilizados
posteriormente en el PCR
