J.C. Menezes, T.P. Alves, J.P. Cardoso, “Biotecnologia Microbiana: A Produção de Penicilina”, cap. 12, 15 pp. in“Biotecnol...
12.2 A DESCOBERTA E A PRODUÇÃO INDUSTRIAL
DE PENICILINA
Muitas descobertas científicas importantes são acidentais. A ocorr...
Depois da penicilina, descobriram-se mais de 8.000 antibióticos, sendo hoje em dia produzidos
industrialmente cerca de 170...
Radical R Penicilina Correspondente
(nome usual)
CH2
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(Penicilina G)
CH3CH2CH = CHCH2 2 Pentenilpenicilina...
12.4.2 - Penicilina V (Fenoximetil Penicilina)
Fórmula Bruta (ácido) C16H18N2O5S (PM 350,4) CAS 87-08-1
Fórmula Bruta (Sal...
Cada radical R usado dá origem a uma dada penicilina semi-sintética:
CHCH OH
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Penicilina V Cefaclor
Penicilina V Cefroxadina
12.5 A FERMENTAÇÃO DE PENICILINAS
Quer a penicilina G quer a penicilina V s...
Durante a fermentação, o pH e a T são mantidos constantes (6,5 e 25-27ºC, respectivamente) e a
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processadas através das vias metabólicas do P. chrysogenum para que se atinjam títulos de
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Produção de Penicilina

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  1. 1. J.C. Menezes, T.P. Alves, J.P. Cardoso, “Biotecnologia Microbiana: A Produção de Penicilina”, cap. 12, 15 pp. in“Biotecnologia: Fundamentos e Aplicações”, N. Lima e M. Mota (eds.), DIFEL, 2000. 12 - Biotecnologia Microbiana: A Produção de Penicilina José C. Menezes1,3 , Teresa P. Alves4 , Joaquim P. Cardoso2,3,4 1 Professor Auxiliar, IST 2 Professor Catedrático, IST 3 Departamento de Engenharia Química Centro de Engenharia Biológica e Química, Instituto Superior Técnico, Av. Rovisco Pais, P-1049-001 Lisboa, Portugal; telefone: 218 417 347; fax: 218 419 062; e-mail: cardoso.menezes@ist.utl.pt 4 Administrador, PhD Companhia Industrial Produtora de Antibióticos, CIPAN, S.A., Vala-do-Carregado, P-2601-906 Castanheira do Ribatejo, Portugal. telefone: 263 856 800; fax: 263 855 086; e-mail: ta.cipan@mail.telepac.pt SUMÁRIO A descoberta e produção em massa de medicamentos capazes de combater doenças infecciosas constitui uma das maiores realizações da humanidade. A introdução dos antibióticos em medicina marcou o início de uma era em que doenças mortais passaram a ter cura, originando um aumento de longevidade estimado em 10 anos nos países industrializados. Neste capítulo revê-se a descoberta da penicilina e a forma como é hoje em dia produzida industrialmente. Discute-se a sua produção por fermentação, a extracção dos caldos fermentados e a obtenção de produtos de maior eficácia terapêutica por modificação química da penicilina. Passados mais de meio século do início da produção industrial de penicilina, subsistem ainda problemas fundamentais por resolver neste processo. Põe-se ainda em evidência o facto dos métodos utilizados na solução dos problemas de engenharia bioquímica encontrados na produção industrial de penicilina se terem constituído em paradigma na investigação e desenvolvimento da generalidade dos processos de produção dos antibióticos actualmente comercializados. 12.1 INTRODUÇÃO A indústria farmacêutica de produção de antibióticos por fermentação nasceu há ca. de 60 anos com a produção de penicilina, sendo frequentemente utilizada como exemplo de uma biotecnologia estabelecida [1]. No entanto, apesar da escala a que se produz penicilina, da sua importância comercial e de ser o antibiótico produzido há mais tempo por fermentação, o conhecimento existente sobre o microrganismo e o processo de fermentação é insuficiente para que seja possível i) por modificação genética dos mecanismos de controlo metabólico a acentuação de determinadas características de uma estirpe (e.g., produtividade) ou ii) a formulação a priori de meios e condições de cultura mais adequadas a dada estirpe. A produção de penicilina é realizada por fermentação com um fungo, o Penicillium chrysogenum, não existindo processos químicos alternativos economicamente viáveis. A partir da penicilina isolada dos caldos fermentados podem ser sintetizados diversos antibióticos com um valor terapêutico e comercial significativamente superior. Neste capítulo revêm-se sumariamente estes processos e utilizações.
  2. 2. 12.2 A DESCOBERTA E A PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE PENICILINA Muitas descobertas científicas importantes são acidentais. A ocorrência de factores experimentais desconhecidos ou não-controlados, com um resultado que é notado mas só depois entendido, é responsável por descobertas que mudaram a história. A descoberta da penicilina pelo escocês SIR ALEXANDER FLEMING em 1928 é um bom exemplo [2]. As razões que explicam que os antibióticos não tenham sido descobertos no século XIX persistiam no tempo de FLEMING - pex. a inexistência de métodos cromatográficos e espectrofotométricos adequados à caracterização e isolamento de um composto com a instabilidade química e térmica da penicilina em solução - a tal ponto que o feito extraordinário da descoberta da penicilina não teve nos anos seguintes grande evolução [3]. A importância estratégica da penicilina na Segunda Guerra Mundial fez com que CHAIN e FLOREY, a trabalharem na aplicação clínica da penicilina desde 1938, constassem de mandatos de captura alemães em 1940. A precariedade do Reino Unido no início da guerra obrigou FLOREY a interromper o trabalho em LONDRES sobre a penicilina e a procurar em 1941 nos EUA o apoio necessário para a produção em larga escala. Apesar da guerra, o trabalho do grupo de CHAIN e FLOREY tornou-se conhecido em todo o mundo, originando investigação independente sobre a penicilina em vários países. A Holanda, onde a investigação se fez clandestinamente devido à ocupação, e a Espanha, devastada pela guerra civil, tornaram-se mais tarde em grandes produtores mundiais de penicilina [2]. Pelo seu trabalho sobre a penicilina FLEMING, CHAIN e FLOREY receberam em 1945 o prémio Nobel da medicina. 12.3 O PARADIGMA DA PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE PENICILINA A quantidade de penicilina fabricada nos EUA na primeira metade da década de 40, praticamente o único produtor neste período, aumentou mais de 5 ordens de grandeza com o programa concertado de investigação e desenvolvimento lançado pelo governo americano durante a guerra, atingindo-se na altura do desembarque na Normandia uma produção anual suficiente para as necessidades militares dos aliados (Fig. 12.1). FROM ORDINARY MOLD - the Greatest Healing Agent of this War ° ° ° ° anúncio na revista LIFE de 14 de Agostode 1944 FROM ORDINARY MOLD - the Greatest Healing Agent of this War ° ° ° ° FROM ORDINARY MOLD - the Greatest Healing Agent of this War ° ° ° ° anúncio na revista LIFE de 14 de Agostode 1944 Figura 12.1 - Propaganda à penicilina durante a Segunda Guerra Mundial. Desde então a produção mundial tem aumentado, embora a uma taxa inferior, sendo actualmente superior a 20.000 ton/ano. Se se considerar a dosagem típica por tratamento (ca. 1 a 10 g/paciente), a capacidade terapêutica possível com a quantidade de penicilina produzida em todo o mundo é de de 2 a 20 mil milhões de pacientes tratados/ano, ou seja, da ordem do número de habitantes da Terra, números impensáveis há 50 anos.
  3. 3. Depois da penicilina, descobriram-se mais de 8.000 antibióticos, sendo hoje em dia produzidos industrialmente cerca de 170 antibióticos por fermentação e posterior modificação química [4]. O desenvolvimento dos processos de fabrico de todos estes antibióticos seguiu as mesmas etapas da produção de penicilina, estabelecendo-se como paradigma da investigação e desenvolvimento de processos industriais de fermentação e da própria engenharia bioquímica: • selecção de estirpes • optimização à escala laboratorial das condições de fermentação • teste em instalações piloto • solução empírica de problemas de aumento de escala • caracterização química e estrutural do composto activo • modificação química do composto activo • teste de formulações em animais e seres humanos • produção industrial do antibiótico A adopção no desenvolvimento e aumento de escala da maioria dos processos farmacêuticos de fermentação de métodos empíricos de tentativa e erro, é justificada pela sua complexidade bioquímica e a persistência de problemas fundamentais nestes processos, como se verá adiante [5]. 12.4 AS PRINCIPAIS PENICILINAS E DERIVADOS A composição de todas as penicilinas apresenta um núcleo comum de acordo com a fórmula N COOH O S HNCOR CH3 CH3 O núcleo comum a todas as penicilinas é o ácido 6-amino penicilânico (6-APA) que embora seja biológicamente inactivo é o responsável pela actividade de todas as penicilinas. A sua estrutura N COOH O S CH3 CH3 (1) (2) H2N contém 1 anel de 4 membros (1) chamado beta-lactâmico e um anel de 5 membros (2) denominado anel tiazolidinico. A existência do anel beta-lactâmico em todas as penicilinas naturais ou semi- sintéticas é responsável pela designação geral destes antibióticos de antibióticos beta-lactâmicos. O Radical R dá o nome à penicilina respectiva de acordo com a Tabela 12.1. A estirpe original usada para a produção de penicilina na ausência de precursor produzia misturas das 6 primeiras penicilinas listadas na Tabela 2.1 [6]. Os estudos sobre a elucidação da estrutura da penicilina, contudo, levaram ao estabelecimento que a produção de uma dada penicilina requeria o fornecimento, normalmente em fed-batch, da cadeia lateral respectiva. Das penicilinas atrás apresentadas as únicas com interesse industrial e económico, actualmente, são a penicilina G (benzilpenicilina) e a penicilina V (fenoximetilpenicilina), com uma produção e valor de mercado de cerca de 20.000 ton/ano e 600 milhões USD (preços correntes a granel). A obtenção de uma dada penicilina está como se disse relacionada com o fornecimento da cadeia lateral durante a fermentação. Assim o fornecimento de sais de ácido fenil acético (AFA) leva à formação exclusiva de penicilina G enquanto que o fornecimento de sais de ácido fenoxi acético (AFNA) leva à formação exclusiva de penicilina V. As principais propriedades e usos destas duas penicilinas são descritas a seguir [7].
  4. 4. Radical R Penicilina Correspondente (nome usual) CH2 Benzilpenicilina (Penicilina G) CH3CH2CH = CHCH2 2 Pentenilpenicilina (Penicilina F) CH3CH = CHCH2CH2 3 Pentenilpenicilina CH3 (CH2)4 n-Amilpenicilina (Dihidropenicilina F) CH3 (CH2)6 n-Heptilpenicilina (Penicilina K) CH2HO p-Hidroximetilpenicilina (Penicilina X) OCH2 Fenoximetilpenicilina (Penicilina V) Tabela 12.1 – As penicilinas mais comuns. 12.4.1 - Penicilina G (Benzil Penicilina) Fórmula Bruta (ácido) C16H18N2O4S (PM 344,4) CAS 61-33-6 Fórmula Bruta (Sal de Potássio) C16H17N2O4SK (PM 372,5) CAS 113-98-4 12.4.1.1 - PROPRIEDADES FÍSICAS (SAL DE POTÁSSIO) Sólido cristalino branco, sem cheiro quando puro, solúvel em água, higroscópico, instável a ácidos e alcalis. Ponto de fusão 215°C com decomposição. Uma miligrama de penicilina G potássica é equivalente a 1.595 unidades (Oxford units). 12.4.1.2 – FÓRMULA N S CO2X CH3 CH3 O CH2CONH 12.4.1.3 - UTILIDADE Matéria prima para as sínteses de 6-APA, 7-ADCA penicilamina e outros derivados. Substância terapêutica em medicina humana e veterinária. Altamente activa contra bactérias Gram positivas sensíveis à penicilina por exemplo Streptococcus pyogenes e cocci Gram negativos, também activa contra Bacillus anthracis, Treponema pallidum e outras bactérias. É geralmente administrada por injecção. É utilizada como promotor de crescimento em feed aditivos para porcos e galinhas. 12.4.1.4 –FORMAS COMERCIAIS MAIS IMPORTANTES E SUA QUALIDADE Sal de potássio; crude, Pharm. Eur., USP, estéril. Sal de sódio; Pharm. Eur., USP, estéril. Sal de Procaína; feed grade, Pharm. Eur., USP, estéril. Sal de Benzatina; Pharm. Eur., USP, estéril e não estéril. Misturas e formulação de todos os sais acima. X = H benzylpenicilina X = K sal de potássio
  5. 5. 12.4.2 - Penicilina V (Fenoximetil Penicilina) Fórmula Bruta (ácido) C16H18N2O5S (PM 350,4) CAS 87-08-1 Fórmula Bruta (Sal de Potássio) C16H17N2O5SK (PM 388,5) CAS 132-98-9 12.4.2.1 - PROPRIEDADES FÍSICAS (SAL DE POTÁSSIO) Sólido cristalino branco, sem cheiro quando puro, solúvel em água, higroscópico, instável a alcalis, moderadamente estável ao ácido do estomago. Ponto de Fusão 200 - 210°C com decomposição. Uma miligrama de penicilina V potássica é equivalente a 1.670 unidades. 12.4.2.2 – FÓRMULA N S CO2X CH3 CH3 O OCH2CONH 12.4.2.3 - UTILIDADE Matéria prima para as sínteses de 6-APA, 7-ADCA, cefaclor e outros derivados. Substância terapêutica oralmente activa contra bactérias Gram positivas sensíveis à penicilina por exemplo Streptococcus pyogenes e cocci Gram negativos. É menos activa em geral que a penicilina G mas é uma terapia efectiva quando os microrganismos lhe são sensíveis. 12.4.2.4 –FORMAS COMERCIAIS MAIS IMPORTANTES E SUA QUALIDADE Sal de Potássio; crude, Pharm. Eur., USP. 12.4.3 – Penicilinas Semi-Sintéticas e Derivados Como se viu o núcleo activo de todas as penicilinas é o ácido 6-aminopenicilânico ou abreviadamente 6-APA. Este composto biologicamente inactivo foi primeiramente detectado em fermentações de penicilina onde era inexistente a presença de cadeias laterais (precursor) para formar a molécula de penicilina. Na produção de penicilinas semi-sintéticas o núcleo activo da penicilina, 6-APA, é acilado por condensação com vários compostos cada contendo um radical que dá origem à penicilina semi-sintética particular. 12.4.3.1 - PRODUÇÃO DE PENICILINAS SEMI-SINTÉTICAS Após as experiências falhadas de obter o 6-APA por métodos biológicos foi desenvolvido pela Gist Brocades um método químico de alto rendimento que posteriormente foi adoptado pelos vários produtores de 6-APA. Este método químico recorria ao uso de compostos muito tóxicos e corrosivos e utilizava temperaturas extremamente baixas da ordem dos - 30 a - 40°C [8]. Posteriormente foi desenvolvido o método enzimático com enzimas imobilizadas de produção de 6-APA quer a partir da penicilina G quer a partir da penicilina V devido ás vantagens do método enzimático sobre o método químico – mais económico e muito menos poluente [8]. Actualmente praticamente todos os produtores de 6-APA usam o método enzimático usando enzimas imobilizadas. A penicilina G é hidrolisada a 6-APA pela enzima penicilina G acilase enquanto que a penicilina V é hidrolisada a 6-APA pela enzima penicilina V acilase. A produção de penicilinas semisintéticas pode ser visualizada no seguinte esquema reaccional simplificado [9]: N S CO2H CH3 CH3 N S CO2H CH3 CH3 O NH2 O +ClR HNR Agente Acilante 6 - APA Penicilina semi-sintética forma ácida X = H; sal de potássio X = K
  6. 6. Cada radical R usado dá origem a uma dada penicilina semi-sintética: CHCH OH NH2 C O C ONH2 Penicilina Ampicilina Amoxicilina Semi-Sintética As penicilinas semi-sintéticas são antibióticos de largo espectro e resistentes a pH baixo podendo ser tomadas oralmente. Contudo, não são resistentes a beta-lactamases. 12.4.3.2 - PRODUÇÃO DE DESACETOXICEFALOSPORINAS Actualmente existem no mercado três desacetoxicefalosporinas semi-sintéticas também chamadas cefalosporinas orais nomeadamente cefalexina, cefradina e cefadroxil. São antibióticos de largo espectro resistentes a pH baixo e com alguma resistência a beta-lactamases. Estas cefalosporinas obtêm-se pela condensação de compostos adequados com um derivado da penicilina (G ou V) o ácido 7 aminodesacetoxicefalosporânico ou 7-ADCA. Existem duas possibilidades para a produção do 7-ADCA: a) método exclusivamente de síntese química e b) método misto onde a hidrólise da chamada Cefalosporina G (Ácido 7 fenil acetamido desacetoxicefalosporânico) é feita enzimaticamente usando a mesma enzima que hidrolisa a penicilina G a 6-APA [10]. A produção de cefalosporinas orais pode ser visualizada no seguinte esquema reaccional simplificado [11]: Agente Acilante 7-ADCA Cefalosporina Oral Cada radical R usado dá origem a uma dada desacetoxicefalosporina semi-sintética ou cefalosporina oral: CHCH NH2 C O C ONH2 CH C ONH2 HO Cefalosporina Oral Cefalexina Cefradina Cefadroxil 12.4.3.3 - PRODUÇÃO DE CEFACLOR E CEFROXADINA O cefaclor e a cefroxadina são importantes fármacos produzido por complexos processos de síntese química a partir da penicilina V. São antibióticos de largo espectro resistentes a pH baixo e com alguma resistência a beta-lactamases. Estruturalmente o Cefaclor é muito semelhante à cefalexina com a diferença que no cefaclor na posição 3 existe um átomo de cloro em vez de um grupo CH3. A cefroxadina é semelhante à Cefradina com a diferença que na posição 3 existe um grupo OCH3 em vez de um grupo CH3. Simplificadamente pode representar-se a síntese do cefaclor e da cefroxadina pelos esquemas [11] abaixo: Radical R Radical R vários passos de síntese orgânica
  7. 7. Penicilina V Cefaclor Penicilina V Cefroxadina 12.5 A FERMENTAÇÃO DE PENICILINAS Quer a penicilina G quer a penicilina V são produzidas industrialmente do mesmo modo em reactores agitados, com arejamento, operados em fed-batch (i.e., alimentação contínua de várias substâncias a uma fermentação descontínua). Este modo de operação permite um melhor controlo das condições de fermentação do que os modos contínuo ou descontínuo, conseguindo-se com a adição controlada de um açúcar facilmente metabolizável manter na fase de produção uma actividade catabólica adequada à fermentação da penicilina. A operação fed-batch permite manter ao mesmo tempo as condições de fermentação em estado quase-estacionário e a cultura em estado transiente (i.e., viável), sendo indispensável a uma boa produção de antibiótico, dado que permite: 1. operar o fermentador entre os limites superior e inferior de actividade catabólica (e.g., evitando a repressão catabólica) 2. operar abaixo dos níveis de inibição/toxicidade por substâncias essenciais à biossíntese (e.g., fonte-N e precursor) 3. reduzir a duração da fase de crescimento (acelerando o crescimento) 4. prolongar a duração da fermentação (manter a biomassa viável mais tempo) 5. operar a concentrações de biomassa elevadas e constantes (i.e., utilizar eficientemente a biomassa produzida) 6. repôr a água evaporada com o arejamento da cultura (contrariando o aumento de viscosidade do caldo e a consequente co-limitação pelo O2 ) A preparação do inóculo para a fermentação começa com a inoculação de balões de 500 ml, contendo 100 ml de meio de cultura, com espóros de P. chrysogenum. Os balões são em seguida colocados num agitador orbital, numa câmara a 25ºC e após 4 dias o caldo de cultura resultante é utilizado para inocular balões contendo 2 l de meio. O caldo desta segunda etapa em balões é utilizado como inóculo para nova fermentação vegetativa, com a duração de apenas 2 dias, num tanque de 100 l com agitação, arejamento, arrefecimento e controlo de pH e T. Por fim, num tanque com 500 l de meio, produz-se, após 3 dias, um volume de cultura suficiente para inocular até 120 m 3 de meio em tanques com 200 m 3 de capacidade [12]. Os meios de cultura industriais são formulados com matérias primas fontes de C & N a maioria das quais são complexas em termos de composição química (e.g., água da maceração de milho, melaços, óleos vegetais ou gorduras animais). Após a inoculação do meio segue-se um curto período de operação descontínua (ca. 12 h). Em seguida e até ao fim da fermentação são adici- onadas diversas substâncias (viz., açúcar, AFA ou AFNA, sais, óleos, gorduras, correctores de pH). A regulação das adições ao longo da fermentação (ca. 180 a 220 h) depende da estirpe utilizada. Por exemplo, a adição de açúcar faz-se normalmente com um xarope de glucose ou sacarose (30- 50%) com um caudal decrescente durante a fermentação (de 2,0 a 1,0 kg/m 3 /h). Os perfis de alimentação utilizados industrialmente têm, segundo alguns dos maiores produtores mundiais (e.g., GIST-BROCADES e NOVO-NORDISK), como principal objectivo reduzir ao mínimo a lise da cultura, mantendo constante a concentração de biomassa na fase de produção. Assim, a taxa de adição é mantida dentro de bandas nominais de operação que correspondem a partir do terceiro dia de fermentação a caudais aproximadamente constantes. vários passos de síntese orgânica
  8. 8. Durante a fermentação, o pH e a T são mantidos constantes (6,5 e 25-27ºC, respectivamente) e a condução do processo é quase exclusivamente manual com procedimentos estabelecidos empiricamente para a estirpe utilizada. A velocidade de arejamento está normalmente entre 0,5 e 1,0 m 3 de ar / m 3 de meio/min (vvm), dependendo da estirpe, fermentador e velocidade de agitação (viz., 120-150 rpm). Tratando-se de um microorganismio filamentoso, para evitar problemas de dispersão de oxigénio no meio, procura-se com uma formulação adequada do meio de cultura e das condições operatórias, obter à escala de produção uma morfologia de pellets pequenos e pouco compactos, com menores viscosidades e maiores produtividades do que a morfologia filamentosa. Na produção industrial de penicilina (G ou V) são utilizadas duas estratégias de condução da fermentação no que respeita à evolução do volume de meio dentro do fermentador. Devido à adição de nutrientes durante a fermentação o volume dentro do fermentador vai aumentar desde o início até ao fim da fermentação. Uma das estratégias consiste em fazer periodicamente descargas parciais do meio fermentado que irão ser processadas juntamente com a descarga final do fermentador. A outra estratégia consiste em iniciar a fermentação com um volume tal que no fim da mesma é atingido o volume máximo do fermentador, não havendo assim descargas parciais. A primeira estratégia implica ,menos investimento de capital para a mesma capacidade de produção. Na Figura 12.2 apresentam-se os perfis de concentração típicos das espécies mais importantes numa fermentação semi-descontínua de penicilina G, com meios complexos [12;13]. concentrações (u.a.) oxigénio dissolvido pH N-amoniacal açúcares redutores biomassa penicilina t (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 100 80 60 40 20 0 Figura 12.2 - Perfis de concentração principais das espécies numa fermentação semi-descontínua de penicilina G (adaptado de [13]). Os valores para as concentrações no caldo durante a fermentação são tipicamente: X=1-40 g-DMW/l, PENG=0-50 g-PENG/l, O2=100-50%sat., açúcares redutores=20- 0,5 g-glucose/l, N=0,80-0,25 g-NH3/l, pH ≈ 6,5. As taxas específicas de consumo dos substratos determinadas por [13] em cultura contínua (µ=0,015 h-1) podem ser usadas para calcular os caudais alimentados à fermentação fed-batch (mg/g-DMW/h): C (glucose)=60, O2=40-50, N (amónia)=2,0, P (fosfato)=0,6, S (sulfato)=2,8, precursor (AFA)=1,8. 12.5.1 - Metabolismo Primário As estirpes industriais consomem simultânea ou consecutivamente as diversas fontes de C & N presentes nos meios industriais, os quais contêm açúcares, lípidos, ácidos orgânicos e aminoácidos, de acordo as vias metabólicas conhecidas, mas evidenciando mecanismos de regulação complexos e muito pouco estudados nestas estirpes (Quadro 12.1) [14]. 12.5.2 - Metabolismo Secundário A quantidade de penicilina G (ou V) produzida por estirpes de productividade elevada é da mesma ordem da concentração de biomassa (como peso seco) no fim de uma fermentação - i.e., 50 g-PENG/l-caldo. Podem imaginar-se as quantidades de nutrientes e precursores (e.g., AA)
  9. 9. processadas através das vias metabólicas do P. chrysogenum para que se atinjam títulos de penicilina desta ordem. A biosíntese da penicilina-G semelhantemente à da penicilina V envolve a condensação do ácido α-aminoadípico (α-AAA), da cisteína (CYS) e da valina (VAL), num tripéptido, o δ -(α-aminoadipil) cisteinilvalina (ACV). Em seguida, o tripéptido é ciclizado formando-se a isopenicilina-N (IPN) - o primeiro composto com actividade antibiótica do metabolismo. No passo seguinte, a cadeia α- aminoadipato é permutada por fenilacetato, produzindo-se a penicilina G (Quadro 12.2). • O catabolismo de hexoses (conversão de compostos C6 em C3) é realizado no P. chrysogenum por duas vias concorrentes, mas com algumas semelhanças nomeadamente porque terminam ambas em piruvato. O catabolismo destes ácidos carboxílicos prossegue com a conversão em acetato e oxidação completa deste a CO2 no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Devido à oxidação incompleta de hexoses podem acumular-se no microrganismo vários intermediários do catabolismo como ácidos orgânicos de C2 (e.g., acetato) a C6 (e.g., gluconato). • O catabolismo de lípidos (ácidos gordos) necessita de ATP e acetil~S-CoA, convertendo-se por passos o ácido de cadeia longa em diversas moléculas de acetil~S-CoA. A acetil~S-CoA pode depois, via ciclo do TCA, ser convertida em ATP gerando uma quantidade significativa de energia. A desregulação do ciclo do TCA por uma actividade catabólica demasiado intensa, conduz como anteriormente, à acumulação de intermediários ácidos do ciclo (C2 a C4). • O catabolismo de aminoácidos envolve primeiro a desaminação em ácidos carboxílicos e depois oxidação destes nas vias utilizadas no catabolismo dos ácidos do ciclo do TCA. • Finalmente, ao esgotar as fontes de carbono disponíveis num meio de fermentação complexo, o microrganismo inicia o catabolismo dos reservatórios intracelulares de ácidos carboxílicos C2 a C6 acumulados anteriormente. • Durante a fase catabólica realiza-se o anabolismo de aminoácidos necessários à síntese de proteínas no P. chrysogenum. A síntese de aminoácidos utiliza, como precursores os aminoácidos assimilados do meio de fermentação, iões amónio intra e extracelulares, e os intermediários ácidos do catabolismo de açúcares, lípidos, ácidos carboxílicos e aminoácidos. polissacáridos hexoses gluconato lactato histidina fenilalanina valina cisteína/cistina alanina treonina isoleucina pentoses glicerol lípidos triose fosfato CO2 H O2 CO2 2H oxaloacetato malato fumarato succinato -cetoglutaratoα isocitrato citrato aspartato metionina arginina glutamato lisina -aminoadipatoα leucina acetil~S-CoA piruvato Quadro 12.1 - O metabolismo primário e intermédio do Penicillium chrysogenum. 12.5.3 - Características de Estirpes Industriais A biossíntese da penicilina envolve 3 enzimas e portanto 3 genes responsáveis pela sua expressão. A simplicidade aparente da biossíntese não sugere a existência de quaisquer problemas na sua compreensão. Contudo, só há menos de 10 anos se conseguiram clonar estes genes e se verificou que constituem um cluster permitindo antever aumentos de produtividade com amplificação simultânea dos três genes relacionados com a síntese das enzimas biossintéticas [15]. A evidência recente sobre os reservatórios intracelulares dos três aminoácidos precursores da penicilina, revela uma muito maior complexidade do que inicialmente se supunha. O microrganismo constitui reservas diferenciadas dos AA, segundo o tipo de utilização - i.e., biossíntese de proteínas ou de penicilina - mas dispõe de mecanismos de troca entre os diferentes compartimentos [16]. Em estirpes de produtividade elevada, a permuta entre reservatórios de
  10. 10. determinado AA é muito rápida, ocorrendo a velocidades muito superiores à de estirpes de baixa produtividade [16]. Os mecanismos genéticos de regulação da expressão das enzimas da biossíntese da penicilina são ainda muito pouco conhecidos, embora envolvam, à semelhança de outros organismos com elevada homologia genética com o P. chrysogenum, a repressão catabólica por fontes de C e N facilmente metabolizáveis e a regulação pelo fosfato. Uma das explicações sugeridas para a elevada produtividade das estirpes industriais é a capacidade de produzirem e acumularem maiores quantidades de precursores e intermediários do metabolismo secundário (e.g., α-AAA) e de maiores concentrações intracelulares das enzimas biossintéticas, com maior actividade específica, em relação a estirpes não-industriais [14;15;17]. É também conhecido que estirpes de produtividade elevada excretam quantidades significativas de 6-APA e praticamente não oxidam o precursor [14;18;19]. ácido L - - aminoadípico ( - )α α L-cisteína L-valina -(L- -aminoadipil)δ α ACV AAA α α α ciclização em 2 passos benzil-penicilina ( )PENG α isopenicilina-N ( )IPN fenilacetato (activado) cisteinil-D-valina (LLD - ) Quadro 12.2 - A biossíntese de penicilina-G pelo P. chrysogenum. 12.6 O ISOLAMENTO DA PENICILINA DOS CALDOS FERMENTADOS Os processos de isolamento da penicilina G e da penicilina V são semelhantes pelo que se irão descrever em conjunto. Consistem basicamente de duas operações: extracção seguida de cristalização. No fim da fermentação o caldo fermentado, contendo ou não descargas parciais, é arrefecido a temperaturas abaixo dos 10°C e enviado para o sector de extracção onde por adição de uma
  11. 11. determinada percentagem de formol (0,5 – 1%, se procede à inactivação do microorganismo). A adição deste composto tem também por objectivo a prevenção da degradação da penicilina por acção das beta-lactamases. 12.6.1 - Extracção dos Caldos Fermentados Quaisquer que sejam os processos de extracção de penicilina (G ou V) o objectivo é obter um solvente rico neste antibiótico, normalmente o acetato de butilo, a partir do qual se isola o antibiótico [7]. Normalmente o rendimento global de extracção depende pouco do método utilizado e ronda os 85 – 90%. Para se obter a solução rica do antibiótico no acetato de butilo poderão pelo menos utilizar-se os três processos alternativos descritos a seguir. 12.6.1.1 - EXTRACÇÃO USANDO FILTROS ROTATIVOS E EXTRACTORES CONTÍNUOS PODBIELNIAK O caldo fermentado contendo ou não descargas parciais, ao pH de fermentação (cerca de 6.5) e a cerca de 10°C, é alimentado a filtros rotativos sob vácuo de tipo especial – string discarge filters – onde é feita a separação sólido/líquido. Durante a filtração o bolo do filtro é lavado com água de modo a que o filtrado emerja do filtro com uma concentração de penicilina da ordem das 20.000 U/ml. O rendimento desta operação ([penicilina no caldo filtrado/penicilina no caldo fermentado] x 100) situa-se normalmente nos 90 – 95%. A extracção da penicilina do caldo filtrado é efectuada com solventes imiscíveis com a água sendo o mais comum o acetato de butilo. O pH óptimo de extracção situa-se na gama 2 ± 10%. Esta extracção é efectuada em contracorrente em extractores contínuos de vários andares sendo o mais vulgar destes extractores o Podbielniak. Conforme as necessidades de caudal e o rendimento requerido podem ser usados grupos de máquinas em série. O esquema de extracção é mostrado na figura seguinte: Agente antiemulsionante Ácido sulfúrico diluído Agente molhante Caldo de Penicilina Caldo exausto de Penicilina Acetato de Butilo Rico Acetato de Butilo Do acetato de butilo rico obtido pode-se isolar a penicilina G ou V sob a forma de sal de potássio por alguns processos diferentes. 12.6.1.2 - EXTRACTORES DECANTADORES (WHOLE BROTH EXTRACTORS) Os extractores decantadores são máquinas desenvolvidas pela Westfália que permitem a extracção directa do caldo fermentado para o solvente (normalmente acetato de butilo). Existem vários modelos de máquinas que só diferem no caudal que podem processar. Normalmente as máquinas são combinadas em série e o rendimento obtido ([penicilina no solvente/penicilina no caldo fermentado] x 100) depende do número de máquinas em série. Para duas máquinas em série o rendimento é da ordem de 96% enquanto que para 3 máquinas em série o rendimento se aproxima de 98%. O investimento numa terceira máquina pode todavia não compensar o aumento de rendimento. Devido ao facto de a separação no Extractor Decantador dar origem a um solvente com algum grau de turvação é necessário existir a montante um clarificador do tipo separador líquido / líquido. O processo de extracção da penicilina para o acetato de butilo processa-se nas seguintes condições. O caldo fermentado com ou sem descargas parciais é alimentado ao sistema de extractores a uma temperatura da ordem dos 10°C. O pH óptimo para a extracção situa-se na gama 2 ± 10%. A Podebielniak
  12. 12. quantidade de solvente a utilizar tendo em conta o rendimento de extracção é calculada para ter um solvente rico contendo cerca de 70.000 U/ml de penicilina. O esquema de extracção usando dois extractores decantadores em série é o seguinte: caldo agentes molhantes solvente fresco fermentado H2SO4 solvente semi rico caldo solvente rico semi exausto 12.6.1.3 - COMBINAÇÃO DE SISTEMAS DE MEMBRANAS COM EXTRACTORES CONTÍNUOS TIPO PODBIELNIAK Este sistema é provavelmente o menos utilizado na indústria de produção de penicilina mas constitui uma opção válida. Este sistema é advogado para separação sólido/líquido em antibióticos que necessitam de utilizar adjuvante de filtração na filtração convencional o que não é normalmente o caso da fermentação de penicilina. Basicamente o sistema de filtração por membranas para a separação sólido/liquido da penicilina deverá incluir uma microfiltração com diafiltração como uma primeira operação de filtração. Nesta é introduzido um factor de diluição apreciável seguindo-se uma concentração do caldo filtrado por nanofiltração ou osmose inversa. A nanofiltração tem vantagens sobre a osmose inversa já que a grande maioria dos sais inorgânicos serão eliminados através da membrana o que não acontece na operação de osmose inversa. Após obtenção do caldo filtrado rico em penicilina com um rendimento de 90–95% a extracção é efectuada para acetato de butilo em Podbielniaks como descrito na primeira alternativa. 12.6.2 - Cristalização da Penicilina (G ou V) Independentemente do processo utilizado para a obtenção do acetato de butilo rico em penicilina os processos de cristalização da penicilina são basicamente os mesmos. Iremos apenas descrever um dos processos de cristalização mais utilizados industrialmente que permite obter uma penicilina G potássica de excelente qualidade. Neste processo o acetato de butilo rico em penicilina é primeiro descolorado com carvão activado o qual é removido por filtração. O solvente purificado é contactado com uma solução de bicarbonato de potássio a cerca de 23% de modo a que o pH de extracção seja cerca de 6,2 – 6,5. A razão volumétrica de solvente/solução de bicarbonato de potássio é tal que a concentração de penicilina na solução de bicarbonato de potássio seja da ordem das 550 000 U/ml tendo em conta o rendimento de extracção que é da ordem dos 98%. As duas fases, orgânica e aquosa, após um período de contacto adequado são separadas num separador centrífugo líquido/líquido sendo o solvente exausto enviado para a instalação de recuperação de solventes. A fase aquosa que contém a penicilina extraída como se disse numa concentração de cerca de 550.000 U/ml é então processada para cristalização da penicilina do seguinte modo: cerca de 4 volumes de n-butanol são adicionados à solução aquosa rica em penicilina e procede-se de seguida à destilação da mistura a baixa pressão e a baixa temperatura para não degradar a penicilina. O butanol forma um azeotropo com a água com uma composição aproximada de 63% de butanol e 37% de água (peso/peso). À medida que prossegue a destilação a água vai sendo removida até que se atinge a situação em que o butanol existente no evaporador/cristalizador tem uma humidade inferior a 1%. A operação caldo exausto + +micélio
  13. 13. de destilação é então terminada e a suspensão dos cristais de penicilina potássica é enviada para filtros adequados. Após filtração os cristais são lavados com butanol e depois de secos com ar no filtro são descarregados para secadores. Após secagem são peneirados, misturados, embalados e analisados. 12.7 PRODUÇÃO DE PENICILINA G POTÁSSICA EM PORTUGAL A actual Brocades Portuguesa em Matosinhos tem uma instalação de produção de penicilina G potássica mas a sua capacidade não é conhecida. A CIPAN S.A. embora não produza industrialmente penicilina detém know-how de fabrico quer ao nível fermentativo quer extractivo para este antibiótico. A detenção deste know-how permitiu já à CIPAN S.A. a construção de uma fábrica para a produção de penicilina G potássica em Madras no sul da Índia com uma capacidade de cerca de 700 ton/ano.A fábrica entrou em funcionamento em 1994 tendo o investimento sido de cerca de 55 milhões de USD (1994). É constituida por três sectores distintos: fermentação semi-descontínua com um volume instalado de 1.000 m3 , extracção com capacidade para cerca de 2.200 Kg/dia de penicilina G potássica e unidade de recuperação de solventes. As Figuras 12.3A e 12.3B mostram aspectos desta fábrica. O desenvolvimento da tecnologia de produção da penicilina G foi levado a cabo na Instalaçao Piloto de Fermentaçãoda CIPAN, S.A. constituida por vários fermentadores e respectivos sistemas de controlo com capacidades desde 200 a 1.050 litros. As Figuras 12.4A e 12.4B dão uma ideia desta instalação. Figura 12.3 - Vista parcial da fábrica para a produção de penicilina G potássica em Madras, Índia, construída pela CIPAN em 1994. A. Edifício de extracção e a zona de utilidades em construcção; B. Vista geral da fábrica acabada. 12.8 CONCLUSÃO A indústria farmacêutica de produção de antibióticos por fermentação nasceu há 50 anos com a produção de penicilina. Neste artigo mostrou-se o empreendimento extraordinário de engenharia que foi o desenvolvimento do processo de cultura submersa para a produção industrial de penicilina. O esforço conjunto de microbiologistas e engenheiros, ao longo de mais de 50 anos, permitiu aumentar quase 5 ordens de grandeza os títulos finais de penicilina numa fermentação [1;3]. Mostrou-se a importância que a penicilina tem actualmente quer pelo seu valor terapêutico intrínseco, nomeadamente em formulações veterinárias, quer como matéria prima para a produção de diversos antibióticos derivados mais eficazes sob o ponto de vista de espectro bacteriano, de estabilidade a pHs baixos e de resistência a beta-lactamases. Esta resistência a beta-lactamases A B
  14. 14. pode ainda ser drasticamente aumentada por formulação com compostos inibidores de beta-lactamases, sendo os mais representativos o ácido clavulânico o sulbactam e o tazobactam. Por esta razão, apesar do aparecimento de um número crescente de bactérias patogénicas resistentes a antibióticos beta-lactâmicos a penicilina tem mercado assegurado pelo menos durante a próxima década [7;9;11;20]. a) b) Figura 12.4 - Vista parcial da INSTALAÇÃO-PILOTO da CIPAN. A. Perspectiva geral de um fermentador de 1.050 l; B. Topo do tanque com as entradas para adições e o módulo de controlo. 12.9 PROBLEMAS DE REVISÃO 1. Qual a quantidade em gramas que corresponde a um BOU de Penicilina G Potássica e a um BOU de Penicilina V Potássica (BOU < > Billion Oxford Units) ? 2. As massas moleculares da Penicilina G Benzatínica e da Penicilina G Procaína são respectivamente 909 e 588,7 g/mole, contendo a primeira duas moléculas e a segunda uma molécula de Penicilina G sob a forma ácida. Quais são as actividades teóricas de cada uma destas penicilinas expressas em U/mg ? 3. A resistência desenvolvida por microorganismos à amoxicilina é muito maior do que à mistura de amoxicilina e clavulanato de potássio (inibidor de beta-lactamases). Justifique a razão deste fenómeno. 4. A Penicilina G e seus sais só podem ser administradas por via injectável enquanto que a penicilina V pode ser administrada por via oral. Porquê ? 5. Na hidrólise enzimática da Penicilina G a 6-APA pela Penicilina G Amidase qual o volume de hidróxido de sódio 4N necessário para converter 50 kg de Penicilina G a 6-APA com 98% de conversão ? 6. Qual a morfologia mais favorável à produção de penicilina e porquê ? 7. Em qual dos tipos limites de morfologia – filamentosa ou em pellets – é de esperar, para as mesmas condições de cultura no seio do meio de fermentação, maior repressão catabólica por substratos facilmente metabolizáveis ? 8. A partir dos dados na Fig. 12.2, calcule as quantidades aproximadas de substratos e precursor consumidas numa fermentação de Penicilina com duração típica, conduzida num fermentador de 100 m3 com um volume útil 70% do volume nominal. 9. Sabendo que a concentração em g/l de péptidos solúveis (C5,0H9,8O2,4N1,4S0,02) devidos à formulação do meio de cultura com águas de maceração de milho, é ca. de metade da de açúcares redutores no início da fermentação, e assumindo a exaustão do meio em péptidos A B
  15. 15. solúveis na fase de crescimento, calcule a importância desta fonte C em relação a outras fontes presentes na formação de biomassa até às 40 h de fermentação (despreze a existência de lise). 10. Na extracção de Penicilina G de um caldo fermentado com um título de 65.000 U/ml obteve-se 36 kg/m3 de Penicilina G Potássica com uma actividade de 1.585 U/mg. Qual foi o rendimento global da operação de extracção ? Palavras-Chave Pencillium chrysogenum, penicilina, produção de antibióticos, fermentação de antibióticos, extração de antibióticos, beta-lactâmicos, 6-APA, penicilinas semi-sintéticas Bibliografia [1] van Der Beek, C.P., Roels, J.A., (1984), Penicillin Production: Biotechnology at its Best.,AntonievanLeeuwenhoek50,625-639. [2] Menezes, J.C. (1996), 50 Anos de Produção Industrial de Penicilina., Bol. Biotechnol., SPB, 55, pp. 33-39. [3] Sheehan, J.C., (1982), The Enchanted Ring: the Untold Story of Penicillin., MIT Press, USA. [4] Crueger, W., Crueger, A., (1990), Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology., Sinauer Associates, USA. [5] Menezes, J. C., Análise e Modelação da Produção de Penicilina-G à Escala Piloto-Industrial. Tese de Doutoramento, Universidade Técnica de Lisboa (IST, 1996). [6] Regna, P.P. (1959), Antibiotics, Their Chemistry and Non-Medical Uses, Ed. Herbert S. Goldberg, D. Van NostrandCompany,Inc, New Jersey, Toronto, New York, London, pp 59. [7] Barber M. and Associates, (1986), Medical Chemical Monographs, Monograph No. 1, Penicillin G and Penicillin V, PJB Publications Limited, Richmond, England. [8] Matsumoto, K., (1993), Industrial Application of Immobilized Biocatalysts, Ed., Atsuo Tanaka, Tetsuya Tosa, Takeshi Kobayashi, Marcel Dekker, Inc, New York, Basel, Hong Kong, pp 67-88. [9] Barber M. and Associates, (1987), Medicinal Chemical Monographs, Monograph No. 3, Semisynthetic Penicillins, Amoxicillin, Ampicillin and others, PJB Publications Limited, Richmond, England. [10] Cardoso, J.P., Costa M.B.C. et al (1987), Bioreactors and Biotransformations,Ed.,G.W.MoodyandP.B.Baker,ElsevierApplied Science Publishers, London and New York, pp 309-320. [11] Barber, M. and Associates, (1987), Medicinal Chemical Monographs, Monograph No. 4, Oral Cephalosporins,PJBPublications Limited, Richmond, England. [12] Perlman, D. (1979), Microbial Production of Antibiotics., in Microbiol Technology. Microbial Processes.,vol.1,pg.241-280,Ed. H.J. Peppler, D. Perlman, 2nd ed. Academic Press, N.Y.. [13] Ryu, D.D.Y., Hospodka, J., (1980), Quantitative Physiology of Penicillium chrysogenum, Biotechnol. Bioeng. 23,289-298. [14] Nielsen, J. (1996), Physiological Engineering Aspects of Penicillium chrysogenum. World Science Publishing Co., Singapore [15] Martín, J.F., (1992), Clusters of Genes for the Biosynthesis of Antibiotics: Regulatory Genes and Overproduction of Pharmaceuticals., J. Ind. Microbiol. 9,73-90. [16] Affenzeller, K., Kubicek, C., (1991), Evidence for a Compartimentation of Penicillin Biosynthesis in a High-andaLow-Producing Strain of Penicillium chrysogenum., J. Gen. Microbiol., 137,1653-1660. [17] Martín, J.F., Liras, P., (1985), Biosynthesis of beta-Lactam Antibiotics: Design and Construction of Overproducing Strains.", Trends Biotechnol. 3(2),39-44. [18] Hersbach, G.J.M., van Der Beek, C.P. et al., (1984), The Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation.", in "Biotechnology of Industrial Antibiotics., pg. 45-140, Ed. E. Vandamme, Marcel Dekker, N.Y.. [19] Strohl, W.R. (1997), Industrial Antibiotics: Today and the Future., in Biotechnology of Antibiotics.,pg.1-49,Ed.Strohl,W.R.,2nd Ed. Marcel Dekker, N.Y.. [20] Hamilton-Miller, J.M.T., 1999, Beta-Lactam: Variations on a Chemical Themne, with some surprising Biological Results.,J. Antimicrobial Chemotherapy, 44,729-734.

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