Laboratório de riquetsias

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Laboratório de riquetsias

  1. 1. Elvira Maria Mendes do Nascimento Pesquisador Científico
  2. 2. LACEN - SP
  3. 3. DOENÇAS RIQUETSIAIS HUMANAS:   Febre Maculosa   Tifo murino   Febre Q / Endorcardite por Coxiela   Erliquioses   Bartoneloses   Angiomatose Bacilar   Doença da Arranhadura do Gato   Endocardite por Bartonela (projeto INCOR)
  4. 4. Pesquisa de anticorpos específicos para o Grupo da Febre Maculosa - Reação de Imunofluorescência Indireta em amostras de soro pareadas (intervalo ≥ 15 dias) 64 128 256 512 1024 C+ 64 128 256 512 1024 128 C- Antígeno – Cultura Concentrada de Riquétsias do Grupo Febre Maculosa 64 256 512 1024 C+ C- Anti IgG/M Humano Marcado com Fluoresceína Negativo Positivo • Cor e Forma
  5. 5. A B C D Figura 1: Reação de IFI para Grupo Febre Maculosa: A- controle negativo, IgG (10X); B- controle negativo (40X); C- controle positivo,IgG (10X); D- controle positivo (40X)
  6. 6. Pérolas de vidro Agitação no vortex Centrifugação 2500 rpm 25°C 1 hora Incubação 37°C 5 dias BHI 1mL Coágulo 5mL sangue Positivo focos Incubar com soro IgG positivo para FM Negativo Anti IgG Marcado com Fluoresceína
  7. 7. A B C D E F Fig 2 – Isolamento em cultura celular (Vero) identificação por Imunofluorescência indireta para riquétsias do Grupo da Febre Maculosa: A- controle negativo (10x); B- controle negativo (20x); C- controle negativo (40x); D- isolamento positivo (10x); E- isolamento positivo (20x); Fisolamento positivo (40x); Fonte: Santos et al. Fotomicroscópio Zeiss, modelo Axioskop 2 plus Fotografado por Dra Jussara Bianchi Castelli do Laboratório de Patologia do InCor-HCFMUSP.
  8. 8. Immunohistoquímica para Rickettsia spp Immunohistochemical   assay   showing   granular   an3gen   staining   in   endothelium   (polyclonal   an3-­‐   Ricke:sia  an3body-­‐    X400)   Fonte: Dra. Roosecelis A. Brasil, Centro de Patologia - IAL
  9. 9. LightCycler® 480 Roche Applied Biosystems 7500 Real-Time Life Technologies
  10. 10.  PCR é uma reação baseada na replicação do DNA  Extração do ácido nucléico através kit comercial (coluna de sílica)  O DNA do agente infeccioso é amplificado e o sinal dessa amplificação é captado pelo aparelho (composto fluorescente)
  11. 11. A FMPCR atualmente é constituído por 3 reações de qPCR:   uma para Rickettsia spp (gene gltA, com detecção por sonda TaqMan®)   um para riquétsias Grupo Febre Maculosa (gene OmpA, com detecção por SYBR Green)   um controle interno endógeno (RNAse P humana, com detecção por sonda TaqMan®)
  12. 12. Validação dos ensaios de PCR em tempo real Curva de concentração decrescente para reação de qPCR para Rickettsia spp analisada no ABI7500
  13. 13. Curva padrão de eficiência para reação de qPCR para Rickettsia spp analisado no ABI7500 Template DNA de Rickettsia rickettsii em co-cultivo de células Vero [ ] estimada: 10+7 cópias/mL
  14. 14. LightCycler® 480 Roche Curva de concentração decrescente para o protocolo de qPCR para riquétsias GFM, analisada no LC480-ROCHE
  15. 15. LightCycler® 480 Roche Curva dissociação dos produtos amplificados Curva padrão de eficiência para o protocolo riquétsia GFM, analisado pelo LC480-Roche
  16. 16. Bacteremia •  Período (curto) • Intensidade -mais frequentemente -Fácil processamento vasculite aguda compatível com casos de óbito -podem ser utilizados 40 casos Não fatais 10 positivos soroconversão 1ª amostra IgG<64 Sensibilidade 25% Em casos não fatais 30 negativos
  17. 17. AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA PCR EM TEMPO REAL PARA O DIAGNÓSTICO DA FEBRE MACULOSA BRASILEIRA EM CASOS FATAIS Nos anos de 2010 e 2012 - casos fatais suspeita clínica e/ou epidemiológica de FMB:
  18. 18. Concordância entre os resultados foi de 100% Concordância entre os resultados foi baixa (kappa=0,096, p-valor=0,435, intervalo de confiança 95% de 0,336 a –0,144). RIFI positivo=título de anticorpos tipo IgG e/ou IgM≥128
  19. 19. 31,6% casos como positivos para FMB concordância entre os resultados foi baixa (kappa=0,186, p-valor=0,005, intervalo de confiança 95% de 0,316 a –0,056). FMPCR foi um avanço o diagnóstico laboratorial da FMB
  20. 20. 156 152 38 42 (36 casos) (41 casos) -2011 a partir de maio 23% -2012 até 26 de outubro 28% Fonte: SIGH
  21. 21. Material de escara de inoculação/ sufusão hemorrágica
  22. 22. Elvira Maria Mendes do Nascimento Pesquisador Científico emmendes55@gmail.com Fabiana Cristina Pereira dos Santos Pesquisador Científico Sílvia Colombo Assistente Técnica de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica Nilcéia de Lourdes Ramos Arruda Auxiliar de Laboratório

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