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Identificación de proteínas.

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PRÁCTICA NO. 6
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
MATERIA
BIOQUÍMICA
INTEGRANTES
Isaías Ojeda Arlette Guadalupe
Muñoz Gutiérrez Abigail del Rosario
Silva Lerma Sanjuana Ivette
Vázquez Celio Andrea

Publicada em: Educação
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Identificación de proteínas.

  1. 1. CETIS 62 PRÁCTICA NO. 6 IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MATERIA BIOQUÍMICA DOCENTE IBQ Marta GabrielaAceves Morales ESPECIALIDAD LABORATORIO CLÍNICO GRADO: 6° SEMESTRE GRUPO:“E” EQUIPO NUM.7 INTEGRANTES Isaías Ojeda Arlette Guadalupe Muñoz Gutiérrez Abigail del Rosario Silva Lerma Sanjuana Ivette Vázquez CelioAndrea
  2. 2. IDENTIFICACION DE PROTEINAS OBJETIVO: Realizar experimentos para identificar las proteínas, como la configuración y la identificación por el reactivo BIURET. FUNDAMENTO: Proteína, cualquiera de los numerosos compuestos orgánicos constituidos por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos que intervienen en diversas funciones vitales esenciales, como el metabolismo, la contracción muscular o la respuesta inmunológica. Se descubrieron en 1838 y hoy se sabe que son los componentes principales de las células y que suponen más del 50% del peso seco de los animales. El termino proteína deriva del griego proteico, que significa primero. El plasma sanguíneo normal contiene de 6.5 a 7.5gr de proteínas por 100al. Las proteínas plasmáticas pueden dividirse en 3 grupos: a) fibrinógenos; b) globulinas; c) albuminas. Cada una de estas variedades pueden ser precipitadas en bases a su solubilidad en soluciones salinas, y se logra una separación simple o burda mediante precipitación salina de dichas proteínas o fuerzas iónicas diferentes. La precipitación salina con sulfato de amonio es una etapa preliminar útil en muchas técnicas de aislamiento de proteínas en particular de enzimas. Existen 2 tipos de lograr esta etapa de purificación o bien sea añadiendo sulfato de amonio sólido, o bien sea con una solución saturada (100 por 100) neutra del mismo. En el primer caso, existe ventaja de mantener en un mínimo el aumento de volumen; en cambio la solución saturada presenta la ventaja de una manipulación más cómoda. Las moléculas proteicas van desde las largas fibras insolubles que forman el tejido conectivo y el pelo, hasta los glóbulos compactos solubles, capaces de atravesar la membrana celular y desencadenar reacciones metabólicas. Tienen un peso molecular elevado y son específicas de cada especie y de cada uno de sus órganos. Se estima que el ser humano tiene unas 30.000 proteínas distintas, de las que solo un 2% se ha descrito con detalle. Las proteínas sirven sobre todo para construir y mantener las células, aunque su descomposición química también proporciona energía, con un rendimiento de 4 kilocalorías por gramo, similar al de los hidratos de carbono. Las enzimas son proteínas, al igual que la insulina y casi todas las demás hormonas, los anticuerpos del sistema inmunológico y la hemoglobina.
  3. 3. REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET) Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre(II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas.
  4. 4. PROCEDIMIENTO 1. En cada tubo de ensaye colocar 2ml de solución de proteína (diluida al 1%). 2. Añadir a cada tubo 2ml de NaOH al 10% y agitar. 3. Agregar gota a gota solución de sulfato cúprico al 1% hasta la aparición de un color rosa o violeta (máximo 10 gotas). 4. Reportar a que gota aparece el color. REACCION XANTOPROTEICA La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro. La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofílica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH ácido. PROCEDIMIENTO 1. Colocar en cada tubo de ensaye 3ml de proteína. 2. Añadir con cuidado y lentamente 1ml de HNO3 concentrado. 3. Calentar en baño maría por 2min, y enfriar a chorro de agua. 4. Agregar gota a gota solución de NaOH concentrado (máximo 10 gotas) a él vire de color. Observar y reportar resultados.
  5. 5. COAGULACION POR CALOR PROCEDIMIENTO 1. Calentar a hervir 5ml de solución de proteína 2. Añadir 2 gotas de ácido acético al 1% 3. Colocar en 4 tubos, la solución repartida por igual y agregar de la siguiente manera: Tubo1= 1ml acetona Tubo2= 1ml de éter Tubo3= 1ml de butanol Tubo4= 1ml tolueno 4. Agitar fuertemente para tratar de disolver el coagulo. Reportar en tabla. 5. Los tubos que no disolvieron el coagulo, agregar 3 gotas de NaOH concentrado, y agitar. 6. Observar y anotar diferencias. OBTENCION DE CASEINA DE LA LECHE La caseína es un conjunto heterogéneo de proteínas por lo que es difícil fijar una definición, sin embargo, todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común que precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4.6 por ello a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche. La caseína es una proteína de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico, por lo tanto, su molécula contiene un elemento fósforo. La caseína representa cerca del 77 al 82 por ciento de las proteínas presentes en la leche y el 2.7 por ciento en la composición de la leche líquida.
  6. 6. PROCEDIMIENTO 1. Colocar 100ml de leche en un vaso de precipitado 2. Agregar 100ml de agua destilada 3. Con una pipeta añadir HCl 0.2N hasta obtener un pH de 4.8 4. Dejar reposar hasta que el sedimento precipite. 5. Suspender el precipitado en 100ml de agua destilada y dejar reposar. 6. Repetir este lavado 4 veces. 7. Filtrar el precipitado final en un embudo Buchner, colectando en el papel la proteína. 8. Suspender la caseína en 25ml de agua destilada, agitar para homogeneizar y filtrar. Repetir 4 veces. 9. Después del último lavado, suspender la proteína en 5ml de éter y 5ml de acetona, y filtrar. 10.Colocar el polvo obtenido en un desecador con cloruro de calcio y pesar el polvo 24 horas después.
  7. 7. MATERIALES REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET) MATERIAL Pescado Espinaca Levadura Tubos de ensaye Grenetina leche
  8. 8. REACTIVOS NaOH al 10% Sulfato cúprico al 1% en gotero REACCION XANTOPROTEICA MATERIAL Tubos de ensaye Gradilla Baño maría
  9. 9. REACTIVOS NaOH concentrado (gotero) HNO3 concentrado COAGULACION POR CALOR MATERIAL Tubos de ensaye Gradilla Baño maría
  10. 10. REACTIVOS Acido acético al 1% Acetona Éter Tetracloruro de carbono Butanol NaOH concentrado con gotero OBTENCION DE CASEINA DE LA LECHE MATERIAL 2 vasos de precipitados de 250ml 1 probeta de 100ml 1 embudo 2 papel filtro
  11. 11. REACTIVOS leche entera HCl 0.2N Acetona Éter RESULTADOS  REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET) PROTEÍNAS:  LEVADURA  ESPINACAS  GRENETINA  LECHE  PESCADO  HUEVO
  12. 12. PROTEÍNA NO. DE GOTAS AL CAMBIO DE COLOR COLOR DE LA REACCIÓN LEVADURA 5 gotas Lila ESPINACAS 7 gotas Verde fuerte GRENETINA 3 gotas Azul LECHE 2 gotas Azul PESCADO 3 gotas Morado-azulado HUEVO 6 gotas morado El resultado obtenido en esta reacción fueron los colores en tonalidades desde morado hasta lila, así como el azul también estuvo presente solo en algunas proteínas. Imágenes anexadas:
  13. 13.  REACCION XANTOPROTEICA PROTEÍNAS:  LEVADURA  ESPINACAS  GRENETINA  PESCADO  HUEVO  LECHE
  14. 14. PROTEÍNA NO. DE GOTAS AL CAMBIO DE REACCIÓN OBSERVACIONES PRESENTADAS LEVADURA 4 gotas Sin precipitado Formación de cuajo con grumos de color amarillo ESPINACA 6 gotas Formación de precipitado color café oscuro Presente de forma líquida pero espesa GRENETINA 9 gotas Reacción líquida Formación de cuajo con grumos en la parte de arriba del líquido de color amarillo huevo PESCADO 8 gotas Formación de precipitado color amarillo en forma de sólido HUEVO 3 gotas Formación de cuajo o grumos en la parte superior color anaranjado rojizo Seguida por una segunda reacción blanquisa en forma de cuajo con algo de espuma Precipitado de color amarillo Espeso LECHE 6 gotas Reacción espesa Formación de grumos en la parte superior de color café-amarillo
  15. 15. En la realización de esta técnica se notó el cambio de consistencia de cada proteína al reaccionar con el reactivo, cambiando totalmente su consistencia tanto física como química, pues principalmente en la mayoría de las proteínas se formó un precipitado y un grumo generalmente de color amarillo. Imágenes anexadas  COAGULACION POR CALOR PROTEÍNAS:  LEVADURA  LECHE  PESCADO  GRENETINA  ESPINACAS  HUEVO
  16. 16. PRETEÍNAS REACTIVOS ACETONA ÉTER ETÍLICO BUTANOL TOLUENO LEVADURA Soluble Soluble Soluble Insoluble LECHE Soluble Soluble Soluble Insoluble PESCADO Soluble Soluble Insoluble Insoluble GRENETINA Soluble Soluble Insoluble Insoluble ESPINACAS Soluble Insoluble Insoluble Insoluble HUEVO Insoluble Insoluble Insoluble Insoluble En la realización de esta técnica generalmente la mayoría de las proteínas fueron insolubles al tolueno; una de las mayores observaciones fue que el huevo fue la única proteína que es insoluble a estos reactivos de esta técnica. Es muy importante que al momento de realizar esta técnica debemos ser muy precisos en cuento a las cantidades a utilizar ya que un exceso de este o una falta puede alterar por completo el resultado de la técnica. Imágenes anexadas:
  17. 17.  OBTENCION DE CASEINA DE LA LECHE PROTEÍNAS:  LECHE Generalmente en la primera parte de precipitar, observamos que la leche principalmente el contenido de caseína debido a su diferencia de densidades se fue hasta el fondo, formando el precipitado de caseína. El resultado final de caseína tuvo una consistencia sólida-líquida, con formación de pequeños grumos, en color blanco y que a su vez tuvo una consistencia algo espesa. Imágenes anexadas:
  18. 18.  REACCION XANTOPROTEICA PROTEÍNAS:  LEVADURA  ESPINACAS  GRENETINA  PESCADO  HUEVO  LECHE
  19. 19. PROTEÍNA NO. DE GOTAS AL CAMBIO DE REACCIÓN OBSERVACIONES PRESENTADAS LEVADURA 4 gotas Sin precipitado Formación de cuajo con grumos de color amarillo ESPINACA 6 gotas Formación de precipitado color café oscuro Presente de forma líquida pero espesa GRENETINA 9 gotas Reacción líquida Formación de cuajo con grumos en la parte de arriba del líquido de color amarillo huevo PESCADO 8 gotas Formación de precipitado color amarillo en forma de sólido HUEVO 3 gotas Formación de cuajo o grumos en la parte superior color anaranjado rojizo Seguida por una segunda reacción blanquisa en forma de cuajo con algo de espuma Precipitado de color amarillo Espeso LECHE 6 gotas Reacción espesa Formación de grumos en la parte superior de color café-amarillo
  20. 20. En la realización de esta técnica se notó el cambio de consistencia de cada proteína al reaccionar con el reactivo, cambiando totalmente su consistencia tanto física como química, pues principalmente en la mayoría de las proteínas se formó un precipitado y un grumo generalmente de color amarillo. Imágenes anexadas
  21. 21. OBSERVACIONES La caseína luego de que la leche se cortó no fue soluble en agua, debido a este motivo se le pudo filtrar. Al realizar las diferentes pruebas con la albúmina se pudo comprobar experimentalmente efectivamente que se trata de una proteína. Se pudo observar que mediante varias reacciones que la clara de huevo tiene proteínas que la conforman esta proteína es la ovoalbúmina. Luego de realizada la reacción de Biuret la muestra de leche se tornó violeta, por lo que podemos decir que existen enlaces pepiticos y por lo tanto proteínas en la muestra y dicha proteína es la caseína. En el ensayo de Xantoproteico podemos percibir un color amarillento, por lo que nos muestra que la existen proteínas en la muestra ya que el color amarillo es representativo de los restos aromáticos como la Tirosina y la Fenilalanina. Observamos que es muy importante saber identificar las proteínas en los alimentos que consumimos diariamente esto se pudo observar a través de las diferentes reacciones que se presentaron en los alimento llevados.
  22. 22. CONCLUSIONES Las proteínas constituyen una de las moléculas más importantes en el organismo ya que cumplen muchas funciones. Las proteínas están constituidas por aminoácidos por los cuales los métodos se basan en el reconocimiento de los aminoácidos En esta práctica pudimos observar el contenido de proteína en los diferentes alimentos que utilizamos, y como se pudo observar pues los alimentos que tienen más proteína son la clara de huevo, el pescado y la leche. Por lo tanto pudimos ver que este no es muy recomendado para la nutrición en las personas y que lo que si podemos consumir para tener un buen balance de proteínas en nuestro cuerpo es el huevo aunque solo se pueden consumir de uno a dos máximo, el pescado, la leche que ayuda a tener un hermoso cabello y huesos resistentes en los niños. En las reacciones donde se obtuvo precipitación se debió a un cambio en el estado físico de la proteína, mientras que en la coagulación se ha producido un cambio en el estado físico y en la estructura química por eso es irreversible. Las proteínas son sensibles con las sales metálicas pesadas (mercurio, cobre, plomo) formando precipitados
  23. 23. CUESTIONARIO 1. ¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de las PROTEINAS? La desnaturalización de proteínas se da en la clara de los huevos, que son en gran parte albúminas en agua. En los huevos frescos, la clara es transparente y líquida; pero al cocinarse se torna opaca y blanca, formando una masa sólidainter comunicada. Esa misma desnaturalización puede producirse a través de una desnaturalización química, por ejemplo volcándola en un recipiente con acetona. Desnaturalización Irreversible de la proteína de la clara de huevo y pérdida de solubilidad, causadas por la alta temperatura (mientras se la fríe). 2. Cuál de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización? El efecto de la temperatura, cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas y, se desnaturalizan. 3. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína? Para saber si una sustancia desconocida, es una proteína se utiliza el reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con(KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. 4. Que coloración da la reacción del Biuret? La coloración que presenta es el color violeta, indicando la presencia de proteínas. 5. ¿Una proteína coagulada podría dar la reacción del Biuret? Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70 ªC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc.Si una proteína coagulada podría dar la reacción de Biuret, porque el reactivo reacciona con cualquier proteína, liquida o sólida, por ejemplo cuando haces una cuantificación de proteínas en suero (liquida) o cuando haces una prueba cualitativa en huevos, carne, papas, etc.
  24. 24. 6. Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es positiva o negativa? ¿Por qué? Por qué detecta la presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y, por tanto, sirve para todas las proteínas y péptidos cortos. El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una base fuerte) reacciona con los enlaces del péptido y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia, tornándose VIOLETA. Mientras más cantidad de proteína esté presente en la solución, más oscuro es el color. Por ejemplo cuando se calienta la urea a 180 celsius, se descompone transformándose en un compuesto llamado "biuret", el cual en presencia de Cu2+ en solución alcalina forma un complejo color violáceo ya que reconoce los enlaces peptídicos de las proteínas, no es específico para identificación de proteínas con dos o más enlaces peptídicos. 7. Explica la reacción Xantoproteíca. La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro. La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofílica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH ácido. Según las guías químicas es una reacción cualitativa, más no cuantitativa. Por ende determina la presencia o no de proteínas. Para cuantificar se usa otra reacción, como la de Biuret, y se hace un análisis espectro fotométrico.
  25. 25. BIBLIOGRAFÍAS:  DMedicina; Proteínas; revista médica; http://www.dmedicina.com/vida- sana/alimentacion/diccionario-de-alimentacion/proteinas.html; consultada el 31 de mayo de 2016.  Licenciatura en ciencia y tecnología de los alimentos; análisis de contenido de las proteínas; archivo pdf; http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/124179/mod_resource/co ntent/1/QA-2015-PROTEINAS-METODOS.pdf; consultada el 31de mayo de 2016.  Angelfire; reconocimiento de proteínas; revista de bioquímica; http://www.angelfire.com/scifi/anarkimia/Reconocimiento%20de%20Protena s.htm; consultada el 31de mayo de 2016.  Monografías; caracterización de proteínas; revista de bioquímica abierta; http://www.monografias.com/trabajos98/caracterizacion- proteinas/caracterizacion-proteinas.shtml; consultada el 31 de mayo de 2016.  Proteínas; practica 1: reconocimiento de proteínas; blog; http://santiynicoquimica.blogspot.mx/; consultada el 31 de mayo de 2016.  Geocities; aminoácidos y proteínas; archivo pdf de bioquímica; http://www.geocities.ws/todolostrabajossallo/orgaII_4.pdf; consultada el 31 de mayo de 2016.  Química bilógica I; proteínas generalidades; archivo pdf; http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp- content/uploads/2010/08/TP-Proteinas-generalidades.pdf; consultada el 31 de mayo de 2016.

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