Apostila analise de leites e derivados

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Apostila analise de leites e derivados

  1. 1. UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA DEPARTAMENTO DE ENGENHERIA DE ALIMENTOS APOSTILA DE ANÁLISES LABORATORIAIS – LABORATÓRIO DE LEITES E DERIVADOS PONTA GROSSA FEVEREIRO DE 2010
  2. 2. SUMÁRIO DETERMINAÇÃO DE ACIDEZ EM LEITE............................................................................5 1) ALIZAROL........................................................................................................................5 2) DETERMINAÇÃO DE pH................................................................................................5 3) MÉTODO EM % DE ÁCIDO LÁCTICO E ºDORNIC.....................................................6 4) PROVA DO ÁLCOOL.......................................................................................................9 DETERMINAÇÃO DE ACIDEZ EM BANHA – BUTTER OIL...........................................10 ACIDEZ EM LEITE EM PÓ....................................................................................................12 DETERMINAÇÃO DE ACIDEZ EM QUEIJOS....................................................................14 AMIDO EM LEITE EM PÓ.....................................................................................................16 ANTI-OXIDANTES EM LEITE EM PÓ.................................................................................17 ADULTERANTES EM LEITE................................................................................................18 1) ÁCIDO BÓRICO OU BORATOS EM LEITE E DERIVADOS....................................18 2) ÁGUA OXIGENADA......................................................................................................18 3) ALCALINOS (BICARBONATO DE SÓDIO)................................................................19 4) AMIDO.............................................................................................................................20 5) CLORETOS......................................................................................................................20 6) CLORO E HIPOCLORITOS...........................................................................................21 7) FORMOL com floroglucina.............................................................................................22 8) NITRATO EM LEITE......................................................................................................23 9) SACAROSE EM LEITE – PROVA QUALITATIVA....................................................24 ALCALINIDADE DAS CINZAS............................................................................................26 CINZAS....................................................................................................................................27 CONSERVADORES, ANTISSÉPTICOS E INIBIDORES BACTERIANOS........................28 1) INVESTIGAÇÃO RÁPIDA DE PENICILINA...............................................................28 2) ÁGUA OXIGENADA (ADIÇÃO RECENTE)................................................................28 3) FORMOL OU FORMALDEÍDO.....................................................................................28 4) ÁCIDO SALICÍLICO......................................................................................................28 5) ÁCIDO BÓRICO..............................................................................................................29 6) DICROMATO DE POTÁSSIO........................................................................................29 7) PROVA DE ALCALINOS NO LEITE............................................................................29 8) CARBONATOS...............................................................................................................29 CORANTES ARTIFICIAIS (Corantes ácidos ou básicos)......................................................30 DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE....................................................................................32 1) DETERMINAÇÃO DE DENSIDADE POR LACTODENSÍMETRO...........................32 2) DETERMINAÇÃO DE DENSIDADE POR PICNÔMETRO........................................32 3) TABELA DE CORREÇÃO DA DENSIDADE...............................................................33 ...................................................................................................................................................34 DETERMINAÇÃO DA FORÇA DO COALHO.....................................................................35 DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO EM QUEIJO POR COMPLEXOMETRIA (EDTA).........37 DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO POR PRECIPITAÇÃO COM OXALATO-KMnO4.........39 DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO EM QUEIJO PELO MÉTODO DA DUREZA PARCIAL EM ÁGUA................................................................................................................................42 DETERMINAÇÃO DE CASEÍNA – MÉTODO DIRETO E INDIRETO..............................47 1) MÉTODO DIRETO:........................................................................................................47 2) MÉTODO INDIRETO.....................................................................................................48 DETERMINAÇÃO DE CASEÍNA EM LEITE PELO MÉTODO DO FORMOL.................49 DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO – PROF. LÚCIA.............................................................52 DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO EM ALIMENTOS PELOS REAGENTES METAVANADATO E MOLIBDATO DE AMÔNIO – PROF. CONTRERAS.....................54
  3. 3. DETERMINAÇÃO DE GORDURA PELO MÉTODO DE BLIGH-DYER...........................56 DETERMINAÇÃO DE GORDURA PELO MÉTODO DE GERBER...................................58 1) LEITE...............................................................................................................................58 2) NO CREME......................................................................................................................59 3) NO QUEIJO......................................................................................................................60 DETERMINAÇÃO DE GORDURA POR MOJONNIER – MÉTODO AOAC.....................62 DETERMINAÇÃO DE GORDURA EM LEITE EM PÓ.......................................................65 DETERMINAÇÃO DE LACTOSE.........................................................................................66 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO...................................................................................69 1) NITROGÊNIO NÃO CASEICO EM LEITE...................................................................69 2) DETERMINAÇÃO DE NITROGENIO NÃO PROTEICO – SEGUNDO O MÉTODO DESCRITO POR GRIPON ET AL (1975)...........................................................................70 3) DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO NÃO PROTÉICO EM LEITE.........................71 4) DETERMINAÇÃO DE NITROGENIO SOLÚVEL – SEGUNDO O MÉTODO DESCRITO POR KOSIKOWSHI (1978)............................................................................72 5) DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO SOLÚVEL A pH 4,6.......................................72 6) DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO PELO MÉTODO KJELDAHL/PROTEÍNAS.76 DETERMINAÇÃO DE ÓLEO LIVRE EM QUEIJO MUSSARELA.....................................83 DETERMINAÇÃO DE OVERRUN EM SORVETE..............................................................85 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA SOLÚVEL EM TCA 12%............................................86 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA COM MÉTODO DE FORMOL...................................90 DETERMINAÇÃO DE SAL EM QUEIJO..............................................................................91 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE MATURAÇÃO DE QUEIJOS.....................................97 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE PERÓXIDOS................................................................99 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE REFRAÇÃO...............................................................102 DETERMINAÇÃO RÁPIDA DE UMIDADE EM MANTEIGA.........................................103 UMIDADE E VOLÁTEIS EM BANHA OU BUTTER OIL.................................................103 DISPERSIBILIDADE DE LEITE EM PÓ.............................................................................104 DOSAGEM DE CLORO LIVRE EM HIPOCLORITO DE SÓDIO.....................................105 DOSAGEM DE CLORO LIVRE EM SOLUÇÃO DE HIPOCLORITO DE SÓDIO...........107 DOSAGEM - MÉTODO DE ANÁLISE PARA DETERMINAR O TEOR DE HIPOCLORITO DE SÓDIO (HIPO).....................................................................................110 FOSFATASE..........................................................................................................................112 GLICÍDEOS NÃO REDUTORES EM SACAROSE............................................................115 GLICÍDEOS REDUTORES EM GLICOSE..........................................................................117 ÍNDICE CRIOSCÓPICO........................................................................................................119 INSOLÚVEIS EM MANTEIGA (Insolúveis Totais no Éter Etílico)....................................121 INVESTIGAÇÕES DE ANOMALIAS E ALTERAÇÕES...................................................123 1) ALTERAÇÃO POR FRAUDE:.....................................................................................123 2) ADIÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ESTRANHAS NO LEITE...........................................124 PONTO DE DERRETIMENTO DE QUEIJO MOZZARELLA...........................................126 DIAGRAMA DE DISPOSIÇÃO DAS PLACAS DE PETRI NA PRATELEIRA DA ESTUFA..............................................................................................................................127 SELEÇÃO DO LEITE – MÉTODOS RÁPIDOS..................................................................128 1) TESTE DORNIC:...........................................................................................................128 2) TESTE DO ÁLCOOL:...................................................................................................128 3) TESTE DO ALIZAROL.................................................................................................128 4) TESTE DE COCÇÃO:...................................................................................................129 SOLUBILIDADE DE LEITE EM PÓ - ADMII....................................................................130 SOLUBILIDADE DE LEITE EM PÓ....................................................................................132
  4. 4. TESTE DA PEROXIDASE....................................................................................................134 TRATAMENTO DE ELETRODO COMBINADO...............................................................135 UMIDADE - EXTRATO SECO TOTAL –EST....................................................................137 EXTRATO SECO DESENGORDURADO...........................................................................138 IMPORTÂNCIA DA CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS E OUTROS FATORES QUE AFETAM A QUALIDADE DO LEITE........................................................................139 ASPECTOS ECONÔMICOS DA MASTITE BOVINA........................................................143 ÍNDICE REMISSIVO.............................................................................................................147
  5. 5. DETERMINAÇÃO DE ACIDEZ EM LEITE 1) ALIZAROL Material: • Acidímetro de Salut • Solução de alizarol Reagente: Preparo do Alizarol: • 2 g de alizarina; • 1000 mL de álcool neutro 68% (720 mL de álcool + 280 mL de água destilada); • Dissolver a alizarina no álcool e agitar bem; • Deixar em repouso durante 12 horas e filtrar em papel de filtro; • Deve apresentar com de tijolo. Se não apresentar essa coloração, neutralizar com NaOH N/10 até pH 7,0 ou até atingir a cor. Procedimento: • Colher a amostra de leite com o próprio acidímetro; • Misturar à solução e observar a cor do copinho da mistura. Interpretação: REAÇÃO QUALIDADE DO LEITE Rosa claro ou tijolo Normal Amarelo pardo ou vermelho Ácido fermentado Violeta ou lilás Alcalino anormal 2) DETERMINAÇÃO DE pH • Em um béquer de 50 mL, recolher uma amostra de leite; • Enxaguar o eletrodo de pHmetro com água destilada; • Enxugar levemente a ponta do eletrodo com papel absorvente; 5
  6. 6. • Imergir o eletrodo na amostra de leite ou soro, tomando muito cuidado para não encostar a ponta do eletrodo no fundo do béquer. A membrana cerâmica deverá ficar mergulhada na amostra; • Fazer a leitura do pH; • Retirar o eletrodo da amostra, enxaguá-lo com água destilada e colocá-lo no béquer de água destilada; • Não mexer nos botões de temperatura e de calibração do aparelho. Em caso de amostra cuja temperatura não esteja ambiente, levar a amostra até a temperatura ambiente antes de fazer a determinação do pH. 3) MÉTODO EM % DE ÁCIDO LÁCTICO E ºDORNIC Princípio: Fundamenta-se na neutralização até o ponto de equivalência pelo hidróxido de sódio na presença de indicador fenolftaleína. Material: • Erlenmayer de 125 mL; • Pipeta de 10 mL ou 25 mL; • Pipeta volumétrica de 10 mL Reagentes: • Solução de hidróxido de sódio N/9 (solução Dornic); • Solução alcoólica de fenolftaleína. Preparo da solução dornic: • Preparar a solução a partir de solução de NaOH 50%, preparada anteriormente com água destilada fervida (para eliminação de gás carbônico). Tomar cuidado ao transferir o sobrenadante desta solução, pois no fundo do frasco, possivelmente se encontrará precipitados na forma de carbonatos. 6
  7. 7. • Pipetar 8,88 mL da solução de NaOH 50 % e completar o volume para 1000 mL. Padronizar com solução de concentração conhecida de biftalato de potássio ou ácido oxálico. • Se desejar partir do hidróxido de sódio P.A. pesar 4,5 g e diluir para 1000 mL com água fervida. Padronização da solução Dornic: • Usando ácido oxálico: padronizar com solução 0,1 N de ácido oxálico recentemente preparada; o Para o preparo, pesar 6,3035g de ácido oxálico p.a. e diluir a 1000mL com água destilada. o Usando biftalato de potássio, pesar exatamente 20,43g e dissolver em água quente (50-70ºC, previamente fervida para eliminação de CO2). Completar a 1000 mL. Pode-se pesar direto 0,2043g de biftalato de potássio, dissolver em aproximadamente 25 mililitros de água e titular com a solução Dornic. OBS: tanto o ácido oxálico quanto o biftalato de potássio devem ser secos em estufa a 105ºC durante 1 hora antes de serem pesados. Maiores informações a respeito da padronização, consultar Manual de Reagentes e Soluções. Determinação do fator de correção da solução Dornic: normalidade real = normalidade teórica (0,1111 no caso da Dornic Fc Procedimento: Transferir com pipeta volumétrica 10 mL da amostra de leite homogeneizada para erlenmeyer. Adicione 3 a 5 gotas de fenolftaleína. Titular com solução Dornic até o aquecimnto de coloração levemente rósea persistente. Cálculo: 7
  8. 8. A acidez em leite ou produtos lácteos pode ser expressa em graus Dornic; em solução normal ou em % de ácido láctico: a) Em ácido lático, utilizando solução de NaOH 0,1N: onde: V = volume em mL gasto na titulação; f = fator de correção da solução de NaOH 0,1N p.a.= peso da amostra, em g ou mL de amostra 0,9 = peso molecular do ácido lático (90) x 0,1 (normalidade da solução) b) Em graus Dornic: Acidez em ºDornic = 10×× fV onde: V = mL de solução Dornic gastos na titulação; F = fator da solução Dornic 10 = transformação de ácido lático em ºDornic OBS: Cada grau Dornic é equivalente a 0,01% de ácido láctico Leite achocolatado ou colorido artificialmente: Determinar a acidez com titulação com solução N/9, utilizando potenciômetro, com agitação constante até pH 8,0 – 8,25. Se necessário, adicionar água destilada na amostra para correta imersão do eletrodo. Conversões de medidas de acidez (graus Dornic e Soxhlet-Hnkel): 4 Dornic º = 0,44 ºD 9 SH × = × 9 ºSH º = 2,25 ºSH 4 D × = × 8 0,9 Acidez ácido lático %p/v = . V f p a × ×
  9. 9. Referência: LANARA (1981) capitulo XVIII-2 metodologia 6. Controle da composição química do leite e derivados – UFMG / vol.1. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 4) PROVA DO ÁLCOOL Material: • Pipetas de 2 mL; • Álcool 76%; • Tubos de ensaio. Procedimento: • Tomar 2 mL de álcool num tubo de ensaio e adicionar 2 mL de leite; • Homogeneizar e verificar a coagulação; • A formação de grumos ou flocos indica leite anormal. 9
  10. 10. DETERMINAÇÃO DE ACIDEZ EM BANHA – BUTTER OIL Princípio: Fundamenta-se na neutralização, até o ponto de equivalência, pelo hidróxido de sódio, na presença de indicador fenolftaleína. Essa análise poderá ser feita tanto para banha suína como gordura de leite, tipo manteiga. Material: • Balança analítica; • Erlenmeyer de 125 mL ou béquer de 150 mL; • Pipeta graduada de 10 mL; • Bureta de 10 mL; Reagentes: • Solução de álcool + éter etílico 1 + 2 neutralizada; • Solução alcoólica de fenolftaleína 1%; • Solução de hidróxido de sódio 0,1N. Preparo dos reagentes: A solução de álcool mais éter 1+2 deve ser previamente neutralizada, adicionando-se a esta algumas gotas de fenolftaleína e gotejando hidróxido de sódio 0,1N até leve coloração rósea persistente. Titulação: • Com auxílio de uma pipeta graduada pesar 5g de gordura fundida, filtrada e seca em um erlenmeyer ou béquer; • Adicionar 40 mL de solução alcoólica de éter neutralizado e algumas gotas de fenolftaleína; • Titular com solução de NaOH 0,1N até aparecimento de coloração rósea persistente. Cálculo: 10 % acidez em soluto alcalino normal = 100V x N x fc x p
  11. 11. onde: V = volume em mL de solução de NaOH 0,1N gastos na titulação; N = normalidade da solução de NaOH 0,1N; fc = fator de correção da solução de NaOH 0,1N; p = peso da gordura, em g. Referência: LANARA capítulo XXI – 4 metodologia 6. 11 % ácido oléico = Soluto alcalino normal x 0,282
  12. 12. ACIDEZ EM LEITE EM PÓ Material: • Balança analítica; • Béquer de 100 mL; • Espátula; • Solução de hidróxido de sódio 0,1 N; • Fenolftaleína. Procedimento: • Pesar em balança analítica 5g de leite em pó ou soro de leite em pó; • Diluir em 35 mL de água destilada se for leite integral ou 50 mL de água se for leite desnatado ou soro de leite em pó; • Titular com NaOH 0,1N, utilizando fenolftaleína como indicador. Cálculo: O resultado é dado em ácido lático no pó ou na diluição: % de ácido lático no pó: p fcV 9,0×× onde: V = volume de NaOH 0,1N; Fc = fator de correção da solução de NaOH 0,1N; P = peso da amostra, em gramas. Ou % de ácido lático no leite reconstituído: ' 9,0 p p fcV ×× V = volume de NaOH 0,1N Fc = fator de correção da solução de NaOH 0,1N No caso de leite integral quando a diluição é 1+7, p’=8 12
  13. 13. No caso de leite desnatado, a reconstituição é 1+10, portanto p’=11 Referência: LANARA 13
  14. 14. DETERMINAÇÃO DE ACIDEZ EM QUEIJOS Material: • Placa aquecedora • Erlenmeyer 100 mL • Liquidificador • Proveta de 100 mL • Papel para pesagem • Béquer de 250 mL • Funil • Papel de filtro Whatman nº 1 • Pipeta de 25 mL • Bureta • Cronômetro Reagentes • Água destilada • Solução Hidróxido de sódio 0,1N • Solução alc. fenoftaleína Procedimento: • Ajustar a placa aquecedora a 60ºC; • Colocar em um erlenmeyer de 1000 mL, 900 mL de água destilada. Levar o erlenmeyer a uma placa aquecedora até 60ºC; • Pesar 10,00 g de amostra de queijo finamente moído em um pedaço de papel de pesagem. Este peso deve estar entre 9,95 g e 10,05 g; • Transferir a amostra para um liquidificador com jarra de inox; • Com o auxílio de uma proveta, colocar 95 mL de água destilada quente (60ºC), lavando o papel de pesagem com essa água; • Bater esta mistura na velocidade mínima por 5 segundos e depois na velocidade máxima por 30 segundos; 14
  15. 15. • Colocar a mistura em um béquer de 250 mL. A gordura existente na amostra irá começar a subir à superfície; • Colocar o béquer em freezer por 10 minutos para a gordura solidificar; • Remover o béquer do freezer e, cuidadosamente, filtre a parte líquida em papel Whatman nº 1; • Esta amostra filtrada pode ser utilizada tanto para determinação de acidez titulável, quanto para lactose/galactose; • Pipetar 25,00 mL de amostra e titular com solução de hidróxido de sódio 0,1N, utilizando fenoftaleína como indicador. Cálculos Observações Desmembramento da fórmula acima 100 de ácido obtido na titulação Acidez titulável = g de queijo utilizado na análise g× 25 Gramas de queijo utilizado na análise = 93,7 60º mL Solução Peso de Amostra g de Água C adicionada ao queijo × Gramas de ácido obtido pela titulação = mL NaOH 0,1N x 0,009g ácido/mL Referência: J. J.Yun and D. M. Barbano. Department of Food Science Cornell University – september/91 15 0,009 x mL NaOH gastos) x 100 % acidez titulável = de queijo 25 x 93,7 ou resumidamente: ( NaOH) x (3,3732) % acidez titulável = x Fc de queijo g mL g
  16. 16. AMIDO EM LEITE EM PÓ • Reconstituir o leite conforme indicações da embalagem • Fazer determinação utilizando mesma metodologia para leite fluido (ver metodologia em “ADULTERANTES EM LEITE – AMIDO”). Referência: LANARA 16
  17. 17. ANTI-OXIDANTES EM LEITE EM PÓ Material: • Balança analítica; • Funil comum; • Funil de separação; • Balão volumétrico de 100 mL; • Tubos de ensaio; • Éter de petróleo; • Etanol 72%. Procedimentos • Extrair a gordura das amostras da seguinte forma: o Pesar 20 g de amostra e dissolver em 50mL de éter de petróleo; o Filtrar e colocar o filtrado em funil se separação; o Extrair com 30 mL de etanol 72% em três etapas; o Reunir os extratos em balão de 100 mL e completar com álcool a 72% • Provas: BHA: butil-hidroxi-anisol: Em tubo de ensaio: • 5 mL de extrato + 1 mL de solução Borarx 2% + cristais de 2,6 – dibromoquinona. 4- cloroimida • Prova positiva: coloração azul. Referência: LANARA (1981) capítulo XV-7, metodologia 12 17
  18. 18. ADULTERANTES EM LEITE 1) ÁCIDO BÓRICO OU BORATOS EM LEITE E DERIVADOS Com glicerina: O glicerol com o ácido bórico forma um éster complexo do ácido ortobórico no qual o grupo OH do glicol torna-se fortemente ácido, o que é indicado pela fenolftaleína. A presença de ácido bórico ou boratos no leite servem como conservante, a fim de evitar a ação de microorganismos. Material: • Tubo de ensaio de 25 mL; • Pipeta graduada de 2 mL e 10 mL; Reagentes: • Solução alcoólica de fenolftaleína; • Solução de NaOH 0,1 N; • Glicerol neutralizado. Procedimento: • Em tubo de ensaio, colocar 10 mL de leite; • Adicionar 5 gotas de fenolftaleína e gotejar solução de NaOH 0,1 N até leve coloração rósea; • Acrescentar 2 mL de glicerol neutralizado; • Na presença de ácido bórico ou boratos, a coloração rósea desaparece. Se permanecer a coloração, indica ausência de ácido bórico ou boratos. Referência: LANARA (1981); capítulo XIV – 17, metodologia 8.2 2) ÁGUA OXIGENADA Com óxido de vanádio: 18
  19. 19. O óxido de vanádio em meio H2SO4 reage com água oxigenada formando o ácido ortoperoxivanádico de coloração vermelha. Material: • Pipeta de 5 e 10 mL; • Tubo de ensaio de 25 mL; • Solução de óxido de vanádio 1% em ácido sulfúrico 6%. Procedimento: • Colocar no tubo 10 mL de leite e 10 gotas da solução de óxido de vanádio; • Agitar; • Na presença de água oxigenada aparecerá uma coloração rósea ou vermelha, que indica adulteração do leite através da adição desse material. • Sensibilidade: até 0,025 ppm de água oxigenada. Referência: LANARA (1981); capítulo XIV-8; metodologia 10.1 3) ALCALINOS (BICARBONATO DE SÓDIO) Com ácido rosólico (indicador de faixa de pH: 6,8 - 8,0) Material: • Pipeta de 5 mL; • Tubo de ensaio de 25 mL; • Funil; • Papel de filtro comum; • Etanol neutralizado; • Solução de ácido rosólico 2% em etanol neutralizado; Preocedimento: • Colocar no tubo de ensaio, 5 mL de etanol neutralizado; • Homogeneizar lentamente por inversão; 19
  20. 20. • Filtrar; • Recolher o filtrado em outro tubo e colocar 2 a 3 gotas de ácido rosólico; Teste positivo: vermelho carmim. OBS: Fazer um branco usando o mesmo volume de filtrado e de etanol. A cor da amostra deverá ser menos intensa que a do branco. Do contrário, prova positiva. Referência: LANARA (1981); capítulo XIV-12, metodologia 14.1 4) AMIDO O amido com o iodo livre forma um composto de absorção de coloração azul. Material: • Pipeta de 10 mL; • Tubo de ensaio de 25 mL; • Banho-maria; • Solução de lugol ou tintura de iodo. Procedimento: • Colocar 10 mL de leite num tubo e levar em banho-maria até ebulição, por 5 minutos; • Esfriar em água corrente; • Adicionar 5 gotas de solução de lugol ou tintura de iodo; • Na presença de amido ficará azul. Referência: LANARA (1981) capítulo XIV – 15, metodologia 16) 5) CLORETOS Fundamenta-se na precipitação dos cloretos sob a forma de cloreto de prata. Materiais: 20
  21. 21. • Pipetas de 1,5 e 10 mL; • Tubo de ensaio de 25 mL; • Solução de nitrato de prata 0,1N; • Cromato de potássio 5%. Procedimento: • Em um tubo, colocar 10 mL de leite. Adicionar 8 a 10 gotas de cromato de potássio e agitar. Acrescentar 4,5 mL de AgNO3 0,1N e agitar. • Coloração amarela: prova positiva – presença de cloretos em quantidade superior à faixa normal. • Coloração variando de alaranjado escuro a vermelho: prova negativa – leite contém cloretos dentre a faixa normal. Sensibilidade: até 0,4 ppm Referência: LANARA (1981) capítulo XIV – 11, metodologia 13.1) 6) CLORO E HIPOCLORITOS Fundamenta-se na formação de iodo livre a partir do iodeto de potássio, pela ação do cloro livre ou hipoclorito. Material: • Tubo de ensaio de 25 mL; • Pipetas de 1,5 e 10 mL; • Banho-maria a 80ºC; • Solução de iodeto de potássio 7,5%; • HCl 1+2; • Amido a 1%. Procedimento: 21
  22. 22. • Em um tubo, colocar 5 mL de leite e adicionar 0,5 mL de solução de iodeto de potássio; • Agitar e observar; • Se der coloração amarela indica a presença de cloro livre; • A confirmação é dada adicionando-se 1 mL de solução de amido a 1%; • Deverá desenvolver coloração azul ou violeta; • Não havendo mudança de coloração, adicionar 4 mL de HCl 1+2; • Colocar em banho-maria a 80ºC por 10 minutos; • Esfriar em água corrente e observar a cor da coalhada; • Na presença de hipoclorito deverá ser AMARELA; • Para confirmação adicionar 1 mL de solução de amido a 1%; • Deverá desenvolver coloração AZUL ou VIOLETA; • Fazer branco com ácido clorídrico; • Sensibilidade: até 0,4 ppm de solução de cloro a 200 ppm; Referência: LANARA (1981); capítulo XIV-10; metodologia 12.1 7) FORMOL com floroglucina A floroglucina reage com o formol, produzindo o derivado hidroximetilado de coloração vermelha fugaz. Material: • Tubo de ensaio de 25 mL; • Pipetas de 2 e 10 mL; • Solução de floroglucina a 1%; • Solução de hidróxido de sódio a 10%. Procedimento: • Colocar no tubo 10 mL de leite, 1 mL de solução de floroglucina e 2 mL de solução de NaOH 10%; 22
  23. 23. • Agitar; • A prova positiva (+) desenvolve coloração salmão; • Sensibilidade: até 0,05 ppm de solução de formol a 10%. Referência: LANARA (1981); capítulo XIV-8; metodologia 9 8) NITRATO EM LEITE Reagentes • Solução Ferrocianeto de potássio 15%; • Solução Acetato ou sulfato de zinco a 30%; • Difenilamina; • Ácido sulfúrico p.a.; • Solução Saturada de NaCl; Preparo da difenilamina + ácido sulfúrico: • Misturar 150 mL de água com 50 mL de ácido sulfúrico; • Dissolver na mistura 85mg(0,085g) de difenilamina e transferir para balão volumétrico de 500 mL; • Completar o volume com ácido sulfúrico com cuidado, para não haver superaquecimento (colocar o balão em água gelada); • Se aparecer a coloração azul, aquecer cuidadosamente sobre tela de amianto, em fogo mínimo, até que desapareça a coloração (o azul indica presença de oxigênio; com aquecimento, o oxigênio sai). Procedimento: • Transferir para béquer de 150 mL, 45 mL de leite; • Adicionar 2 mL de solução de ferrocianeto de potássio 15% e 2 mL de solução de acetato ou sulfato de zinco 30%; • Agitar por 30 segundos e deixar em repouso por 5 minutos; 23
  24. 24. • Filtrar; • Colocar 5 mL de filtrado em tubo de ensaio; • Adicionar 1 gota de solução de cloreto de sódio saturada e 4 mL do reagente difenilamina, cuidadosamente pelas paredes do tubo; • Agitar; • Deixar em repouso1 hora para desenvolver a coloração; • Em presença de nitratos aparecerá coloração azul. Referência: LANARA (1981) capítulo XIV – 16, metodologia 17 9) SACAROSE EM LEITE – PROVA QUALITATIVA Com resorcina: A resorcina em meio ácido condensa-se com as aldoses, dando um composto de coloração rósea. Material: • Tubo de ensaio de 50 mL; • Pipeta de 10 mL • Espátula; • Banho-maria Reagentes: • HCl concentrado; • Resorcina p.a Procedimento: • Transferir 10 mL de leite para o tubo de ensaio; • Adicionar 1 mL de HCl concentrado e 0,1 g de resorcina; • Agitar e aquecer em banho-maria por 5 minutos; • Na presença de sacarose aparecerá uma coloração rósea imediata; 24
  25. 25. OBS: Não levar em consideração se a coloração aparecer depois de um certo tempo, pois será devido à hidrólise da lactose. Referência: LANARA (1981); capítulo XIV-5, metodologia 15.2 25
  26. 26. ALCALINIDADE DAS CINZAS Princípio A presença de substâncias alcalinas ao leite vai aumentar a alcalinidade das cinzas. Procedimento: • Obter cinzas como costume, utilizando 20 mL de amostras. Se utilizar 5 mL de amostra, reduzir a quantidade dos reagentes em 4 vezes. • Esfriar e adicionar um pouco de água destilada. • Evaporar até secura em banho-maria e voltar a incinerar por 1 hora. • Depois de esfriar, adicionar alguns mililitros de água destilada e passar quantitativamente para um béquer de 250 mL, usando pequenas porções de água. Adicionar 50 mL de HCl 0,1 N e levar à ebulição, e aquecer moderadamente por 5 minutos. • Esfriar e adicionar 30 mL de solução de cloreto de cálcio 40% (neutralizado e filtrado, se necessário) e algumas gotas de fenoftaleína. • Deixar em repouso por 5 minutos e titular o excesso de HCl 0,1 N com solução de NaOH 0,1 N. Cálculo: Alcalinidade das cinzas em carbonato de sódio = ' 53,0 V fcV ×× onde: V = Diferença entre os mL de HCl 0,1 N adicionados e os mL de Naoh 0,1 N gostos na titulação; fc = Fator de correção da solução de NaOH 0,1 N; V’ = Volume de amostra. Obs.: A alcalinidade das cinzas do leite normal pode variar entre 0,015% e 0,030% em Na2CO3. Se encontrarmos valores mais altos, sobretudo acima de 0,040%, é evidente a adição de substâncias alcalinas no leite. Referências: LANARA (1981) capítulo XVIII-2, metodologia 7 26
  27. 27. CINZAS Determinação de cinzas (sais minerais) – Princípio: Fundamenta-se na perda que ocorre quando o produto é incinerado a 550ºC, com destruição da matéria orgânica sem apreciável decomposição dos constituintes do resíduo mineral ou perda por volatilização. Determinação: • Aquecer o cadinho de porcelana em mufla a 700ºC durante 1 hora, esfriar em dessecador e pesar (tarar); • Pesar 5 g de amostra homogeneizada em balança analítica; • Colocar em estufa a 105ºC por uma noite; • Levar o conjunto ao bico de Bunsen até carbonização completa e, a seguir, ao forno mufla a 550ºC por 12 horas; • Resfriar em dessecador e pesar; OBS: Não retirar os cadinhos da mufla enquanto a temperatura for superior a 200ºC. Cálculo: 100 % cinzas = ' P P × onde: P = peso das cinzas em g; P’ = peso da amostra em g. Referência: LANARA (1981) capítulo XVIII-1, metodologia 4 27
  28. 28. CONSERVADORES, ANTISSÉPTICOS E INIBIDORES BACTERIANOS 1) INVESTIGAÇÃO RÁPIDA DE PENICILINA Baseia-se na grande sensibilidade de certas bactérias láticas a este antibiótico. Tomar 2 tubos sendo um com leite original e outro com o leite objeto de análise. Inocular 5% de uma cultura de iogurte e incubar algumas horas entre 37 a 44ºC. determinar após 4 a 5 horas a acidez por titulação e se esta for de 4 ou mais vezes superior no leite original existe grande possibilidade da presença de penicilina no leite examinado. 2) ÁGUA OXIGENADA (ADIÇÃO RECENTE) • A 10 mL de leite se adiciona 10 gotas de uma solução de ácido vanádico a 1% em ácido sulfúrico diluído. Observa-se a coloração vermelha se houve adição recente de água oxigenada; • Pode-se ainda pesquisar a água oxigenada mergulhando-se fita “CLINISTIX” ao leite em exame. Quando o mesmo contém água oxigenada, imediatamente a fita toma a coloração azul. 3) FORMOL OU FORMALDEÍDO • Colocar em um tubo de ensaio: 5 mL de leite, 2 mL de ácido sulfúrico a 50% e 1 mL de percloreto de ferro a 2%. • Aquecer até ebulição. Reação positiva: coloração (roxa) violácea. Reação negativa: coloração amarelada; • Sobre o leite adicionado de peróxido de hidrogênio depositar cuidadosamente igual volume de ácido clorídrico concentrado. Reação positiva: anel violeta azulado na zona de separação; 4) ÁCIDO SALICÍLICO Colocar em um tubo de ensaio 5 mL de leite, gotas de ácido acético a 25% e 5 mL de água destilada. Após a coagulação, filtrar e ao filtrado adicionar gotas de percloreto de ferro a 2%. Reação positiva: cor violeta 28
  29. 29. Reação negativa: cor amarela 5) ÁCIDO BÓRICO • Em um tubo de ensaio colocar 5 mL de leite, 3 gotas de fenoftaleína a 2%, solução de soda até tonalidade rósea. • Adicionar a seguir 1 mL de glicerina. Reação positiva: cor branca Reação negativa: cor rósea 6) DICROMATO DE POTÁSSIO • Em um tubo de ensaio colocar 5 mL de leite, 5 gotas de nitrato de prata a 2% e aquecer. Reação positiva: precipitado de cor amarela Reação negativa: cor inalterável (branco) • Incinera-se o leite, e as cinzas resultantes são misturadas com ácido sulfúrico diluído, filtrando-se a seguir. Alguns mL do filtrado se superpõem em um tubo de ensaio com 2 a 3 mL de éter, misturando-se a seguir. O ácido percrômico que se forma em presença de cromatos colore o éter de azul quando a reação é positiva. 7) PROVA DE ALCALINOS NO LEITE • Para 5 mL de leite, adicionar 10 mL de álcool absoluto, filtrar e adicionar 10 gotas de ácido rosálico a 1%. O aparecimento de cor vermelha indica reação positiva e cor alaranjada reação negativa; • Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de leite e 2 mL de solução de alizarol (dissolução de 0,55 por mil em álcool de 68º. Quando a reação é positiva forma-se coloração violeta. 8) CARBONATOS Ao leite em exame adicionar ácido nítrico. Havendo efervescência a reação será positiva. 29
  30. 30. CORANTES ARTIFICIAIS (Corantes ácidos ou básicos) Princípio: Os corantes artificiais permitidos pela legislação são substâncias sintéticas de caráter ácido. Corantes básico são proibidos em alimentos. Compreendem oito corantes ácidos: amarelo crepúsculo, azul brilhante, bordeaux S ou amarante, eritrosina, indigotina, ponceau 4R, tartrazina e vermelho 40, conforme Tabela I – Aditivos intencionais. Esses aditivos são usados para realçar ou conferir a cor desejada ao alimento. Objetivo: Identificar a presença de corantes ácidos ou básicos (não permitidos) em alimentos pelo método de Arata. Material • Fios de lã pura tratados: desengordurar fios de lã branca com éter de petróleo e secar; • Béquer de 250 mL e 600 mL; • Proveta de 250 mL; • Balão volumétrico de 100 mL; • Pipetas de 5 e 50 mL. Reagentes: • Etanol 80% - 842 mL de álcool etílico 99,5ºGL em balão de 1000 mL; • Etanol 70% - 737 mL de álcool etílico 99,5ºGL em balão volumétrico de 1000 mL; • Solução de HCl 1+9; • Hidróxido de amônio p.a. Procedimento: • Colocar 50 g de amostra em béquer de 600 mL; • Adicionar 200 mL de etanol 80%; • Deixar em repouso por 2 horas, agitando ocasionalmente; • Deixar sedimentar e separar o sobrenadante do resíduo; 30
  31. 31. • Acrescentar ao resíduo, 200 mL de etanol 70% alcalinizado com 2 mL de hidróxido de amônio e deixar repousar por 2 horas; • Retirar o sobrenadante e juntar com o sobrenadante anterior; • Evaporar, esfriar e diluir a 100 mL em balão volumétrico; • Tomar 50 mL da solução do balão e colocar em béquer de 250 mL; • Adicionar 5 mL de HCl 1+9 e 30 cm de lã; • Lã colorida: corante artificial (ácido); • Se a lã não for tingida, realizar o seguinte teste: o Tomar 50 mL de solução do balão em béquer de 250 mL; o Adicionar gotas de hidróxido de amônio e 30 cm de lã; o Ferver por 10 minutos; o Lã ficar colorida: corante artificial (básico). Referência: LANARA capítulo XIX, metodologia XIX – 1, item 9. 31
  32. 32. DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE 1) DETERMINAÇÃO DE DENSIDADE POR LACTODENSÍMETRO Material: • Lactodensímetro; • Termômetro de mercúrio; • Proveta de 1000 mL. Procedimento: • Colocar 1000 mL de leite na proveta e ver a temperatura; • Introduzir lentamente o lactodensímetro evitando que encoste nas paredes; • Fazer a leitura na altura do nível do líquido; • Calcular a densidade pela tabela, considerando a temperatura e o valor registrado no lactodensímetro. 2) DETERMINAÇÃO DE DENSIDADE POR PICNÔMETRO (Densidade relativa) Procedimento: • Enxaguar o picnômetro com álcool várias vezes e finalmente com éter; • Encher o picnômetro com água previamente fervida, esfriada a 13ºC, deixar num banho-maria à mesma temperatura e deixar amornar até 16ºC; • Ajustar a água ao nível apropriado, inserir a rolha, remover o picnômetro, secar e pesar; • Mesmo procedimento para leite. Cálculo: 32 densidade absoluta x amostra (leite) Densidade relativa = densidade absoluta da água
  33. 33. Portanto: 2 massa do picnômetro + leite Densidade relativa do leite = massa do picnômetro + H O Observações • Tomar muito cuidado com as bolhas de ar; • Usar o mesmo picnômetro para a água e o leite, nas mesmas condições de temperatura; • Quando se usa água para fazer a comparação, a densidade relativa da amostra será igual à sua densidade absoluta, pois a densidade absoluta da água é 1. No entanto, deve-se fazer a análise completa, para garantir um resultado exato. 3) TABELA DE CORREÇÃO DA DENSIDADE Procurar fazer a leitura a 15ºC. Se não for possível fazer a correção acrescentando 0,0002 para cada grau acima de 15ºC ou diminuindo 0,0002 para cada grau abaixo. Esta correção não deve ser feita em temperatura inferior a 10ºC ou superior a 20ºC. A correção poderá ser feita também através de tabelas. 33
  34. 34. 34
  35. 35. DETERMINAÇÃO DA FORÇA DO COALHO Material: • 1g de coalho em pó ou 1 mL de coalho líquido; • 50 mL de água destilada; • 1 pitada de sal; • 1000 mL de leite cru; • Cronômetro; • Banho-maria a 35ºC. Procedimento: • Diluir o coalho com sal em água destilada; • Aquecer o leite até 35ºC e manter o Banho-maria; • Adicionar o coalho, misturado rapidamente e adicionar o cronômetro; • Observar até que forme coágulo firme (ponto de corte) e anotar o tempo gasto (em segundos). Cálculo: 1g de coalho ----- 1000 mL ----- x Y ----- 1000 mL ----- 2400 segundos (40 minutos) onde: x = tempo gasto para atingir o ponto de corte; y = g de coalho para coagular 1000 mL de leite em 40 minutos. y = 1g . x : 2400 segundos Então: 1000 mL ---- y Z ---- 1g onde: 35
  36. 36. z = volume de leite coagulado por 1g de leite 36
  37. 37. DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO EM QUEIJO POR COMPLEXOMETRIA (EDTA) Reagentes: 1. Solução padrão de cloreto de cálcio: • Secar a o carbonato de cálcio anidro 100°C por 1 noite; O cloreto de cálcio 0,1N é preparado da seguinte forma: • Pesar exatamente 10,0090g de carbonato de cálcio seco em frasco de 1 litro; • Dissolver o pó em 225 mL de HCl 1M e aproximadamente 400 mL de água destilada; • Aquecer esta solução até próximo à fervura para eliminação de CO2 e refrigerar por 1 noite antes de acertar o volume do balão; • Para uma solução de cloreto de cálcio 0,02M, fazer uma diluição de 1:5; • As soluções devem ser estocadas em recipientes plásticos. 2. Solução padrão de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) • Dissolver 7,4746g de sal dihidratado (EDTA) em água destilada e completar para 1 litro; • Deve-se certificar de que o sal dissódico contém 0,4% de umidade absorvida; • Padronizar a solução com solução de cloreto de cálcio 0,02 M; • Estocar as soluções em recipientes plásticos. 3. Indicador de cálcio • Hydroxi naftol blue (azul de hidroxi naftol); • 0,100g / amostra. Procedimento: • Pesar 2 a 3g de amostra; • Pernoitar em estufa a 100°C e depois em mufla a 600°C; • Depois de fria, a cinza é umedecida com 1 a 2 mL de água destilada, 0,5 mL de ácido sulfúrico concentrado; 37
  38. 38. • Acrescentar, se necessário, uma pequena quantidade de água destilada para dispensar a cinza e transferir tudo parra um frasco de 250 mL; • O cadinho é lavado repetidamente com água destilada até o volume no frasco atingir aproximadamente 50 mL; • Se a mistura estiver turva, agitar o frasco várias vezes até a solução clarear. Titulação: • Adicionar solução de EDTA 0,02 M suficiente para titular o cálcio da amostra. Em geral, 15 a 20 mL de solução medidas em bureta. • A solução é agitada magneticamente; • Acrescentar 8 ml de solução de NaOH 4M e 100 mg de indicador, formando assim uma solução azul se todo o cálcio foi titulado, ou vermelho púrpura se a titulação foi incompleta. No último caso, adicionar mais EDTA até ficar azul; • Logo após, adicionar 15,00 mL de solução de cloreto de cálcio 0,02M com o auxílio de uma bureta, ficando então uma solução vermelho forte; • Titular rapidamente com EDTA 0,02M até que o azul permaneça por aproximadamente 60 segundos; • Calcular a % de cálcio da seguinte forma Calcular a % de cálcio da seguinte forma: % Cálcio = ( ) ( ) ( )2 15.00 100% ( ) EDTA EDTA CaClVtotal M M peso amostra mg × − × + Referência: Calcium determination. Jornal of dairy science, vol. 68, nº4; 1984. 38
  39. 39. DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO POR PRECIPITAÇÃO COM OXALATO-KMnO4 Procedimento: • Obter cinzas a partir de 5g da amostra; • Dissolver as cinzas com HCl 1:1; • Adicionar 2 gotas de HNO3 e 20 mL de água; • Filtrar; • Receber o filtrado em um balão volumétrico de 100 mL; • Lavar a cápsula e o filtro com água; • Completar o volume; • Nesta solução determinar Ca da seguinte forma: o Titulação com oxalato  Reagentes:  NH4OH (1:1);  Solução de NH4Ac 1%;  HAc glacial;  Solução de oxalato de amônio 0,5 %;  H2SO4 1+4;  Solução de KMnO4 0,1N; Precipitação: • Transferir com auxilio de uma pipeta, 20 mL da solução reservada para a determinação de cálcio para um béquer de 400 mL; • Adicionar 2 gotas de indicador vermelho de metila 0,005 % em etanol; • Neutralizar com hidróxido de amônio 1:1; • Filtrar se necessário; • Adicionar 10 mL de solução de acetato de amônio 1% e 1 mL de acido acético (ou mais, até ficar coloração rosa claro = pH 4); • Aquecer próximo à ebulição; • Adicionar lentamente e agitando sempre, 50 mL de uma solução de oxalato de amônio 0,5% quente; 39
  40. 40. • Deixar em repouso por 12 horas; • Filtrar; • Lavar até que o filtrado não contenha o íon oxalato; • Transferir o papel de filtro com o precipitado para o béquer onde foi feita a precipitação; • Dissolver o precipitado com 20 mL de acido sulfúrico 1+4; • Adicionar 50 mL de água; • Titular a quente, com solução de permanganato de potássio 0,1 N, até coloração rósea persistente por 15 segundos; Cálculo: a) Em cálcio por cento p/p (massa por massa): 0,2004 % = V f Ca P × × b) Em óxido de cálcio % p/p: 0,2803 % = V f CaO P × × onde: V = mL da solução de permanganato gasto na titulação; f = fator de correção da solução de permanganato; P = g da amostra usada na precipitação. • Preparo de Permanganato para determinação de cálcio: O permanganato é oxidante, porém o equivalente varia com o grau de oxidação do Mn: - Quando o Mn é reduzido até Mn++ ,sua quantidade equivalente é 1/5 molar (31,6). Mn O4 - + 8H+ + 5 e-  Mn ++ + 4H2O - Quando reduzido até Mn4+ sua quantidade é equivalente é 1/3 molar (52,68) 40
  41. 41. MnO4 - + 4H+ + 3e-  MnO2 2 H2O Considerando que a reação existente na determinação de cálcio com oxalato refere-se á primeira reação expressa, o equivalente do KMnO4 será 31,6. CaC2O4 + KMnO4 + H2SO4  K2SO4 + MnSO4 + CaSO4 + CO2 + H2O (reação sem cálculo de coeficientes) • Padronização do KMnO4 com oxalato de sódio: Preparar uma solução de oxalato de sódio na mesma normalidade do permanganato. Para KMnO4 0,1N,preparar uma solução de oxalato de sódio 0,1 N,pesando 6,7g de sal seco (105°C/2h).Dissolver a quente e completar para 1000mL.Tomar 10 mL +5mL de H2SO4 1:1 e titular a quente (60°C) com KMnO4 0,1N. Fazer um branco,utilizando água no lugar do oxalato de sódio. V real = V gasto – V branco Referência: Normas Analíticas do instituto Adolf Lutz. Manual de preparo de reagentes e soluções – Morita 41
  42. 42. DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO EM QUEIJO PELO MÉTODO DA DUREZA PARCIAL EM ÁGUA Princípio: Fundamenta-se na complexação do cálcio presente na amostra com o EDTA, empregado na titulação, que em presença do indicador de pH (MUREXIDA), muda a cor da solução de rosa salmão para violeta claro. Material: • Balança analítica; • Tubos de ensaio (semi-micro Kjeldhal); • Béquer de 100 mL; • Pipeta volumétrica de 25 mL; • Pipeta graduada de 1 mL; • Erlenmeyer de 100 mL; • Suporte para bureta; • Bureta de 10 mL; • Bastão de vidro. Reagentes: • Ácido nítrico P.A; • Solução de NaOH a aproximadamente 1 N (para ajuste do pH); • Indicador de pH (MUREXIDA). Misturar bem 200 mg de Murexida com 100 g de NaCl p.a; • Solução de EDTA 0,02 M. Preparo e função dos reagentes: Oxalato de potássio 28%: Dissolver 28 g de oxalato de potássio p.a. em água destilada, em balão volumétrico de 100 mL. O oxalato elimina o efeito da precipitação do fosfato de cálcio coloidal durante a titulação da amostra e facilita a detecção do ponto final por eliminar o esmaecimento da cor rósea formada. 42
  43. 43. Ácido acético (1+9): Em balão volumétrico de 100 mL, adicionar 10 mL de ácido acético p.a. e completar o volume para 100 mL com água destilada. O ácido acético apresenta melhores resultados na precipitação da caseína. Solução NaOH 0,111M: Pesar 0,45g de hidróxido de sódio p.a. e diluir com água destilada, em balão volumétrico de 100 mL. Não precisa de padronização. Solução alcalina utilizada para remover a solubilização da suspensão de precipitado de caseína. Solução de NaOH 0,05M: Pesar 0,20g de hidróxido de sódio p.a. e diluir com água destilada, em balão volumétrico de 100 mL. Padronizar esta solução com solução 0,05 ou 0,1M de biftalato de potássio ou de ácido oxálico. A solução de NaOH 0,05M é utilizada como titulante. Essa concentração é a mais indicada, pois soluções com concentrações maiores resultam em baixa sensibilidade e com concentrações menores geram dificuldades na detecção do ponto final da titulação. Formaldeído 35 – 40% p.a.: reagente em sua forma para análise. O formol provoca a liberação de prótons através da reação do formaldeído com os grupos amino das cadeias laterais das proteínas. Sulfato de cobalto hepta-hidratado 5%: Dissolver 1g de sulfato de cobalto hepta-hidratado em 20 mL de água destilada e utilizar 1 mL desta solução para obter o padrão da cor da titulação. Por possuir coloração rósea quando em solução aquosa, representa um padrão de referência de cor para a titulação da amostra. Referência: Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, set / out nº 295,50:(5): 3-14, 1995. Desenvolvimento de Metodologia Analítica para Determinação do Teor de Caseína em Leite. 43
  44. 44. Procedimento: • Pesar analiticamente 1 grama da amostra (queijo, leite, soro ou água de filagem), já dentro do tubo (semi-micro). Fazer as determinações em triplicata para cada produto e em duplicata os controles (brancos); • Adicionar 3 mL de ácido Nítrico; • Levar os tubos para realização da digestão úmida em bloco digestor de proteínas; • Ligar o bloco digestor para o aquecimento gradativo e digestão da das amostras (de 50 em 50ºC até atingir 300ºC; • Em pouco tempo o ácido aquecido reagirá com a amostra e irá evaporar-se; • Quando observar que o ácido evaporou por completo, retira-se os tubos do bloco digestor, preferencialmente colocando-se sobre uma superfície aquecida (chapa aquecedora) e adiciona-se uma nova quantidade de ácido nítrico (3 mL), retornando com os tubos para continuar a digestão. Esse procedimento deve er repetido tantas vezes quanto forem necessárias (6 a 7 vezes) para a obtenção de material digerido de coloração bem esbranquiçada; • Uma vez completada a digestão, dissolver a amostra em água destilada, com auxílio de bastão de viro e 0,5 mL de ácido nítrico para facilitar a dissolução da amostra, transportar a solução inicialemte para um béquer e posteriormente a um balão volumétrico de 100 mL, onde o volume deverá ser completado; • Agitar o balão e retirar 25 mL com pipeta volumétrica e colocar em um erlenmeyer de 100 mL; • Adicionar 1 mL (ou mais) de NaOH 1 N, o suficiente para elevar o pH da alíquota para um valor próximo a 12; Fator de Acidez do Formol – FAF: • Transferir 2 mL de formoldeído 35-40% para um erlenmeyer de 125 mL; • Adicionar 10 mL de água destilada e 1 mL de fenolftaleína; • Titular por uma solução de hidróxido de sódio 0,05M até exata coincidência com a cor padrão; • O volume gasto constitui o fator de acidez do formol. 44
  45. 45. Determinação: • Trasferir 10 mL de leite a 20ºC para um tubo de ensaio; • Adicionar 10 mL de água destilada a 40ºC e 1,5 mL de ácido acético 1+9; • Misturar de forma a garantir a precipitação da caseína. Não utilizar o vórtex nessa etapa; • Aguardar 5 minutos e centrifugar a 1200 rpm por 5 minutos (425 g); • O precipitado deverá depositar no fundo do tubo e o sobrenadante deverá ser razoavelmente límpido, com alguma separação de gordura; • Descartar o sobrenadante; • Adicionar 5 mL de água destilada a 60ºC e dispersar o precipitado com auxílio do vórtex; • Adicionar 0,5 mL de solução alcoólica neutralizada de fenolftaleína a 1% e aproximadamente 6 mL de NaOH 0,111M; • Ressuspender o precipitado com o auxílio do vórtex; • Adicionar 0,4 mL de solução de oxalato de potássio 28%; • Se necessário, resfriar o tubo para 20ºC; • Esperar 2 minutos e titular com uma solução de NaOH 0,05M até ponto de exata coincidência com a cor padrão (pH 8,3). Durnate a titulação, pode ser necessário utilizar o vórtex para garantir a mistura da solução alcalina com a amostra em análise; • Adicionar 2 mL de formoldeído 35 – 40 %; • Esperar 20 segundos e titular novamente com a solução de NaOH 0,05 M, até exata coincidência com a cor padrão (pH 8,3). Cálculo do percentual de Caseína: O fator encontrado para a conversão de mL de NaOH 0,05 M para percentual de caseína foi de 0,874, o que possibilita calcular o percentual de caseína por meio da fórmula abaixo: % (p/v) caseína = (mL – FAF) x 0,874 onde: mL = mL de solução de NaOH 0,05 M gastos na segunda titulação; 45
  46. 46. FAF = fator de acidez do formol. 46
  47. 47. DETERMINAÇÃO DE CASEÍNA – MÉTODO DIRETO E INDIRETO Princípio: No método direto, o nitrogênio caséico do leite é determinado diretamente do precipitado de caseína obtido através da precipitação com ácido acético e acetato de sódio. No método indireto, o nitrogênio total e o não caséico do leite são determinados separadamente. A diferença ente os resultados das determinações é o nitrogênio caséico do leite. Calcula-se a procentagem de caseína da amostra por diferença entre as proteínas não caséica e total. 1) MÉTODO DIRETO: Reagentes: • Solução de acetato de sódio 1 N (136 g NaAc.3H2O para 1000 de solução); • Solução de ácido acético 10%; • Solução Buffer: 1,0 mL de solução de acetato de sódio 1 N + 1,0 mL de solução de ácido acético 10% e completar para 100 mL com água destilada; • Papel filtro Whatman 1; • Reagentes para determinação de proteína – Kjeldhal. Procedimento: • Pesar 5,0 mL de leite (0,0001 g) em tubo de Kjeldahl; • Adicionar 70 mL de água destilada; • Adicionar 0,75 mL de solução de ácido acético 10%; • Misturar gentilmente; • Deixar a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos; • Adicionar 0,75 mL de solução de acetato de sódio 1 N; • Filtrar em papel Whatman 1 e coltear o filtrado; • Parte do precipitado de caseína ficará no tubo de Kjeldahl e parte será coletado no papel filtro. Não é necessário remover todo o precipitado do tubo. Filtrar completamente; 47
  48. 48. • Adicionar 30,0 mL de solução buffer e enxaguar todo o precipitado do gargalo do tubo. • Filtrar novamente no mesmo papel de filtro e recolher o filtrado; • Enxaguar com mais de 30,0 mL de solução buffer; • Remover o precipitado mais o papel e secar o mesmo cuidadosamente; • Digerir o papel mais a amostra; • Fazer um branco do papel; • Calcular a porcentagem de caseína da seguinte forma: ( ) 1, 4008 6,38 % caseína = s bV V fc N pa − × × × × onde: N, fc = HCl usado na titulação; Vs e Vb = volume de HCl da amostra e do branco, respectivamente; Pa = peso da amostra em g; 6,38 = fator de conversão de nitrogênio para proteína. 2) MÉTODO INDIRETO • Determinar o nitrogênio total segundo o método Kjeldahl; • Detrminar nitrogênio não caséico com o filtrado do método descrito por Barbano, Casein Methods; • Calcular a porcentagem de caseína da seguinte forma: % caseína = (% nitrogênio total - % nitrogênio não caseico) x 6,38 Referência: Casein Methods, Barbano IDF – 1964 / Det. Of the casein content in milk/29 Rowland S.J. – 1938. The determination of the nitrogen distribution on milk. J. Dairy Res. 9:42 48
  49. 49. DETERMINAÇÃO DE CASEÍNA EM LEITE PELO MÉTODO DO FORMOL Princípio: O método de formol é baseado no medição dos prótons liberados pela reação do formoldeído com os grupos amino livres das moléculas de caseína após separação isoelétrica e ressuspensão por elevação do pH. Materiais: • Erlenmayer de 125 mL; • Béquer de 100 mL; • Bureta de 10 mL; • Pipeta volumétrica de 10 mL; • Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL; • Tubo de ensaio com tampa plástica rosqueável, de tamanho compatível com a centrífuga de Gerber, capacidade mínima de 25 mL e máxima de 70 mL; • Pisseta; • Pêra pipetadora; • Termômetro 0 a 100ºC; • Agitador para tubos de ensaio – vórtex; • Centrífuga de Gerber. Reagentes: • Água purificada; • Solução de ácido acético 1 + 9; • Solução alcoólica fenolftaleína 1% neutralizada; • Solução de oxalato de potássio 28%; • Solução de sulfato de cobalto hepta-hidratado a 5%; • Formoldeído 35 – 40% p.a; • Solução de hidróxido de sódio 0,05 mol/L; • Solução de hidróxido de sódio 0,111 mol/L – Dornic. 49
  50. 50. Padrão de cor: • Tranferir 10 mL de leite para um tubo de ensaio; • Adicionar 10 mL de água destilada, 0,4 mL de oxalato de potássio 28% e 1 mL de sulfato de cobalto hepta-hidratado 5%; • Reservar para servir como comparação de cor na detecção do ponto final das titulações. Preparo e função dos reagentes: Oxalato de potássio 28%: Dissolver 28g de oxalato de potássio P.A. em água destilada, em balão volumétrico de 100 mL. O oxalato elimina o efeito da precipitação do fosfato de cálcio coloidal durante a titulação da amostra e facilita a detecção do ponto final por eliminar o esmaecimento da cor rósea formada. Ácido acético (1+9): Em balão volumétrico de 100 mL, adicionar 10 mL de ácido acético p.a. e completar o volume para 100 mL com água destilada. O ácido acético apresenta melhores resultados na precipitação da caseína. Solução NaOH 0,111M: Pesar 0,45g de hidróxido de sódio p.a. e diluir com água destilada, em balão volumétrico de 100 mL. Não precisa de padronização. Solução alcalina utilizada para remover a solubilização da suspensão de precipitado de caseína. Solução de NaOH 0,05M: Pesar 0,20g de hidróxido de sódio p.a. e diluir com água destilada, em balão volumétrico de 100 mL. Padronizar esta solução com solução 0,05 ou 0,1M de biftalato de potássio ou de ácido oxálico. A solução de NaOH 0,05M é utilizada como titulante. Concentração mais indicada, pois soluções com concentrações maiores resultam em baixa sensibilidade e com concentrações menores geram dificuldades na detecção do ponto final da titulação. Formaldeído 35 – 40% p.a.: reagente em sua forma para análise. 50
  51. 51. O formol provoca a liberação de prótons através da reação do formaldeído com os grupos amino das cadeias laterais das proteínas. Sulfato de cobalto hepta-hidratado 5%: Dissolver 1g de sulfato de cobalto hepta-hidratado em 20 mL de água destilada e utilizar 1 mL desta solução para obter o padrão da cor da titulação. Por possuir coloração rósea quando em solução aquosa, representa um padrão de referência de cor para a titulação da amostra. Referência: Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, set / out nº 295,50:(5): 3-14, 1995. Desenvolvimento de Metodologia Analítica para Determinação do Teor de Caseína em Leite. 51
  52. 52. DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO – PROF. LÚCIA Reagentes: Solução A: Molibdato de Amônio (80g/L) • Dissolver 40g de molibdato de amônio tetrahidratado em 400 mL de água quente; • Resfriar e levar a 500 mL em balão volumétrico. Esta solução é estável por vários meses. Solução B: Metavanadato de Amônio (4g/L em HCl 5M) • Cuidadosamente despejar 250 mL de HCl concentrado em 200 Ml de água, juntar 2g de metavanadato de amônio e aquecer até dissolver; • Resfriar e levar a 500 mL em balão volumétrico. Esta solução é estável Solução Padrão (2mg P / mL): • Dissolver 8,788g de KH2PO4 em HzO e diluir a 1 litro. O KH2PO4 deve ser seco a 105°C até o peso constante. Solução de HCl 2,5,M Procedimento: o Preparo da solução de molibdovanadato: Em um balão volumétrico de 100 mL, juntar 25 mL da solução de HCl 2,5M. o Curva padrão:  Tomar com pipeta volumétrica, 10 mL da solução padrão com 2 mg de fósforo por mL e colocar num balão volumétrico de 100 mL. Levar a volume;  Em balões volumétricos de 100 mL colocar alíquotas de 1,3,5,8 e 10 mL da amostra diluída;  Juntar 20 mL da solução de molibdovanadato. Levar a 100 mL  Em outro balão de 100 mL, colocar 20 mL da solução de molibdovanadato e completar o volume. Utilizar esta última solução como branco;  Realizar as leituras das absorbâncias dos padrões a 470nm. 52
  53. 53. Amostra: • Incinerar 2 a 3g de amostra por 4 horas a 600°C; • Resfriar, juntar 20 mL de HCl (1+3) e algumas gotas de HNO3; • Levar à fervura; • Resfriar, transferir para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume; • Desta solução retirar 20 mL para um balão de 100 mL; • Adicionar 20 mL da solução de molibdovanadato e completar o volume; • Deixar em repouso por 10 minutos; • Proceder a leitura da absorbância a 470 nm. Cálculos: Determinar o teor de fósforo na amostra original: Equação da reta: y = ax +b y = absorbância x = concentração a = inclinação da reta obtido na curva padrão Portanto: *500 = fator pa = peso da amostra (g) C = concentração (mg) 53 Mg P / g amostra = pa C *500×
  54. 54. DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO EM ALIMENTOS PELOS REAGENTES METAVANADATO E MOLIBDATO DE AMÔNIO – PROF. CONTRERAS Reagentes: Solução A: • Molibdato de amônio (80 g/L). Solução estável por vários meses. Solução B: metavanadato de amônio 4 g/L em HCl 5M.. • Despejar cuidadosamente 250 mL de HCl concentrado em 200 mL de água; • Junte 2 g de metavanadato e aqueça até dissolver; • Resfrie e eleve a 500 mL. Esta solução é estável. Solução padrão Stock: • 2 mg/mL. Dissolva a 8,788 g de KH2PO4 e dilua a 100 mL; • Este sal deve ser seco a 105ºC até peso constante. Amostra: • Pesar entre 0,1 e 0,2 g de amostra seca e moída e digerir com 2 mL de HClO4 e 0,5 mL de HNO3; • Ferver até ficar totalmente claro; • Caso esteja difícil, adicionar HClO4 e HNO3 novamente; • Opcionalmente, pode-se usar H2SO4 e HNO3 ou H2O2, porém a digestão será mais demorada; • Após terminada a digestão com HClO4, verificar se ficaram entre 2 a 4 mL de ácido (caso contrário, adicionar a quantidade necessária); • Aferir a 50 mL com água e misturar bem. Procedimento: • Diluir 5 mL do padrão para 100 mL com água, resultando um padrão com 100 microlitros/mL; • Desta solução, medir 1 mL, 0,5 mL e 0,25 mL em tubos de ensaio de 30 mL; 54
  55. 55. • Aferir a 5 ml com solução branco feita com HClO4 e HNO3, semelhante às amostras; • Colocar como branco, 5 mL da solução em tubo de ensaio; • Das amostras aferidas a 50 mL, medir 5 mal em tubo de ensaio; • Das amostras aferidas a 50 mL, medir 5 mL em tubo de ensaio de 30 mL e adicionar, então, nas amostras, nos padrões e no branco, 2,5 mL de uma mistura da solução A e solução B, relação 1:1 (v/v); • Misturar e ler após 30 minutos a 420 nm OBS.: A mistura da solução A e B deve ser preparada na hora. Cálculo: A leitura da quantidade de fósforo por esse método é realizada em espectrofotômetro. A quantidade pode ser calculada através de uma regra de três simples: (padrão)espectroemleitura microlitro(100padrãodoãoConcentraçx(amostra)espectroemleitura =(x)amostradaãoConcentraç Obs: a leitura é feita em espectrofotômetro. 55
  56. 56. DETERMINAÇÃO DE GORDURA PELO MÉTODO DE BLIGH-DYER Material: • Tubos de 250 x 25 mm (capacidade de aproximadamente 70 mL); • Tubos de 150 x 15 mm (capacidade de aproximadamente 30 mL); • Agitador rotativo para tubos; • Centrífuga de baixa rotação; • Tampas de roscas protegidas internamente com teflon ou PVC. Reagentes: • Metanol p.a.; • Clorofórmio p.a.; • Sulfato de sódio anidro; • Solução de Na2SO4 1,5% com água. Procedimento: Quando se trata de produtos com teores de gordura acima de 20% (leite integral em pó, extrato hidrossolúvel de sódio, amendoim, sementes) pesar entre 2,0 a 2,5 g e para os produtos com menos de 20%, pesar entre 3 a 3,5 g. É essencial que as amostras estejam completamente moídas. • Transferir a quantidade pesada para os tubos de 70 mL e adicionar exatamente: o 10 mL de clorofórmio; o 20 mL de metanol; o 8 mL de água destilada. • Tampar hermeticamente; • O volume dos solventes adicionados correspondem (10, 20, 8) a uma relação de 1:2:0,8 clorofórmio, metanol e água. Nessa proporção os 3 solventes coexistem em uma solução homogênea. Colocar os tubos no agitador rotativo por 30 minutos; • Em seguida, adicionar exatamente 10 mL de clorofórmio e 10 mL da solução de Na2SO4 1,5%, tampar e agitar vigorosamente por 2 minutos; 56
  57. 57. • A adição de mais clorofórmio e mais água muda a proporção para 2:2:1,8, causando a separação total do clorofórmio que carrega lipídios (camada inferior). Portanto, todos os lipídios da amostra ficam dissolvidos em 20 mL de clorofórmio; • Deixar separar as camadas de forma natural ou centrifugar a 1000 rpm por 2 minutos para acelerar a separação; • Retirar da camada inferior (clorofórmio) entre 13 e 15 mL e colocar num tubo de 30 mL; • Adicionar aproximadamente 1 g de Na2SO4 anidro, tampar e agitar para remover os traços de água que invariavelmente são arrastados na pipetagem; • Filtrar rapidamente num funil pequeno usando papel de filtro qualitativo; a solução deve ficar límpida; • Medir exatamente 5 mL do filtrado e despeja-los num béquer de 50 mL previamente pesado; • Colocar o béquer numa estufa a 100ºC até evaporar o solvente (15 a 20 minutos); • Resfriar em dessecador e pesar. Cálculo: onde: P = peso dos lipídios (em g) contidos nos 5 mL; g = peso da amostra, em g; 4 = 20mL clorofórmio/ 5 mL amostra. Quando as amostras contém água acima de 10%, a relação de solventes deve ser reconsiderada, levando em conta a % água da amostra. Referência: Bligh, E.G.; & Dyer, W.J. – A Rapid Method od Total Lipid Extration and Putification. Can. J. Biochem. Physic. 37:911 – 917, 1959. 57 4 % lipídios totais = 100 P g × ×
  58. 58. DETERMINAÇÃO DE GORDURA PELO MÉTODO DE GERBER Princípio: Fundamenta-se no ataque seletivo da matéria orgânica por meio do ácido sulfúrico, com exceção da gordura, que é separada por centrifugação, auxiliada pelo álcool amílico que modifica a tensão superficial. 1) LEITE Material: • Butirômetro Gerber; • Pipeta volumétrica de 11 mL; • Pipeta graduada de 1 e 10 mL; • Amostra; • Banho-maria a 65ºC; • Centrífuga; • Rolha; • Óculos de proteção; Reagentes: • Ácido sulfúrico d = 1,820 • Álcool isso-amilico d = 0,815 • Preparo do ácido sulfúrico de d = 1,820 o Misturar com muito cuidado 120 mL de água destilada com 1000 mL de ácido sulfúrico d = 1,840, da seguinte forma:  Colocar o ácido sulfúrico concentrado em refrigerador na véspera do preparo da solução. Fazer um banho de gelo, colocar um béquer de vidro com 120 mL de água destilada gelada no banho. Com muito cuidado, adicionar lentamente o ácido sulfúrico concentrado, agitando sempre com um bastão de vidro.  Esperar esfriar bem e então conferir a densidade com um densímetro. 58
  59. 59. Procedimento: • Adicionar 10 mL de ácido sulfúrico no butirômetro; • Colocar 11 mL de amostra de leite no butirômetro com a pipeta, deixando escorrer lentamente sobre a parede do mesmo para não queimar a amostra; • Colocar 1 mL de álcool iso-amílico no butirômetro; • Fechar com rolha apropriada, limpando as bordas internas do gargalo antes; • Agitar o butirômetro invertendo-o quantas vezes for necessário para tornar o conteúdo homogêneo (TOMAR CUIDADO pois há aquecimento, segurar com pano ou papel); • Centrifugar o butirômetro por cerca de 5 minutos a 1000-1200 rpm em centrífuga de Gerber; • Retirar da centrífuga; • Levar ao banho-maria por 3-5 min a 65ºC com a rolha para baixo; • Retirar do banho-maria com a rolha para baixo, colocar a camada de gordura na escala do butirômetro; • Fazer a leitura diretamente na escala do butirômetro. 2) NO CREME Material: • Butirômetro para creme; • Pipeta volumétrica de 5 ml (2); • Pipeta graduada de 1 e 10 mL; • Amostra; • Banho-maria a 65ºC; • Centrífuga de Gerber; • Rolha; • Óculos de proteção; • Água destilada a 40ºC; 59
  60. 60. Reagentes: • Ácido sulfúrico d = 1,820; • Álcool isso-amilico d = 0,815; Procedimento: • Colocar no butirômetro 10 mL de ácido sulfúrico e adicionar 5 mL de creme de leite bem homogeneizado; • Com outra pipeta de 5 mL, pipetar 5 mL de água quente e passar essa água pela pipeta do creme, retirando assim os resíduos de creme; • Colocar 1 mL de álcool isso-amilico, limpar o gargalo do butirômetro e tapar com rolha apropriada; • Agitar bem e centrifugar por 5 minutos; • Colocar em banho-maria a 65ºC fazer leitura direta. 3) NO QUEIJO Material: • Butirômetro para queijo; • Pipeta volumétrica de 11 mL; • Pipeta graduada de 1 e 10 mL; • Amostra; • Banho-maria a 65ºC; • Centrífuga de Gerber; • Rolha; • Óculos de proteção; • Água destilada fria e a 65ºC; • Balança de precisão para 3g; Reagentes: • Ácido sulfúrico d = 1,820 -1,825; • Álcool iso-amílico d = 0,815; 60
  61. 61. Procedimento: • Pesar 3g de amostra no copinho do butirômetro e adaptar o conjunto (copinho + rolha) ao butirômetro; • Pela abertura menor adicionar 5 mL de água destilada fria; • Juntar lentamente 10 mL de ácido sulfúrico, limpar o gargalo se necessário, tapar e agitar vigorosamente, protegendo as mãos com um pano ou papel; • Fazer imersões em banho-maria até completa dissolução das partículas de queijo; • Adicionar 1 mL de álcool amílico e completar a escala com água destilada a 65ºC; • Tapar, agitar novamente e centrifugar por 5 minutos; • Colocar em banho-maria por 5 minutos e fazer leitura direta; 61
  62. 62. DETERMINAÇÃO DE GORDURA POR MOJONNIER – MÉTODO AOAC Material: • Frascos mojonnier (fazer triplicatas para as amostras e duplicatas para o branco); • Placas de Petri grandes; • Dessecador; • Pipetas de 10 mL e 25 mL; • Pinça tipo tenaz; • Estufa a 105ºC; • Balança analítica; • Placa de Aquecimento. Reagentes: • Hidróxido de amônio p.a.; • Solução indicadora de fenolftaleína; • Álcool etílico 99ºGL p.a.; • Éter etílico p.a.; • Éter de petróleo p.a.; Quantidade de amostra: • Leite, leite desnatado, buttermilk e soro: agitar firmemente 3 vezes o frasco contendo a amostra, pipetar 10 mL e pesar; • Creme: deixar a amostra à 21ºC e homogeneizar passando de um frasco para outro. Pesar 2 g se a porcentagem de gordura for menor que 25%, ou 1 g se a porcentagem de gordura for maior que 25%; • Leite em pó integral: pesar 1 g e adicionar 8,5 mL de água quente. Utilizar 25 mL de éter (etílico e de petróleo) também na segunda extração; • Leite em pó desnatado: pesar 1 g e adicionar 8,5 mL de água quente; • Manteiga: Pesar 1 g de amostra e adicionar 8 mL de água quente. Utilizar 1,5 mL de hidróxido de amônio; 62
  63. 63. • Queijo: pesar 1 g de amostra e adicionar 8 mL de água quente. Utilizar 3,0 mL de hiróxido de amônio. Procedimento: • Retirar as amostras do freezer e deixa-las atingir a temperatura ambiente; • Lavar cuidadosamente os frascos mojonnier e seca-los. Identifica-los; • Lavar rigorosamente as placas de Petri e coloca-las em estufa 105ºC por duas horas para secar. Retirar da estufa, colocar em dessecar e pesar depois de frio. Manusear estes recipientes somente usando pinças; • Pesar as amostrar no frasco mojonnier (fazer triplicata): colocar o frasco em um dispositivo adequado sobre o prato da balança e tarar. Colocar a amostra cuidadosamente no frasco mojonnier e registrar o peso da amostra; • Retirar as placas do dessecador, pesar e colocar sobre uma placa aquecida previamente ajustada. Estes recipientes serão usados para a coleta dos solventes contendo a gordura; • Na capela, adicionar ao frasco mojonnier 1,5 mL (se for queijo, 3,0 mL) de hidróxido de amônio p.a. e 6 gotas de solução de fenolftaleína; • Agitar os frascos de forma a misturar os reagentes com as amostras; • Iniciar a primeira extração; • Adicionar 10 mL de álcool etílico e fechar o frasco hermeticamente com rolha previamente umedecida. Agitar por 30 segundos; • Adicionar 25 mL de éter etílico. Fechar o frasco e agitar por 20 segundos; • Adicionar 25 mL de éter petróleo, fechar o frasco e agitar por 20 segundos; • Esperar uma boa separação entre as fases orgânica e aquosa; • Retirar a placa de Petri da placa de aquecimento e despejar cuidadosamente a fase orgânica na placa, observando a linha divisória entre as duas fases; • Retornar as placas para o aquecimento, para evaporação dos solvenes; • Iniciar a segunda extração: • Adicionar 5 mL de álcool etílico no frasco mojonnier, fechar e agitar por 20 segundos; • Adicionar 15 mL (25 mL se for leite em pó) de éter etílico, fechar o frasco e agitar por 20 segundos; 63
  64. 64. • Adicionar 15 mL (25 mL se for leite em pó) de éter de petróleo, fechar o frasco e agitar por 20 segundos; • Coletar a fase orgânica, repetindo o procedimento descrito anteriormente; • Iniciar a terceira extração: • Adicionar 5 mL de álcool etílico no frasco de mojonnier, fechar e agitar por 20 segundos; • Adicionar 15 mL de éter etílico, fechar o frasco e agitar por 20 segundos; • Adicionar 15 mL de éter de petróleo, fechar o frasco e agitar por 20 segundos; • Coletar a fase orgânica nas placas de Petri e mantê-las na placa aquecida até total evaporação dos solventes, permanecendo somente a gordura. Colocar as placas na estufa a 105ºC por 50 minutos; • Retiras as placas da estufa, colocar em dessecador e pesar depois de frio. Cálculos: (peso seco - peso placa) - peso branco % gordura = 100 peso amostra × 64
  65. 65. DETERMINAÇÃO DE GORDURA EM LEITE EM PÓ Metodologia: Bligh-Dyer descrita no arquivo “gordura”. Bligh e Dyer, em 1959, sugeriram um método de extração de gordura a frio que utilizava uma mistura de três solventes, clorofórmio-metanol-água. • Misturar a amostra com metanol e clorofórmio que devem estar numa proporção de forma a ficar somente em uma fase com a amostra; • Em seguinte, adicionar mais clorofórmio e água de maneira a formar duas fases distintas, uma de clorofórmio, contendo os lipídeos e a outra de metanol mais água, contendo as substâncias não lipídicas; • Isolar a fase de clorofórmio, contendo a gordura; • Evaporar o clorofórmio, obtendo-se assim, a quantidade de gordura por pesagem; O método tem uma série de vantagens em relação à extração a quente: 1. Extrai todas as classes de lipídeos, inclusive os polares que apresentam um alto teor em produtos de trigo e soja e são importantes para avaliações dietéticas; 2. Os lipídeos são extraídos sem aquecimento e os extratos podem ser utilizados para avaliação de deterioração dos lipídeos através dos índices de peróxidos e ácidos graxos livres, além das determinações do teor de carotenóides, vitamina E, composição de ácidos graxos e esteróis; 3. Pode ser utilizado em produtos com altos teores de umidade, além dos produtos secos; 4. A determinação completa pode ser realizada em tubos de ensaio não necessitando de equipamentos especializados e sofisticados. 65
  66. 66. DETERMINAÇÃO DE LACTOSE Princípio: Este método volumétrico é mais conhecido como método de Lane e Eynon. Consiste em precipitar quantitativamente o óxido cuproso da solução de Fehling pela ação redutora do açúcar invertido. O indicador azul de metileno é passado para sua forma incolor na solução alcalina depois que todo o cobre foi precipitado. O ponto final da titulação ocorre quando a cor azul de indicador for completamente mudada para amarelo e quando formar um precipitado vermelho devido à formação de óxido cuproso. Preparo dos reagentes: 1. Solução de Fehling: • Solução A: Pesar 34,65 g de CuSO4.5H2O, dissolver em água e completar a 500 mL com água destilada; • Solução B: Pesar 173 g de tartarato de sódio e potássio e 100 g de hidróxido de sódio e diluir a 500 mL com água destilada. 2. Solução padrão de lactose: • Pesar 1,0000 g de lactose anidra (dessecar em estufa à vácuo a 40ºC por 2 horas) e dissolver em água, até completar 250 mL. 3. Solução de ácido wolfrâmico: para 1 litro de solução, utilizar: • 14 g de tungstato de sódio; • 0,2 mL de ácido o-fosfórico; • 140 mL de ácido sulfúrico 1 N. 4. Solução de azul de metileno 1%: • Dissolver 1 g de azul de metileno em água e completar para 100 mL. 66
  67. 67. Padronização das soluções de fehling: As soluções são padronizadas com a solução padrão de lactose. Seguir o mesmo procedimento da titulação das amostras. Cálculo do fator de correção: 1 g de lactose -------- 250 mL de solução fc -------- Vg Onde: fc: fator de correção das soluções de Fehling, a; Vg: volume gasto na titulação das soluções, usando a solução padrão. Procedimento: Preparo da amostra: • Juntar uma parte de leite com uma parte de ácido wolfrâmico (diluição 1:1) e filtrar; • Fazer diluição 1:4 (50 mL do filtrado em balão volumétrico de 200 mL). Esta será a solução para titular Fehling. Titulação: • Tomar 5 mL de cada uma das soluções de Fehling e colocar num erlenmeyer de 250 ml; • Completar uma bureta de 25 mL com a solução da amostra obtida anteriormente; • A titulação é feita a quente: levar o conteúdo do erlenmeyer à ebulição; • Adicionar 3 a 4 gotas de indicador azul de metileno e adicionar a solução da bureta, gota a gota, sem tocar nas paredes do frasco e com agitação constante. • Os reagentes devem ser mantidos em ebulição moderada. A titulação deve ser completada em 3 minutos do inicio da ebulição, e durante este tempo o frasco não deve ser removido da fonte de calor; a contínua emissão de vapor do gargalo do frasco protege contra oxidação inversa devido à presença de ar. A titulação dever ser conduzida sempre com reagentes em ebulição, até que a cor do indicador seja mudada completamente, e que os componentes adquiram aparência avermelhada do óxido cuproso. Se a ebulição atrapalhar a observação da cor do indicador, adicionar mais indicador, de forma a visualizar a mudança de 67
  68. 68. cor de azul para amarelo. Um modo prático de observar se está amarelo é parar a agitação por alguns segundo; o precipitado se acomodará no fundo do erlenmeyer e a solução poderá ser melhor observada. É muito importante que a cor do indicador mude para amarelo. Do contrário, a titulação estará incompleta. Cálculo: 100 % de lactose = d a b × × Onde: d = fator de diluição usado na preparação de amostra; a = fator de correção das soluções de Fehling; b = volume gasto na titulação da amostra. Referência: LANARA – Secretaria de Defesa Agropecuária, M.A. Métodos Analíticos Oficiais de Controle de Produtos de Origem Animal e seus Ingredientes. II- Métodos Físicos e Químicos. Brasília – DF/1981 68
  69. 69. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO 1) NITROGÊNIO NÃO CASEICO EM LEITE Material: • Balão volumétrico de 100 mL; • Pipeta volumétrica de 50 mL; • Papel Whatman nº 1; • Pipetas volumétricas de 1 mL; • Banho-maria; • Funil de vidro; • Tubos de digestão de macro-Kdjeldahl. Reagentes: • Solução de aetato de sódio 1 N; • Ácido acético 10%; • Reagentes para determinação de proteína – micro Kjeldahl. • Preparo da solução de acetato de sódio 1 N: dissolver 136 g de NaAc.3H2O em água destilada e completar para 1000 mL. Procedimento: • Deixar a amostra à temperatura de 38ºC; • Pesar 10 mL de amostra em balão volumétrico de 100 mL. Anotar o peso; • Adicionar 75 mL de água a 40ºC, 1 mL de solução de ácido acético 10%, misturar e deixar em repouso por 10 minutos, incubando o balão em banho-maria com a temperatura constante de 40ºC; • Adicionar 1 mL de acetato de sódio 1 N e agitar; • Após resfriamento à temperatura ambiente, completar o volume com água destilada; • Deixar o precipitado se acomodar e filtrar em papel Whatman 1; 69
  70. 70. • Coletar todo o filtrado para observar se está límpido e sem partículas. Se não estiver límpido, repetir a preparação da amostra; • Pipetar com pipeta volumétrica 50 mL do filtrado e colocar em tubo de macro- Kjeldahl contendo o catalisador; • Levar à digestão, utilizando as mesmas quantidades de reagentes do método de proteína total-macro Kdjeldahl; • Fazer um branco com 50 mL de água destilada, 0,5 mL de solução de ácido acético 10% e 0,5 mL de solução de acetato de sódio 1 N. Cálculos: % nitrogênio não caseico = pa fcNVbVa 994,02)(4007,1 ××××−× onde: Va = volume de titulante gasto para titular a amostra; Vb = volume de titulante gasto para titular o branco; N = Normalidade do HCl; fc = fator de correção de HCl utilizado; pa = peso de amostra, em gramas; 0,994 = correção do volume de precipitado, considerando leite integral. Se o leite for desnatado, considerar o fator 0,998. Referência: Casein Methods – Barbano: International Dairy Federantion. 1964. Determination of de casein contento f milk. IDF Standard nº 29, IDF, Brussels, Belgium. Rowland, S.J., 1938. The determination of the Nitrogen distribution in milk. J. Dairy Res. 9:42. 2) DETERMINAÇÃO DE NITROGENIO NÃO PROTEICO – SEGUNDO O MÉTODO DESCRITO POR GRIPON ET AL (1975) 70
  71. 71. • Do filtrado obtido anteriormente (determinação de nitrogênio solúvel), pipetar 5 mL e adicionar 2,2mL de solução de acido fosfotungstico a 10 % e 2,5 mL de uma solução de acido sulfúrico a 25%. • Após 24 horas de contato a temperatura ambiente, filtrar a solução através de papel Whatman n° 42 e pipetar do filtrado, 5 mL para determinação de nitrogênio não protéico (Kjeldahl). Reagentes utilizados: • Solução de Sharp; • Acido fosfotungstico a 10 %; • Acido sulfúrico a 25 %. 3) DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO NÃO PROTÉICO EM LEITE Material: • Pipeta volumétrica de 5 mL e 10 mL; • Béquer de 100 mL; • Papel Whatman 42. Reagentes: • Água destilada; • Solução de ácido tricloroacético 24%; • Reagentes para digestão/destilação de proteínas – Kjeldahl; Procedimento: • Pipetar 5 mL de amostra e pesar; • Adicionar 5 mL de água no béquer; • Adicionar lentamente e sob agitação, 10 mL de ácido tricloroacético – TCA 24%; • Deixar repousar por 15 minutos; • Após o repouso, filtrar em papel Whatman 42; • Coletar todo o filtrado para observar se está límpido e sem partículas. Se não estiver límpido, repetir a preparação de amostra; 71
  72. 72. • Pipetar com pipeta volumétrica 5 mL do filtrado, pesar e colocar em tubo de macro- Kjeldahl contendo catalisador; • Levar à digestão, utilizando as mesmas quantidades de reagentes do método de proteína total-micro Kjeldahl. Cálculos: onde: V, fc e N = HCl utilizado na titulação; Pa e pb = peso das alíquotas em gramas; 20 = diluição Referência: Aschaffenburg, R.; Drewry, J. New procedure for the routine determination of the varioius non casein proteins of milk. International Dairy Congress, 15; London, 1959. Proceeding… International Dairy Federation. 3; 1631 – 1637, 1959. 4) DETERMINAÇÃO DE NITROGENIO SOLÚVEL – SEGUNDO O MÉTODO DESCRITO POR KOSIKOWSHI (1978) • Em uma cápsula de porcelana, pesar 3,0g de queijo e a seguir, acrescentar 10 mL de solução de extração de SHARP a 50°C; • Macerar a amostra de queijo com esta solução até formação de massa homogênea, e transferi-la para um balão volumétrico de 100mL; • Completar o volume do balão com a solução de SHARP e agitar vigorosamente por 5 minutos; • Em seguida colocar o balão volumétrico com a amostra em banho-maria a 50°C por 1 hora com agitação constante; • Ao final deste tempo, filtrar em papel Whatman n° 10. Do filtrado, pipetar 5 mL para determinação de nitrogênio solúvel (Kjeldahl). 5) DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO SOLÚVEL A pH 4,6 72 V x N x f x 1,4008 x 20 % NNP = c a bp p×
  73. 73. Material: • Proveta de 100 mL; • Proveta de 250 mL; • Béquer de 50 mL; • Béquer de 250 mL; • Balão volumétrico de 1000 mL; • Frasco p/ reagente de 1000 mL; • Balança analítica. Reagentes: • Acetato de sódio . 3 H2O; • Cloreto de sódio p.a.; • Cloreto de cálcio . 2 H2O; • Ácido acético p.a.; Amostragem: 1. Cortar o queijo separado para análise em cubos pequenos (no máximo 2,5cm aresta); 2. Colocar não mais de 12 pedaços de queijo no processador (reduzir os pedaços se a umidade da amostra for muito elevada); 3. Moer os pedaços por aproximadamente 5 segundos. Parar o processador para misturar os pedaços e moer por 5 segundos novamente. Repetir este processo até que os pedaços de queijo fiquem com tamanho aproximado de 2-3 mm; 4. Colocar o queijo moído em um recipiente de plástico limpo e seco; 5. Moer todo o queijo restante, seguindo os passos 2 a 4; 6. Cuidadosamente, misturar toda a amostra de queijo moída; 7. Colocar as amostras em embalagens plásticas fechadas hermeticamente; 8. Refrigerar as amostras até o momento da análise. As amostras resistem bem por uma semana; 9. Congelar uma parte da amostra para ser usada em caso de problemas nas análises, já que a amostra refrigerada pode deteriorar antes do final das análises. Se for necessário utilizar amostra congelada, não moer; simplesmente retirar uma amostra do freezer e 73
  74. 74. pesar. Somente algumas análises podem ser realizadas em amostras congeladas (não determinar umidade em amostras congeladas). Solução stock: • Pesar 136,1g de acetato de sódio em béquer de 250 mL; • Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000mL com auxílio de 200 mL de água destilada; • Pesar 47,0g de cloreto de sódio e 11,78g de cloreto de cálcio em 2 béquers de 50 mL; • Transferi-los quantitativamente para o balão contendo o acetato de sódio, utilizando 100 mL de água destilada; • Medir 57,5 mL de ácido acético p.a. em proveta de 100 mL; • Acrescentar esse ácido no balão contendo ou outros reagentes; • Acrescentar 300 mL de água destilada e agitar bem; • Quando os sais dissolverem, completar o balão volumétrico com água destilada a 20°C. Solução working: • Colocar 250 mL da solução stock em proveta; • Transferir para balão de 1 litro e acrescentar 70 mL de água destilada; • Misturar bem e completar para 1 litro. O pH deverá ser em torno de 4,6. Procedimento: O procedimento seguinte deve ser realizado após amostragem e moagem do queijo descrita anteriormente. 1) Com auxílio de uma espátula, descartar aproximadamente 1 cm da superfície do queijo moído. Isto deve ser feito para remover o queijo que possa ter perdido umidade por estar na superfície do recipiente; 2) Pesar 0,75g (0,7400-0,7600) de queijo em papel de pesagem. Pesar o queijo + papel e transferir a amostra para uma jarra inox de liquidificador, e então pesar o papel novamente. Anotar todos os pesos com 4 casas decimais; 3) Acrescentar 25 mL da solução de trabalho ao liquidificador com auxílio de uma proveta; 74
  75. 75. 4) Bater no liquidificador por 30 segundos em velocidade baixa. Isso deixará o queijo em uma fina suspensão, ficando somente partículas muito pequenas; 5) Colocar a mistura do liquidificador para filtrar na boca de um frasco Kjeldahl, utilizando papel Whatman 1. O filtrado será o extrato solúvel em acetato pH 4,6; 6) Acrescentar 25 mL da solução Working no liquidificador para lavagem das paredes, bater 30s e transferir p/ o papel de filtro; 7) Repetir passos 2 a 6 para a duplicata, utilizando um segundo copo de liquidificador; 8) Coletar todo o filtrado; 9) Depois que todo o filtrado for coletado, certificar-se de que ele esteja límpido. Se o filtrado estiver sem nenhuma partícula, acrescentar o catalisador e o ácido e seguir procedimento Kjeldahl; 10) Se o filtrado não estiver límpido, provavelmente o papel de filtro tenha furado. Substituir o papel de filtro e receber o filtrado em frasco limpo. NOTA: O filtrado obtido no item 8 pode ser recebido em um erlenmeyer de 125 mL e mantido refrigerado caso não haja espaço suficiente p/ os balões de Kjeldahl. Simplesmente substituir os frascos Kjeldahl citados anteriormente por erlenmeyers de 125 mL e mantê-los refrigerados até o momentos de colocá-los nos tubos de Kjeldahl. Transferir o filtrado para o tubo sem tocar as paredes. Enxaguar o erlenmeyer com 10 mL de água destilada e colocar a água de enxágüe também no tubo de Kjeldahl. Repetibilidade da determinação: O desvio máximo para esse método não pode exceder 0,2% em base protéica. Um queijo cheddar normal varia entre 1 a 8% de proteína solúvel. Para esse procedimento Kjeldahl, titular com HCl 0,01N. Quando os queijos amostrados forem mais velhos que 4 meses, titular com HCl 0,1N, já que a % de nitrogênio pode ser maior, e gastar mais de 50 mL de HCl 0,01N na titulação. Cálculos: Por exemplo: 75 % nitrogênio solúvel = ( )1,4007 amostra brancomlHCl mlHCl N HCl peso de amostra × − ×
  76. 76. Peso de papel + queijo = 1,1376 Peso papel após retirada do queijo = 0,3882 Peso do queijo = 0,7494 mL HCl da amostra = 26,4 mL HCl do branco = 1,0 N HCL = 0,01N % nitrogênio = ( ) %4748,0 7494,0 01,00,14,264007,1 = ×−× Valores corrigidos para recuperação de nitrogênio (descrito no procedimento p/ Kjeldahl): Fator de recuperação = 98,5% %nitrogênio solúvel = 0,4748% x 985 = 0,4820% %proteína solúvel = 0,4820 x 6,38 = 3,0607 As vezes é mais adequado expressar a % prot. solúvel como % total de proteína do queijo. Entretanto, se o queijo possuir uma % total de proteína de 25,00%, então a proteína solúvel como % da prot. total será: 100 (3,0607 / 25,00) = 12,24% Referência: Kjeldahl prodecures for determinations of milk total nitrogen for traditional Kjeldahl equipment – adaptação AOAC D.M. Barbano & Clark 6) DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO PELO MÉTODO KJELDAHL/PROTEÍNAS Introdução: As proteínas são determinadas avaliando-se o nitrogênio total da amostra pelo método Kejldahl. O termo proteína bruta (ou total) envolve um grande número de substâncias com estruturas semelhantes, porém com funções fisiológicas diferentes. Baseado no fato de as proteínas terem porcentagem de nitrogênio quase constante, em torno de 16%, o que se faz é determinar o nitrogênio e por meio de um fator de conversão 76
  77. 77. (fator geral = 6,25), que é calculado tomando-se como base o valor médio de 16% de teor de nitrogênio contido na maioria das substâncias, transformar o resultado em proteína bruta. No método Kjeldahl determina-se o nitrogênio contido na matéria orgânica, incluindo o nitrogênio protéico propriamente dito e outros compostos nitrogenados não protéicos, tais como: aminas, amidas, lectina, nitrilas, aminoácidos. Neste caso o resultado será dado como proteína bruta (ou total). Há uma pequena inexatidão no uso do fator 6,25 nos produtos complexos, visto que os componentes de formulações têm fatores de 5,71 para soja, 5,7 para trigo, 5,95 para o arroz, 6,38 para leite, etc. Dependendo da proporção, o uso do fator 6,25 poderá resultar num teor aumentado ou diminuído de proteína, entretanto, enquanto não houver acordo entre os pesquisadores o fator 6,25 continuará a ser usado para qualquer fórmula alimentar. Princípio: Proteínas e compostos nitrogenados decompostos na presença de H2SO4 concentrado a quente (sulfato de potássio aumenta o ponto de ebulição do ácido sulfúrico de 180ºC para 400ºC) produzem sulfato de amônio. O sulfato de amônio em presença de solução de hidróxido de sódio libera NH3 que é recebido na solução de ácido bórico. A amônia na solução de ácido bórico é titulada com solução de HCl com normalidade conhecida e assim determina-se o teor de nitrogênio na amostra. Para cálculo de proteína bruta basta multiplicar o resultado pelo fator geral (6,25) ou específico (leite, arroz, etc.). Reações básicas: - Digestão CuSO4 + R-CONH-R + H2SO4  (NH4)2 + NH4HSO4 + SO2 + CO2 + H2O + CuSO4 + K2SO4 - Destilação H3BO3  H2O + HBO2 + indicador (roxo) (NH4)2SO4 + NH4HSO4 + NaOH  NH3 + Na2SO4 + H2O NH3 + H2O + HBO2  NH4BO2 (verde + H2O) 77
  78. 78. - Titulação NH4BO2 + H2O + HCl  NH4Cl + H3BO3 (roxo) Materiais: • Tubo Macro para digestão de proteína (250 mL, 0=50x250mm); • Tubo semi-micro para digestão de proteína (100 mL, 0=25x250mm); • Tampas de condensação para tubos macro. Equipamentos: • Destilador de nitrogênio TE 036 Sarge (TECNAL); • Bloco digestor macro TE 015/50 Sarge (TECNAL); • Bloco digestor micro TE 040/25 Sarge (TECNAL); • Capela de exaustão. Reagentes: • Ácido sulfúrico p.a. (d=1,84 98%) • Solução de ácido bórico 2% com indicador misto • Mistura catalisadora • Hidróxido de sódio 50% • Solução de ácido clorídrico 0,02 ou 0,1 N Preparo de reagentes 1. Solução de NaOH 50% • Pesar 500g de NaOH e dissolver completamente para 1000 mL com água destilada livre de CO2; • Filtrar em lã de vidro e estocar em frasco plástico. 2. Solução de ácido bórico 2% (H3BO3) • Pesar 20g de ácido bórico e dissolver para aproximadamente 500 mL, acrescentar o indicador misto e completar para um litro com água destilada. 3. Indicador misto 78
  79. 79. • Solução de vermelho de metila 0,1% em etanol absoluto; • Solução verde de bromocresol 0,1% em etanol absoluto; • Adicionar por litro de H3BO3 2%, 5 mL de solução de vermelho de metila e 25 mL da solução verde de bromocresol e então completar o volume. Procedimentos: - Semi-micro Kjeldahl: • Pesar em tubo de digestão 1,5 g de catalisador, aproximadamente 0,2g de amostra (0,5 mL p/ leite) e anotar o peso da amostra. • Acrescentar 5 mL de ácido sulfúrico concentrado. - Macro-Kjeldahl: • Pesar em tubo de digestão 10g de catalisador, aproximadamente 1,5g de amostra, e anotar o peso da amostra. • Acrescentar 20 mL de ácido sulfúrico concentrado. • Passar os tubos para o bloco digestor; • Aquecer inicialmente a 50-100ºC e aumentar a temperatura de 50ºC a cada 30 minutos até atingir 350ºC, observando sempre o comportamento da amostra em função da sua composição; • OBS: Usar a tampa de condensação quando for utilizar macro-digestão; • Digerir até que o conteúdo dos tubos esteja transparente, de cor verde-azulado, e a partir daí aquecer mais 60 minutos; • Deixar esfriar os tubos e adicionar um pouco de água destilada com auxílio de uma pisseta, lavando as paredes do tubo; • Colocar o tubo já diluído no destilador, neutralizar com NaOH 50% (aparecimento de cor escura de óxido de cobre formado). Para o semi micro Kjeldahl gasta-se aproximadamente 25 mL de soda 50% e para o macro Kjeldahl gasta-se 60 mL. • Recolher o destilado em erlenmeyer com H3BO3 2% com indicador misto, utilizando 10 mL de ácido bórico para o semi-micro Kjeldahl e 20 mL de ácido bórico para o macro-Kjeldahl. 79
  80. 80. • Recolher 100-150 mL do destilado, dependendo do teor de nitrogênio na amostra. Titular o destilado usando HCl 0,02 ou 0,1N até que o indicador vire da cor azul para vinho, o que dá um pH ao redor de 4,5. Cálculo: % de NITROGÊNIO: .. 4008,1)()()( ap HClfcHClNHClmL ××× , onde p.a. é o peso da amostra. %Proteína total: %Nitrogênio x Fator de correção OBS: - Fator de conversão para proteínas (F) Geral ...6,25 Leite... 6,38 Soja ... 5,71 Trigo ... 5,70 Arroz ... 5,95 4. Mistura catalisadora Misturar 94g de K2SO4 + 5g de CuSO4 + 1g de selênio (opcional), homogeneizar bem. 5. HCl 0,02N padronizado • Medir 1,7 mL de HCl 37%, d=1,19 e completar para 1000 mL com água destilada livre de CO2. • Padronizar com Na2CO3 0,02N usando metil orange como indicador. • Determinar o fator de correção: Fc = ( ) N real Fc N teórica desejada • Solução de Na2CO3 0,02N: o Secar o carbonato de sódio a aproximadamente 200ºC por 1 hora. 80
  81. 81. o Colocar em dessecador, resfriar e pesar exatamente 1,06g do carbonato e dissolver em água completando para 1000 mL. • Indicador Metil Orange: o Dissolver 0,2g de alaranjado de metila em água quente e deixar esfriar, filtrar se necessário e completar o volume para 100 mL. o Usar 0,1 mL desse indicador por cada 10 mL da solução a titular. pH Cor 3,1 Levemente vermelho 4,4 Laranja-amarelado 6. Solução de HCl 0,1N padronizado • Medir 8,5 mL de HCl 37% d=1,19 e completar o volume para 1000 mL com água destilada livre de CO2. • Padronizar o HCl 0,1N com Na2CO3 0,1N usando metil orange como indicador. Solução de Na2CO3 0,1N. Secar o Na2CO3 a 200ºC por 1 hora. • Colocar em dessecador, resfriar e pesar exatamente 5,3g do sal e dissolver em água e completar a 1000 mL com águia destilada.  Diferença máxima entre duplicatas: 5mG N/100g ou 0,03% de proteína.  Amostras sólidas são homogêneas, portanto a quantidade de amostra a ser tomada é 0,2g. Entretanto, o leite é uma amostra líquida, portanto deve ser calculado um valor aproximado de amostra a ser tomada. Considerar uma titulação de 15 mL, que é um volume médio adequado para obter pouco erro. Considerar também pocentagem de proteína de 3%, que é a média do leite. Aplicar na fórmula tradicional, substituindo porcentagem de P por PA: PA = P NfcHClV % 38,6408,1)( ×××× Assim, obtem-se um valor aproximado de peso de amostra, de acordo com o teor de proteína existente.  Considerar o capítulo de informações sobre análises Kjeldahl antes de iniciar o trabalho. 81
  82. 82. Referências: • AOAC • Manual de Métodos Para Avaliação da Qualidade de Produtos Alimentares para Merenda Escolar. Outubro 1982 – Dr. Emílio S. Contreras Gusmão • Folheto técnico – Determinação de Nitrogênio – proteína – para laboratório de nutrição animal e humana; Empregando o Sistema TECNAL EQUIPAMENTOS PARA LABORATÓRIO LTDA • Metodologia utilizada pela equipe técnica de MULTIMIX – Produtos e Serviços Agropecuários Ltda. – Campinas –SP • Kjeldahl procedures for determination of milk total nitrogen for traditional Kjeldahl equipment. – adaptação AOAC / D.M. Barbano & J.L. Clark 82
  83. 83. DETERMINAÇÃO DE ÓLEO LIVRE EM QUEIJO MUSSARELA Formação de óleo livre em queijo é a tendência da gordura líquida em separar do queijo derretido e acumular na forma de “poças”, particularmente na superfície do queijo. No queijo mussarela, excesso de óleo livre é considerado um defeito grave que afeta a qualidade de pizzas e de produtos similares. Material: • Tubos de ensaio com rosca, diâmetro 15 mm, tamanho de 200 mm; • Butirômetros de Gerber; • Pipetas Pasteur ou conta gotas; • Sacos plásticos; • Pipetas de 10 mL; • Banho-maria a 60ºC; • Banho de água fervente; • Centrífuga de Gerber; • Liquidificador; • Balança analítica. Reagentes: • Água acidificada com HCl até pH 2,2; • Solução de água destilada + metanol 1:1; Procedimento: • Preparar a amostra da seguinte forma: moer em mixer a amostra em temperatura ambiente, até tamanhos menores que 5 mm. Colocar em sacos plásticos devidamente fechados e manter a amostra refrigerada a 4ºC por aproximadamente 2 horas, ou até a temperatura ficar constante. A análise deverá ser realizada no mesmo dia do preparo da amostra; • Pesar a 6 g de amostra com precisão de ± 0,001 g em tubo de rosca; • Colocar os tubos em água fervendo e deixa-los imersos por 4 minutos; 83

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