Proteção cruzada obtida em camundongos humanizados ceacam1

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Biotecnologia e Bioterismo

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Proteção cruzada obtida em camundongos humanizados ceacam1

  1. 1. PROTEÇÃO CRUZADA OBTIDA EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS CEACAM1 CONTRA Neisseria meningitidis ANA CLARA BARBOSA ANTONELLI ANGÉLICA DE LIMA DAS CHAGAS BRUNA AMANDA DA CRUZ RATTIS BRUNA LIMA PEROBELLI CASSIO NAZARENO SILVA DA SILVA CRIS HANNY PIRES ARAUJO GISELLA MATTOS DA SILVA WHITE GUSTAVO DO CARMO LEMES IGOR DANIEL ALVES RIBEIRO JOÃO LUCAS LIMA CALANDRINI DE AZEVEDO JOÃO VICTOR BATALHA DE CARVALHO
  2. 2. Introdução • Uso de modelos animais em pesquisas para o tratamento de doenças humanas • ↓utilização de pessoas para testes • Dificuldade de tratamento -estágio avançado da doença
  3. 3. Camundongos transgênicos • Organismos artificialmente manipulados • Introdução, modificação ou deleção de um gene • Transmitida aos seus descendentes • Podem ser classificados em diferentes tipos de animais: • Transgênicos por adição • Modelos knockout (gene inativado) • Modelos knockin (gene previamente modificado ou substituído) Introdução
  4. 4. Obtenção dos camundongos transgênicos Ovos fertilizados Microinjeção em pronúcleos do DNA modificado Transferência de embriões em fêmeas pseudográvidas (fêmeas recipientes) Análise da atividade da manipulação do gen nos embriões F0 F1 Camundongo selvagem Teste da atividade de transmissão e transgênese T Através da biopsia se analisa o DNA para identificação do animal transgênico fundador Fêmea doadora superovulada Introdução BENAVIDES,FernandoJ;GUÉNET,Jean-Louis.ManualdeGenéticadeRoedoresdeLaboratorio,PrincipiosBásicosy Aplicaciones.(2003).Cap.Latransgénesisylaclonaciónenlosroedoresdelaboratorio,p:227-262.
  5. 5. Camundongos humanizados • Genes humanos • Resposta imune igual ou muito semelhante a dos seres humanos Introdução Promotor Transgene Seqüência de secreção Seqüência do vetor Marcador Origem de replicação
  6. 6. Meningite Introdução
  7. 7. • Evolui em três etapas: nasofaríngea, septicêmica ou meningococcêmica e meningítica • Fase nasofaríngea : pouco sintomática .Os sinais gerais são: febre, mal-estar, falta de apetite, náuseas e vômitos • Fase septicêmica ou miningococcêmica: caracteriza-se pelo aparecimento de febre, calafrios, dores musculares e toxemia. Geralmente, aparecem lesões cutâneas purpúricas. • Fase meningítica: ocorre inflamação das meninges, com fortes dores de cabeça, dores no pescoço e nas costas, rigidez na nuca, confusão mental, etc. Introdução
  8. 8. Neisseria meningitidis • Bactéria • Diplococo gram-negativo • Classificada em sorogrupos de acordo com a reatividade imunológica dos polissacarídeos presentes na cápsula (A, B, C, Y e W-135) • Sorogrupos B e C os principais no Brasil • Compõe a microbiota das vias respiratórias superiores • 10% da população em geral carrega essa bactéria em suas gargantas Introdução
  9. 9. Introdução • Vacinação – método mais viável • Dificuldade no tratamento dos pacientes em estágio avançado • Portadores do Nme: montam uma boa resposta imune humoral mas continuam sendo colonizados O QUE ESTÁ ACONTECENDO?
  10. 10. O QUE ESTÁ ACONTECENDO? • Objetivos: Investigar as respostas imunológicas e saídas para esse problema COMO? • Uso de camundongo humanizado por transgenia visando a colonização da nasofaringe desses animais por Nme cuja especificidade é dirigida para os humanos Introdução
  11. 11. • Camundongos expressando a molécula de adesão celular humana -CEACAM1 • Permitiu diferenciar a resposta envolvendo anticorpos contra as distintas cepas de Nme e as suas relações com a infecção pela mucosa nasofaríngea Introdução
  12. 12. Bactérias utilizadas • 57 isolados de bactérias • Sendo 43 da espécie Neisseria meningitidis • 2 Neisseria gonorrhoeae • 2 Neisseria lactamica • 1 Neisseria cinerea • 1 Neisseria flavenscens • 1 Moraxella catatthalis • 2 non-typeable Haemophilus influenzae • 5 Escherichia coli Materiais e métodos
  13. 13. Inóculos obtidos por ressuspensão das colônias em 1 ml de PBS +1 mM MgCl (PBS/Mg), ajustado para 107 CFU/mL Adicionou-se 32 mg/ml da glicoproteína "human holo- transferrin" Foi inoculado 10 µL (105 CFU) em camundongos CEACAM1 humanizados de seis semanas de idade por via intranasal *anestésico isoflurano Materiais e métodos Infecção intranasal
  14. 14. Infecção intranasal • Monitoramento da resposta imune reinfecção • Os camundongos receberam uma dose da cepa de N.meningitidis (6 e 9 semanas de idade) • Com doze semanas, cada camundongo foi desafiado com um isolado diferente • Eutanasiados em câmaras de CO2 Materiais e métodos
  15. 15. Coleta dos tecidos da mucosa e submucosa- procura por N. meningitidis associado a eles Lavagem da traqueia com 500 µL de PBS/Mg - obter o lavado nasal Esfregaço da mucosa-ressuspendido em 500 µL de PBS/Mg Materiais e métodos Infecção intranasal
  16. 16. Materiais e métodos • ELISA com células totais para a detecção de imunoglobulinas específicas; • Ensaio de anticorpos bactericidas séricos (SBA); • Werstern blotting para detecção da Opa e PorA e PorB;
  17. 17. • Camundongos CEACAM1 humanizados podem ser colonizados por cepas de diferentes sorotipos de N. menigitidis ??? Resultados e discussões
  18. 18. • Recuperação N. menigitidis viáveis da cavidade nasal de camundongos humanizados CEACAM1 após 3 dias da inoculação com cepas de diferentes sorogrupos Sorogrupo A Fonte: JOHSWICH et al., 2014 Resultados e discussões
  19. 19. Sorogrupo C Colonização de camundongos humanizados com cepas de N. menigitidis do sorogrupo C Fonte: JOHSWICH et al., 2014 Resultados e discussões
  20. 20. Sorogrupo B Fonte: JOHSWICH et al., 2014 Resultados e discussões
  21. 21. Western Blot para detecção de proteína OPA em cepas de N.menigitidis. Fonte: JOHSWICH et al., 2014 Proteína Opa não expressa em B16B6 – Uma cepa que apresentou baixas taxas de colonização em camundongos CEACAM1 humanizados
  22. 22. • Anticorpos produzidos em uma infecção por determinada cepa de N. menigitidis possui reação cruzada para demais estirpes ??? Resultados e discussões
  23. 23. • determinar a reatividade cruzada de anticorpos induzidos pelas cepas H44/76 ou 90/18311 para diferentes cepas • as duas cepas inoculadas para indução de anticorpos são bastante heterólogas. Resultados e discussões
  24. 24. Demonstra-se que a colonização nasal por N. meningitidis em camundongos CEACAM1 humanizados induz a produção de anticorpos ( IgG ) específicos para a cepa inoculada. Resultados e discussões
  25. 25. • Considerando relatos de seu potêncial imunogênico , como é a expressão de Porinas A e Porinas B nas diferentes cepas de N. meningitidis ? Porina B ( Por B) é amplamente expressa em diferentes cepas A expressão de Porina A ( Por A ) está concentrada entre as cepas que apresentam maior homologia a H44/76 Fonte: JOHSWICH et al., 2014 Resultados e discussões
  26. 26. A proteína Opa é um antígeno importante para ligação de anticorpos gerados contra N. meningitidis ? Fonte: JOHSWICH et al., 2014 Efeito da expressão da proteína Opa e cápsula em reação cruzada H44/76∆opa : Cepa modificada para não expressar a proteína Opa MC58∆siaD: Variedade mutante para a capsúla
  27. 27. • A infecção intranasal de camundongos humanizados CEACAM1 influencia na colonização nasal posterior por outras cepas ? 6 Sem. 9 Sem. Fonte: JOHSWICH et al., 2014
  28. 28. Não recuperação de Bactérias após de 3 dias de inoculação em animais préviamente infectados Resultados e discussões Fonte: JOHSWICH et al., 2014
  29. 29. Níveis de anticorpos específicos para cepa 90/18311 durante o curso da infecção Fonte: JOHSWICH et al., 2014
  30. 30. Títulos de anticorpos específicos para diferentes cepas Resultados e discussões Fonte: JOHSWICH et al., 2014
  31. 31. • Como é a atividade de Anticorpos Bactericidas Séricos (SBA ) em camundongos infectados com diferentes cepas ? • Qual a influência do crescimento bacteriano em um meio com níveis limitantes de Ferro ? Resultados e discussões
  32. 32. Fonte: JOHSWICH et al., 2014 Resultados e discussões
  33. 33. Obrigado!!
  34. 34. • BENAVIDES, Fernando J; GUÉNET, Jean-Louis. Manual de Genética de Roedores de Laboratorio, Principios Básicos y Aplicaciones. (2003). Cap. La transgénesis y la clonación en los roedores de laboratorio, p: 227-262. • JOHSWICH et al. Sterilizing elicited by Neisseria meningitidis carriage shows broader protection than predicted by serum antibody cross-reactivity in CEACAM1-humanized mice. Infection and Immunity. American Society for Microbiology, 2014. • MCENERY, Regina. Boletim sobre a pesquisa de vacinas contra a aids. VAX, v.10,n. 5, 2012. • MINISTÉRIO DA SAÚDE. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/index. php/o- ministerio/principal/leia-mais-o-ministerio/659-secretaria-svs/vigilancia-de-a-a- z/meningites/11336-descricao-da-doenca. Acessado: 16. Nov 2014. • MORALES, Marcelo M.. Métodos alternativos à utilização de animais em pesquisa científica: mito ou realidade?. Cienc. Cult., São Paulo, v. 60, n. 2, 2008 . Disponível em: <http://cienciaecultura.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0009- 67252008000200015&lng=en&nrm=iso>. Acessado: 16 Nov. 2014. • NEVES, Silvânia M.P. Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratório do Biotério de Produção e Experimentação da FCF-IQ/USP. São Paulo FCF-IQ/USP, 2013. Referências

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