Minha dissertação 2004

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Minha dissertação 2004

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS ADRIANA ELIAS PIRES Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso Campo Grande, MS 2004
  2. 2. UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS ADRIANA ELIAS PIRES Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química – Curso de Mestrado em Química, da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Química, área de concentração: Química Orgânica. Campo Grande, MS 2004
  3. 3. "O Mestre na arte da vida faz pouca distinção entre o seu trabalho e o seu lazer, entre a sua mente e o seu corpo, ... entre o seu amor e a sua religião. Ele simplesmente persegue sua visão de excelência em tudo que faz, deixando para os outros a decisão de saber se está trabalhando ou se divertindo." Texto Budista
  4. 4. DEDICATÓRIA Dedico a presente dissertação aos meus pais Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires, presentes, dedicados, amorosos, sem os quais nada seria possível. Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos Santos, prestativo e amoroso, companheiro de todas as horas. As minhas queridas irmãs Claudia e Fernanda. A Deus por conceder a vida, a oportunidade de compartilhá-la com pessoas tão maravilhosas, o discernimento e o equilíbrio que me fizeram completar mais esta etapa da vida.
  5. 5. AGRADECIMENTOS A Deus. À Professora Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso, pela preciosa e incessante orientação deste trabalho, apoio, amizade e compreensão. Às professoras Dra. Neli K. Honda e Dra. Rosenei L. Brum, pelos ensinamentos, colaboração e por oferecerem o laboratório para realização deste trabalho. Aos professores Dra. Fernanda R. Garcez, Dr. Walmir S. Garcez, Dra. Neuza M. Mazzaro Somera, Dra. Rozanna M. Muzzi, Dra. Nilva R. Poppi, Dra. Márcia R. da Matta, que me proporcionaram novos conhecimentos. Ao Luís Leonardo Viana pela colaboração e pelos grandes ensinamentos na arte da cromatografia líquida. À Mestre Roberta do laboratório de análises instrumentais da INEP, pela realização de análises em cromatografia gasosa. À Professora Dra. Conceição Eneida dos Santos Silveira e ao mestrando em Botânica Dario Palhares da Universidade de Brasília pelas coletas e identificação de Brosimum gaudichaudii. Aos colegas do curso de Mestrado em Química da UFMS e todos os demais colegas. Aos secretários do Mestrado do DQI/UFMS Celestino G. de Oliveira e Maria Otávia P. V. de Toledo pela colaboração. A todos os funcionários e técnicos do Departamento de Química da UFMS, em especial a Dona Rosa pela prestimosa organização do laboratório. À CAPES pela bolsa concedida.
  6. 6. SUMÁRIO ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. v ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................ ix ABREVIATURAS ....................................................................................................... xi RESUMO .................................................................................................................. xii ABSTRACT .............................................................................................................. xiii 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1 1.1. Introdução Geral .......................................................................................................... 1 1.2. Furanocumarinas......................................................................................................... 3 1.3. Plantas contendo furanocumarinas .......................................................................... 7 1.3.1. Dorstenia .............................................................................................................. 7 1.3.1.1. Dorstenia multiformes ................................................................................. 9 1.3.1.2. Dorstenia brasiliensis ................................................................................. 9 1.3.2. Brosimum gaudichaudii .................................................................................... 10 1.4. Medicamentos Fitoterápicos .................................................................................... 11 1.4.1. Outras plantas presentes nos medicamentos estudados........................... 12 1.4.1.1. Davilla rugosa ............................................................................................ 12 1.4.1.2. Plumeria lancifolia ..................................................................................... 13 1.4.1.3. Erythrina mulungu ..................................................................................... 13 1.4.1.4. Cereus jamacaru ....................................................................................... 13 1.5. Legislação de Fitoterápicos ..................................................................................... 14 1.6. Técnicas Instrumentais de Análise ......................................................................... 17 1.7. Validação de Métodos Analíticos ............................................................................ 18 1.7.1. Desenvolvimento do método ........................................................................... 19 1.7.2. Parâmetros de validação ................................................................................. 20 1.7.2.1. Especificidade / seletividade ................................................................... 20 1.7.2.2. Limite de quantificação (LQ) ................................................................... 21 1.7.2.3. Limite de detecção (LD) ........................................................................... 23 1.7.2.4. Linearidade e faixa de aplicação ............................................................ 23 i
  7. 7. 1.7.2.5. Sensibilidade .............................................................................................. 26 1.7.2.6. Exatidão ...................................................................................................... 27 1.7.2.7. Precisão ...................................................................................................... 28 1.7.2.8. Estabilidade ................................................................................................ 30 1.7.2.9. Robustez..................................................................................................... 30 1.7.3. Parâmetros de validação requeridos ............................................................. 31 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 32 3. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................ 33 3.1. Materiais e Equipamentos Utilizados ..................................................................... 33 3.1.1. Materiais utilizados............................................................................................ 33 3.1.2. Solventes utilizados .......................................................................................... 33 3.1.3. Equipamentos utilizados .................................................................................. 33 3.2. Medicamentos Fitoterápicos .................................................................................... 35 3.3. Desenvolvimento das Metodologias....................................................................... 38 3.3.1. Soluções orais ................................................................................................... 38 3.3.2. Cápsulas e comprimidos .................................................................................. 39 3.4. Validação das Metodologias .................................................................................... 40 3.4.1. Recuperação ...................................................................................................... 40 3.4.2. Limites de detecção e quantificação. ............................................................. 41 3.4.3. Curva de calibração .......................................................................................... 41 3.4.4. Linearidade ......................................................................................................... 42 3.4.5. Acurácia e precisão .......................................................................................... 42 3.4.6. Estabilidade ........................................................................................................ 43 3.4.7. Especificidade .................................................................................................... 43 3.5. Outros Estudos Realizados ..................................................................................... 44 3.5.1. Novas condições cromatográficas.................................................................. 44 3.5.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C. ........................................................... 44 3.5.3. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos fitoterápicos............................................................................................................................. 45 3.5.3.1. Material vegetal ......................................................................................... 45 3.5.3.2. Preparação das amostras ........................................................................ 47 ii
  8. 8. 3.5.3.2.1. Preparação de amostras para determinação do comprimento de onda ......................................................................................................................................... 47 3.5.3.2.2. Preparação de extratos de agoniada ............................................. 47 3.5.3.2.3. Preparação de extratos de Brosimum gaudichaudii.................... 47 3.5.3.2.4. Preparação de extratos de carapiá, mamica de cadela, Dorstenia multiformes e Brosimum gaudichaudii ............................................................. 48 3.5.3.2.5. Preparação de tinturas por maceração e por percolação de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .............................................................. 49 3.5.3.2.6. Hidrólise de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii ... 49 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 50 4.1. Desenvolvimento das Metodologias....................................................................... 51 4.1.1. Soluções orais ................................................................................................... 51 4.1.2. Cápsulas e comprimidos .................................................................................. 59 4.2. Validação das Metodologias .................................................................................... 63 4.2.1. Recuperação ...................................................................................................... 64 4.2.2. Especificidade .................................................................................................... 67 4.2.3. Limites de detecção e quantificação .............................................................. 69 4.2.4. Estabilidade ........................................................................................................ 70 4.2.5. Curva de calibração .......................................................................................... 70 4.2.6. Linearidade do método ..................................................................................... 72 4.2.7. Acurácia e precisão .......................................................................................... 72 4.3. Avaliação das Quantidades Obtidas nos Medicamentos Analisados ............... 75 4.4. Outros Estudos Realizados ..................................................................................... 82 4.4.1. Novas condições cromatográficas.................................................................. 82 4.4.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C ............................................................ 90 4.4.3. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos fitoterápicos............................................................................................................................. 90 4.4.3.1. Determinação do comprimento de onda ............................................... 90 4.4.3.2. Comparação de perfis cromatográficos dos extratos de agoniada... 92 4.4.3.3. Teores de furanocumarinas em Brosimum gaudichaudii ................... 94 4.4.3.4. Comparação entre amostras de carapiá, mamica de cadela, Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .............................................................. 97 iii
  9. 9. 4.4.3.5. Maceração e percolação de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .......................................................................................................................... 101 4.4.3.6 - Hidrólise de Dortenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .......... 105 5. CONCLUSÕES ................................................................................................................ 107 6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 109 iv
  10. 10. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Estrutura básica das cumarinas. ................................................................ 3 Figura 2 – Exemplos de furanocumarinas. .................................................................. 5 Figura 3 – Furanocumarinas preniladas encontradas em Dorstenia brasiliensis. ....... 8 Figura 4 – Exemplos de cumarinas encontradas em Brosimum gaudichaudii. ......... 11 Figura 5 – Pico de CLAE-UV representando uma relação sinal-ruído de 10:1.......... 22 Figura 6 – Curva de calibração por padrão externo. ................................................. 24 Figura 7 – Curva de calibração por adição de padrão na matriz contendo o analito . 25 Figura 8 – Curva de calibração com adição de padrão interno. ................................ 25 Figura 9 – Regressão linear de uma curva de calibração. Reta vermelha, reta ideal estimada por regressão linear. .................................................................................. 26 Figura 10 - Estrutura das substâncias analisadas ..................................................... 50 Figura 11 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento A (amostra bruta). ......................................................................................................... 52 Figura 12 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento B (amostra bruta). ......................................................................................................... 53 Figura 13 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento C (amostra bruta). ......................................................................................................... 53 Figura 14 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento A. ............................................. 55 Figura 15 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento B. ............................................. 56 Figura 16 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ............................................. 56 Figura 17 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos posteriores do medicamento A. ................................................................................. 57 Figura 18 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos posteriores do medicamento B. ................................................................................. 57 Figura 19 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos posteriores do medicamento C.................................................................................. 58 v
  11. 11. Figura 20 – Cromatograma obtido da análise por CG-EM da solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ............................................. 59 Figura 21 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do medicamento E. ........................................................................................................ 61 Figura 22 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do medicamento F.......................................................................................................... 61 Figura 23 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do medicamento G. ........................................................................................................ 62 Figura 24 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do medicamento H. ........................................................................................................ 62 Figura 25 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do medicamento I. .......................................................................................................... 63 Figura 26 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV representativo de análises de soluções orais. ....................................................................................... 67 Figura 27 –Cromatograma obtido por CG-DIC representativo de análises de soluções orais. .......................................................................................................... 68 Figura 28 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV representativo de análises de cápsulas e comprimidos. ........................................................................ 68 Figura 29 –. Cromatograma obtido por CG-EM representativo de análises de cápsulas e comprimidos. ........................................................................................... 69 Figura 30 – Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno e bergapteno nos diferentes lotes de soluções orais A, B e C por análise em CLAE- UV e CG-DIC............................................................................................................. 77 Figura 31 - Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno, bergapteno e DT nos diferentes lotes de medicamentos E, F, G, H e I por análise em CLAE-UV e CG-EM. .................................................................................................. 78 Figura 32 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da extração do comprimido J. ............................................................................................................ 80 Figura 33 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil cromatográfico do medicamento A (amostra bruta). ................ 83 Figura 34 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil cromatográfico do medicamento B (amostra bruta). ................ 83 vi
  12. 12. Figura 35 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil cromatográfico do medicamento C (amostra bruta). ................ 84 Figura 36 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do medicamento A (amostra bruta). ............................................................................... 85 Figura 37 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do medicamento B (amostra bruta). ............................................................................... 86 Figura 38 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do medicamento C (amostra bruta). ............................................................................... 86 Figura 39 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento A. ....................... 87 Figura 40 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento B. ....................... 87 Figura 41 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ....................... 88 Figura 42 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da solução para estudos posteriores do medicamento A. .............................................. 88 Figura 43 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da solução para estudos posteriores do medicamento B. .............................................. 89 Figura 44 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da solução para estudos posteriores do medicamento C. .............................................. 89 Figura 45 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição para quantificação de furanocumarinas, de extrato etanólico de carapiáx......................... 91 Figura 46 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição isocrática para estudo do perfil cromatográfico, de extrato etanólico de carapiá x. .................... 92 Figura 47 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada x. .................. 93 Figura 48 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada y. .................. 93 Figura 49 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada z. .................. 94 Figura 50 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV de extrato etanólico de raiz de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................... 95 vii
  13. 13. Figura 51 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de caule de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................ 95 Figura 52 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de folhas de Brosimum gaudichaudiix. ........................................................................... 96 Figura 53 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (10 µL da solução final de 10 mL) do extrato etanólico de lenho da raiz de Brosimum gaudichaudiix. .......... 96 Figura 54 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (5 µL solução final de 25 mL) do extrato etanólico de casca da raiz de Brosimum gaudichaudiix. .................... 97 Figura 55 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de carapiáx. .................................................................................................................... 98 Figura 56 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de carapiáy. .................................................................................................................... 98 Figura 57 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de rizoma de Dorstenia brasiliensisx. ............................................................................. 99 Figura 58 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de mamica de cadelax. ................................................................................................... 99 Figura 59 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de raiz de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................. 100 Figura 60 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da tintura produzida por percolação de Dorstenia brasiliensisx. ................................... 103 Figura 61 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da tintura produzida por percolação de Brosimum gaudichaudiiy. ................................ 103 Figura 62 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do medicamento D (amostra bruta). ............................................................................. 104 Figura 63 - Quantidades de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de amostra) nas amostras de D.brasiliensisx, B.gaudichaudiiy e B.gaudichaudiiz hidrolisadas e não hidrolisadas. .............................................................................. 106 viii
  14. 14. LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Programação de temperatura utilizada em CG-DIC e CG-EM29 .............. 35 Tabela 2 - Informações sobre denominações, lotes, data de fabricação, data de validade e cidade de aquisição dos medicamentos. ................................................. 37 Tabela 3 - Amostras de plantas adquiridas no comércio de Campo Grande. ........... 46 Tabela 4 - Tempo de retenção (minutos  DP) das furanocumarinas em diferentes equipamentos, empregando as condições de quantificação. .................................... 51 Tabela 5 – Porcentagens de recuperação de psoraleno e bergapteno nas soluções orais A, B e C (n=15). ................................................................................................ 65 Tabela 6 – Porcentagens de recuperação de psoraleno, bergapteno e DT nas cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15). .......................................................... 66 Tabela 7 - Limite de detecção e quantificação (μg mL-1) para psoraleno, bergapteno e DT em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM. .................................................................... 69 Tabela 8 - Dados de regressão linear das curvas de calibração para determinação quantitativa de psoraleno e bergapteno por CLAE-UV e CG-DIC para soluções orais. .................................................................................................................................. 71 Tabela 9 - Dados de regressão linear das curvas de calibração para determinação quantitativa de psoraleno, bergapteno e DT por CLAE-UV e CG-DIC para cápsulas e comprimidos. ............................................................................................................. 71 Tabela 10 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg ml-1)(média  DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B e C (n=12). ................................................................................................................... 73 Tabela 11 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg ml-1) (média  DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B e C (n=15). ................................................................................................................ 73 Tabela 12 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg mL-1) (média  DP) de psoraleno, bergapteno e DT em amostras de cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15). ............................................................................ 74 ix
  15. 15. Tabela 13 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg mL-1) (média  DP) de psoraleno, bergapteno e DT em amostras de cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15). ............................................................................ 74 Tabela 14 - Quantidade (μg mL-1) (média  DP) de furanocumarinas nas soluções orais empregando o método com CLAE-UV (n=15). ................................................. 75 Tabela 15 - Quantidade (μg/100 mg de cápsula ou comprimido) (média  DP) de furanocumarinas empregando o método com CLAE-UV (n=15). .............................. 76 Tabela 16 - Teores de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de amostra) extraídos pelo procedimento com álcool etílico absoluto e reextrações com clorofórmio............................................................................................................... 100 Tabela 17 - Teores de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de amostra) nas tinturas de D.brasiliensisx e B.gaudichaudiiy obtidas por maceração e percolação. .............................................................................................................. 102 Tabela 18 – Comparação entre as quantidades (μg mL-1) de furanocumarinas presentes nas tinturas de D.multiformes presentes nas soluções orais A, B, C e D e as quantidades determinadas nas tinturas de D.brasiliensisX obtidas por maceração e percolação. ........................................................................................................... 105 x
  16. 16. LISTA DE ABREVIATURAS PUVA - Psoralen plus UVA P.A. - Pureza analítica CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-UV - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de ultravioleta CLAE-DAD - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de fotodiodos. CG - Cromatografia em fase gasosa CG-DIC – Cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama CG-EM - Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas UV - Ultravioleta UVA - Ultravioleta A RNA - Ácido ribonucleico DNA – Ácido desoxirribonucleico m – massa v – volume xi
  17. 17. RESUMO A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que tem crescido notadamente nestes últimos anos, criando a necessidade de garantir a eficácia, segurança e qualidade dos medicamentos fitoterápicos. O presente estudo desenvolveu metodologias para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos empregando CLAE-UV. Foram analisados medicamentos fitoterápicos na forma de soluções orais, cápsulas e comprimidos, os quais foram formulados, empregando espécies de Dorstenia ou Brosimum entre outras associações. Sete deles são indicados para tratamento de distúrbios menstruais ou menopausa. Três deles são utilizados para tratamento do vitiligo. Apenas um dos medicamentos possui informação sobre a presença de uma furanocumarina em sua composição nas bulas ou folhetos. Os métodos otimizados foram validados segundo as normas da International Conference on Harmonization, mostrando boa especificidade, acurácia, precisão e linearidade. O estudo interequipamento utilizando CG-DIC para soluções orais e CG-EM para cápsulas e comprimidos, não revelou diferenças estatísticas significativas. Devido a grande variedade das formulações dos medicamentos utilizados no desenvolvimento e validação dos métodos, sugere-se que estes possam ser utilizados para análise de psoraleno, bergapteno e 5-[3-(4,5-Diidro-5,5- dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona em outras formulações de fitoterápicos presentes no mercado. O estudo do perfil cromatográfico dos medicamentos foi realizado em condições isocráticas e em gradiente por CLAE-UV. Foram determinadas furanocumarinas em nove medicamentos analisados, o que oferece riscos à saúde pública devido ao desconhecimento da presença destas substâncias, na maioria destes produtos. Além disso, a furanocumarina encontrada em maior quantidade nos medicamentos estudados foi o psoraleno, considerado mais tóxico que a xantotoxina, normalmente prescrita pelos médicos para tratamento de doenças de pele. O uso de fitoterápicos contendo furanocumarinas no tratamento de distúrbios menstruais pode ser considerado de alto risco se for considerada a relação risco-benefício, pois se acredita que sejam indicados pelas propriedades anticoagulantes das cumarinas presentes nas plantas da formulação. Realizou-se também o estudo do perfil cromatográfico e dosagem de furanocumarinas em plantas presentes nas formulações dos medicamentos, utilizando tanto amostras adquiridas no comércio como amostras identificadas. xii
  18. 18. ABSTRACT The phytoterapy constitutes a form of medical therapy that notably have been growing in the last years, creating the necessity to guarantee the effectiveness, security and quality of phytomedicines. The present study has the development of methodologies for the determination HPLC of furanocoumarins in phytomedicines. Four oral solutions, three capsules and three tablets, all formulated using species of Dorstenia or Brosimum among others associations, were analyzed. Seven of them are indicated for the treatment of menstrual irregularities and disturbances related to menopause. The other three are used for the treatment of vitiligo. Only one of the medicines showed the information on the presence of furanocoumarin in its composition. The optimized methods were validated according to the International Conference of Harmonization, showing good specificity, accuracy, the inter- and intra-day precision and linearity. The inter-equipment study was performed using GC- FID for oral solutions and GC-MS for capsules and tablets. They did not displayed significant statistic differences. Due to the great variety in the formulations of the medicines used in the development and validation of the methods, it is suggested that they can be used for analysis of psoralen, bergapten and 5-[3-(4,5-Dihydro-5,5- dimethyl-4-oxo-2-furanyl)-butoxy]-7H-furo[3-2-g][1] benzopyran-7-one in the formulation of other phytomedicines found at commerce. The study of the chromatographic profile of medicines was evaluated in isocratic and gradient runs by HPLC-UV. Furanocoumarins were detected in nine of the medicines analyzed. The lack of knowledge of the presence of these substances in most of the analyzed products offers risks to the public health. Moreover, psoralen was the furanocoumarin found in the largest amount. Psoralen is considered more toxic than xanthotoxin, which is normally prescribed by doctors on the treatment of skin illnesses. If we consider the relation risk-benefit on the treatment of menstrual riots, the use of phytomedicines containing furanocoumarins can be of high risk, since it is believed that they are indicated because of the anticoagulation properties of coumarins found on the plant’s formulation. The study of the chromatographic profile and dosage of furanocoumarins in the plants found at the medicines’ formulation was also made, using identified samples and samples acquired at commerce. xiii
  19. 19. Introdução 1. INTRODUÇÃO 1.1. Introdução Geral A fitoterapia, uma forma de terapia medicinal, tem crescido notadamente nestes últimos anos, ao ponto que, atualmente, o mercado mundial de fitoterápicos gira em torno de aproximadamente 22 bilhões de dólares1. As plantas medicinais representaram, durante séculos, a única fonte de agentes terapêuticos para o homem. No início do século XIX, com o desenvolvimento da química farmacêutica, as plantas passaram a representar a primeira fonte de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos. Atualmente, 25% dos medicamentos prescritos nos países industrializados são originários de plantas e 120 substâncias de origem natural são obtidas a partir de cerca de 90 espécies de plantas utilizadas na terapia moderna. De fato, os produtos naturais estão envolvidos no desenvolvimento de 44% de todas as novas drogas 2. A partir de 2001, houve um ressurgimento do interesse nas plantas como fonte de novos agentes terapêuticos. Grandes companhias farmacêuticas aumentaram suas pesquisas com extratos de plantas para descobrir novas substâncias ativas. Existem na Terra aproximadamente 350.000 espécies de plantas, mas apenas uma pequena porcentagem foi investigada do ponto de vista fitoquímico, e um número ainda menor de frações derivadas dessas plantas foi analisada do ponto de vista farmacológico3. Na União Européia (sobretudo na Alemanha, França e Bélgica, países com maior tradição de consumo de fitoterápicos), o rigor da legislação e vigilância sanitária sobre os fitoterápicos é praticamente similar à exercida sobre os demais medicamentos. Os consumidores vêem os fitoterápicos como uma alternativa terapêutica menos agressiva ao organismo que um similar sintético, mas exigem de um fitoterápico a mesma qualidade (garantia de autenticidade, da presença do teor Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 1 Medicamentos Fitoterápicos.
  20. 20. Introdução correto de princípios ativos, de boas condições de conservação e outros) buscada nos medicamentos sintéticos4. No Brasil, as plantas medicinais são consideradas “remédios de baixo custo”, o que no país é encarado como sinônimo de má-qualidade4. Grande parte das espécies vegetais utilizadas pela população do Brasil não possui ação farmacológica comprovada, estudo químico realizado e nem mesmo estudos toxicológicos5. As plantas medicinais estão sujeitas a variações de sua composição química como alteração do teor de princípios ativos ou surgimento de novas substâncias devido a diversas variáveis a que estão dispostas durante seu crescimento (fatores genéticos, climáticos, ecológicos etc.), sua coleta (época, etc.), secagem (temperatura, tempo, etc.), armazenamento e processo de extração. Devido à grande variabilidade na composição química das plantas medicinais, há a necessidade de padronização dos fitoterápicos4. Um fitoterápico padronizado é o que apresenta teor conhecido dos princípios ativos e se enquadra dentro de critérios estabelecidos para a planta medicinal em questão. Apresenta substâncias “marcadoras” características, mas também não apresentam substâncias estranhas3,4 O ideal para elaboração de um fitoterápico é o uso de, no máximo, uma ou duas drogas ou extratos vegetais, tendo estes ação farmacológica e toxicidade conhecidas5. As principais fraudes e/ou problemas na qualidade dos fitoterápicos são: substituição de uma determinada espécie por outra semelhante, que pode não ter efeitos farmacológicos similares; adulteração de parte ou do todo da planta por outra espécie ou com outro material; desconsideração do prazo de validade do fitoterápico; contaminação exógena com micotoxinas, metais pesados ou pesticidas4. O uso de análises cromatográficas, utilizando o cromatograma como a “impressão digital” de uma determinada amostra, pode ajudar na identificação de amostras autênticas e auxiliar na identificação de possíveis compostos utilizados em uma adulteração da mesma3. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 2 Medicamentos Fitoterápicos.
  21. 21. Introdução 1.2. Furanocumarinas As cumarinas (Figura 1) são metabólitos secundários muito comuns presentes em plantas, sendo encontradas também em fungos e bactérias, totalizando 800 diferentes estruturas determinadas. Estruturalmente, são lactonas do ácido о-hidroxi-cinâmico (2H-1-benzopiran-2-onas), sendo o representante mais simples a cumarina (1,2-benzopiranona)7. Figura 1 – Estrutura básica das cumarinas. Dentro da classe de cumarinas, encontram-se as furanocumarinas. Estas substâncias são formadas pela condensação de um anel furânico com um núcleo cumarínico8 e podem ser de ocorrência natural ou sintéticos9. Estes metabólitos podem ser também fitoalexinas, já que sua formação é muitas vezes induzida na planta em resposta a um estímulo, particularmente pela infecção por fungos 10. Furanocumarinas têm várias atividades biológicas importantes como: analgésica, antiinflamatória, antibacteriana, antiviral, anticoagulante, além dos bem conhecidos efeitos fotosensibilizantes11. São também interessantes porque são usadas como um probe em biologia molecular e química dos ácidos nucléicos9. As furanocumarinas têm sido usadas desde tempos remotos no tratamento de doenças de pele como a psoríase, micoses fúngicas, dermatites e eczema. Embora a utilização de plantas contendo furanocumarinas para propósitos medicinais datem de 2000 a.C., atualmente o aumento no uso destas substâncias na medicina tem sido ligado à alta incidência de câncer de pele e outras desordens, Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 3 Medicamentos Fitoterápicos.
  22. 22. Introdução assim como trocas entre cromátides irmãs, mutação gênica e aberrações cromossômicas em humanos12. As furanocumarinas, como a maioria das cumarinas, são substâncias que absorvem fortemente energia na região do ultravioleta (UV) e, por isso, são altamente reativas sob incidência de luz. A faixa de comprimento de onda para essa fotorreatividade situa-se entre 300 e 400 nm (UVA). Após a absorção do fóton, as furanocumarinas formam um estado tripleto excitado, que pode reagir com moléculas, tais como as bases nitrogenadas do DNA ou com o oxigênio no estado fundamental. Disso resulta a formação de oxigênio singlete ou radicais tóxicos, como os radicais superóxido ou hidróxi. Essas moléculas podem reagir com DNA, RNA, proteínas e lipídios, ocasionando lesões nas células que os contêm. As furanocumarinas têm especial habilidade em se ligar à bases pirimídicas do DNA causando mutações12. Furanocumarinas lineares, são compostos fotosensibilizantes comumente empregados em dermatologia (oral ou topicamente), que associadas com irradiação ultravioleta A (UVA) são usadas no tratamento de doenças de pele 13. Psoraleno, bergapteno (também denominado 5-metoxipsoraleno ou 5-MOP), e xantotoxina (também denominado 8-metoxipsoraleno ou 8-MOP) são exemplos de furanocumarinas (Figura 2). Os distúrbios cutâneos de maior importância tratados com psoralenos são: o vitiligo (um distúrbio de pigmentação devido à perda de melanócitos da epiderme) e a psoríase (caracterizada pela proliferação aumentada das células epidérmicas)14. A combinação dos elementos: psoralenos + UVA é conhecida como terapia PUVA13. Dependendo da dose, esta ligação pode levar tanto à morte da célula como à replicação, síntese e reparo do DNA 15,16. O fotosensibilizador geralmente mais usado é xantotoxina (8-MOP)17. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 4 Medicamentos Fitoterápicos.
  23. 23. Introdução Figura 2 – Exemplos de furanocumarinas. A xantotoxina pode também interagir com o DNA na presença de UVA, formando fotoprodutos que causam a inibição da síntese de DNA celular. Acredita-se que este mecanismo pode explicar o efeito benéfico do PUVA nas desordens proliferativas como psoríase13. Na terapia PUVA, várias células são afetadas, inclusive linfócitos circulantes no sangue periférico, promovendo alívio de muitas doenças que são associadas a desordens imunológicas15. Além das furanocumarinas já citadas, a isopimpinelina (5,8- dimetoxipsoraleno) e o 4,5,8-trimetilpsoraleno também podem intercalar-se com o DNA na presença de luz UV18. Dentre as furanocumarinas, o 4,5,8-trimetilpsoraleno é considerado o mais fototóxico19,20, seguido por psoraleno, bergapteno e xantotoxina 21, enquanto isopimpinelina não é considerada uma furanocumarina fototóxica e também é considerada muito menos reativa22. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 5 Medicamentos Fitoterápicos.
  24. 24. Introdução Apesar do tratamento com a utilização de psoralenos (fotoquimioterapia ou PUVA) ter importante atividade terapêutica, os pacientes estão sujeitos a indesejáveis efeitos colaterais, tanto a curto prazo (eritema, hiperpigmentação, genotoxicidade) como a longo prazo (catarata, risco de câncer de pele) 9, o que têm feito médicos e pacientes relutantes ao seu uso 23. Mesmo 15 anos após a interrupção do tratamento não há significante decréscimo do risco de desenvolvimento de câncer de pele24. A exposição à luz ultravioleta deve ser atentamente supervisionada, pois existem relatos de casos de queimaduras de 6-40% do corpo em crianças com vitiligo que estavam em tratamento com óleo meladinina (mistura de 8-MOP e 8- isoamileno-oxi-psoraleno) devido à exposição não supervisionada ao Sol enquanto brincavam ao ar livre25. Outros casos de queimaduras de 90-95% do corpo de jovens pelo uso indiscriminado de furanocumarinas no intuito de adquirir um rápido bronzeamento26. Foram relatados também, casos de desenvolvimento de lesões bolhosas na pele após a exposição de um indivíduo ao óleo aromaterapêutico de bergamota (que contém bergapteno)27 em sauna, seguida de exposição à radiação UVA em salão de bronzeamento28. Quantidades baixas de furanocumarinas, como 18 ppm, podem causar lesões, dependendo das condições de exposição à luz UV 22. Por esta razão, é muito importante conhecer precisamente os níveis de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos e plantas utilizadas pelo ser humano. Na literatura podemos encontrar métodos de dosagem de furanocumarinas no plasma27 e na derme de pacientes que utilizam a fotoquimioterapia13. Também já estão descritos métodos validados de quantificação de furanocumarinas em pomadas, cremes29, soluções tópicas30 e alguns métodos não validados de dosagem em plantas31,32 e seus decoctos22. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 6 Medicamentos Fitoterápicos.
  25. 25. Introdução 1.3. Plantas contendo furanocumarinas Várias famílias de plantas são conhecidas como produtoras de furanocumarinas, dentre as quais podemos citar: membros da família Apiaceae (aipo, por exemplo), Rutaceae (plantas cítricas, por exemplo) e Moraceae 11. Os gêneros da família Moraceae são Sorocea, Clarisia, Maclura, Pseudolmedia, Helicostylis, Naucleopsis, Brosimum, Dorstenia, Ficus, Coussapoa, Pourouma e Cecropia 33. Os medicamentos fitoterápicos estudados neste trabalho apresentam os gêneros Dorstenia e Brosimum em suas composições. 1.3.1. Dorstenia O gênero Dorstenia Linne (Moraceae) é representado por 170 espécies em todo o mundo34,35, sendo 37 espécies brasileiras. Quase todas as espécies do gênero Dorstenia são herbáceas e campestres, geralmente crescendo em locais sombreados33. Há espécies que se destacam pela beleza ornamental e outras pelos rizomas aromáticos. A maioria se concentra no Brasil-sudeste à beira dos riachos e grotões rochosos36. A maior parte é conhecida pela medicina popular como “carapiá” ou “figueirilha”31. Estas plantas estão distribuídas nas regiões subtropicais do mundo e são conhecidas pela habilidade de sintetizar psoraleno, bergapteno, isobergapteno, pimpinelina e isopimpinelina37. O gênero Dorstenia é usado em terapia de plantas medicinais em muitos países na África e América do Sul e Central como antiofídico e anti-reumático, além do uso em infecções e doenças de pele30,38. O estudo das toxinas fotoativadas revelou a ocorrência de fototoxinas em todas as espécies de Dorstenia investigadas. Furanocumarinas foram isoladas em trabalhos com rizomas/raízes ou plantas brutas de Dorstenia da América Latina como: Dorstenia contrajerva39,40, D. brasiliensis41, D. asaroides31, D. brynoniifolia37,42, D. lindeniana43,34, D. vitifolia, D. tubicina41,32, D.cayapiaa7, D. heringeri44, D.excentria, D.drakena e D. lindeniana43 assim como Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 7 Medicamentos Fitoterápicos.
  26. 26. Introdução das espécies africanas D.psilurus45 e D.barnimiana46 e D. poinsettifolia47. Furanocumarinas também foram encontradas em galhos de D. prorepens35 e D. gigas34 e em folhas de D. gigas34. Estruturalmente, as furanocumarinas em Dorstenia apresentam-se pouco diversificadas, havendo predomínio de furanocumarinas angulares ou lineares simples tais como bergapteno, psoraleno, isopimpinelina, pimpinelina, isobergapteno etc. As exceções são três furanocumarinas preniladas encontradas em D. cayapiaa - 5-[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)butoxi-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona, D.brasiliensis – 5-[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)butoxi-7H-furo[3-2- g][1]benzopiran-7-ona (Figura 3, estrutura a) e o análogo insaturado 5-[[3-(4,5-diidro- 5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil) 2-butenil-]oxi]-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona (Figura 3, estrutura b)41 e D.contrajerva – 4-[[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)- butil]oxi]-7H-furo[3,2-g][1]benzopiran-7-ona43. Figura 3 – Furanocumarinas preniladas encontradas em Dorstenia brasiliensis. Estudos fitoquímicos do gênero relatam ainda a ocorrência de cardenolídios48, triterpenos37, ácidos graxos42, esteróides41, diferentes benzofuranos46 e vários flavonóides geranilados e prenilados49,50. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 8 Medicamentos Fitoterápicos.
  27. 27. Introdução 1.3.1.1. Dorstenia multiformes Dorstenia multiformes é a espécie descrita na Farmacopéia Brasileira51 com os nomes de carapiá, caapiá e contra-herva. Segundo esta, a parte usada é o rizoma, para produção de extrato fluído de carapiá. Na literatura52 podemos encontrar também a denominação de cayapiá- preto para a espécie. Possui caule curto, rasteiro e em parte subterrâneo, densamente estipulado, folhas longo-pecioladas, muito variáveis na forma, flores pequeninas e frutos castanhos. Encontrada da Bahia até o Rio Grande do Sul e Minas Gerais. Possui variedades, como D.multiformes var. arifolia, ceratosanthes, ficifolia, pinnatifida e ramosa36. Não há trabalhos na literatura sobre a composição química da espécie D. multiformes. A espécie pode ser encontrada53,54 como sinonímia científica de Dorstenia brasiliensis. 1.3.1.2. Dorstenia brasiliensis É uma planta herbácea perene, nativa do Brasil, encontrada em São Paulo, Goiás, Mato Grosso, Bahia, Pernambuco e, principalmente, em Minas Gerais e Rio Grande do Sul. Conhecida como cayapiá verdadeiro, é a mais importante do gênero, sob o ponto de vista terapêutico e a única admitida na farmacopéia de vários países52. Tem folhas compridas e de bordas arredondadas, nascendo bem próximas ao solo, e flores pequenas, divididas em masculinas e femininas, dispostas em forma de pendão55. Rizoma cilíndrico, ovóide, curto, aromático, fibriloso, amarelado 52. Possui variedades, como D. brasiliensis var. mayor, palustris, tomentosa e typica36. D. brasiliensis é conhecida no Brasil como carapiá, caiapiá ou contra-erva e as cascas de sua raiz têm sido usadas na medicina popular para o tratamento de doenças do sistema digestivo, febre tifóide56,55, como antiofídico, nas leucorréias, em enfermidades na pele, em irregularidades menstruais como dismenorréia e Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 9 Medicamentos Fitoterápicos.
  28. 28. Introdução amenorréia55,57 e na solidificação de ossos fraturados52, em mistura com a taiuiá (Trianosperma tayuya)55. Há apenas dois trabalhos sobre o isolamento de furanocumarinas da espécie41,56 que identificaram psoraleno, bergapteno, 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4- oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona, 5-[[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil- 4-oxo-2-furanil)-2-butenil-]oxi]-7h-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona), (2’S,3’R)-3’- hydroximarmesina 4’-O-β-D-glucopiranosida, (2’S)-marmesin 4’-O-α-L- rhamnopiranosil (1→6)-O-β-D-glucopiranosida, (2’S,3’R)-3’-hydroximarmesina, 2’-(1”- hidroxi-1”-metiletil)-psoraleno, 7-hydroxicumarina, 3-O-β-glucosilsitosterol, sucrose, esteróides, diterpenóides e triterpenóides das raízes/rizomas da espécie. Os triterpenóides (ácidos dorstênicos A e B) isolados de D. brasiliensis, apresentaram moderada citoxicidade sobre células da leucemia (L-1210 e HL-60)56. O nome popular “carapiá” também é encontrado referindo-se a outras duas espécies: Cordia superba Cham.58 da família Boraginaceae, encontrada no Rio de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo e Sida macrodon52, da família das Malváceas. A primeira espécie também pode ser encontrada com os nomes de árvore de ranho e grão de galo e a segunda, como malva do campo. 1.3.2. Brosimum gaudichaudii Brosimum gaudichaudii é uma espécie conhecida como “mamica de cadela”. Utilizada em doenças de pele devido às furanocumarinas59. É nativa do cerrado brasileiro, com uma ampla distribuição por todo o Brasil central 60. Análises da casca da raiz de B. gaudichaudii identificaram derivados dos ácidos cinâmicos e diidrocinâmico, dez cumarinas (dentre elas psoraleno, bergapteno, xantiletina, luvangetina e (+)-(2’S,3’R)-1’-hidroximarmesina) (Figura 4), uma chalcona, os esteróides: β-sitosterol e 3-β-O-β-D-glicopiranosil- β-sitosterol e o triterpeno β- amirina61,62. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 10 Medicamentos Fitoterápicos.
  29. 29. Introdução Figura 4 – Exemplos de cumarinas encontradas em Brosimum gaudichaudii. Extratos da casca do caule de B.gaudichaudii mostraram atividade mutagênica no teste com Salmonella typhimurium e em células do ovário de hamster chinês (CHO)63. O nome popular “mamica de cadela” também é encontrado referindo-se às espécies Zanthoxylum rhoifolium Lam. e Zanthoxylum riedelianum Eng. da família Rutaceae. Ambas são também conhecidas como mamica-de-porca e tembetari58. 1.4. Medicamentos Fitoterápicos Os medicamentos presentes no mercado contendo plantas do gênero Dorstenia são quase que exclusivamente compostos pela espécie Dorstenia multiformes. As indicações são diversas, devido os vários usos populares da espécie e as diversas indicações descritas nos medicamentos que a contêm:  os diversos usos populares do carapiá: antiofídico, tratamento de irregularidades menstruais, ossificação de ossos fraturados etc;  a associação da espécie a diversas outras na constituição dos medicamentos: D. multiformes está presente em soluções orais para inibição do crescimento de pêlos (associada à Foeniculum vulgaris, Trigonella foenum-graecum e Plumeria lancifolia), em soluções orais antitussígenas (associada à Passiflora alata), em formulações homeopáticas reguladoras do sistema nervoso (associada a Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 11 Medicamentos Fitoterápicos.
  30. 30. Introdução Carica pagaya, Acanthus volubilis e Mimosa virginalis), para tratamento das irregularidades menstruais, tensão pré-menstrual e inflamação do útero e ovários, (associada à Plumeria lancifolia), e em soluções orais e cápsulas para tratamento das irregularidades menstruais e corrimentos vaginais (associada à Plumeria lancifolia e Davilla rugosa) e contra os efeitos da menopausa (associada à Plumeria lancifolia, Erythrina mulungu, Cereus grandiflorus). Nenhum dos medicamentos fitoterápicos pesquisados, que contêm Dorstenia, informava sobre a presença de furanocumarinas ou mesmo a possibilidade de fotosensibilização pela exposição ao Sol durante o uso do medicamento ou de seus efeitos tardios pelo uso prolongado. A maior parte deles informava apenas as partes de cada planta utilizada e algumas classes de substâncias presentes tais como flavonóides, saponinas, taninos etc. Apenas alguns dos medicamentos informavam a presença de cumarinas em algumas das plantas presentes e sua ação anticoagulante, sem se referir, como já dito, a furanocumarinas. 1.4.1. Outras plantas presentes nos medicamentos estudados 1.4.1.1. Davilla rugosa Davilla rugosa Poiret (Dilleniaceae) é conhecida no Brasil como cipó- caboclo. Cresce em zonas tropicais e subtropicais no Brasil, Cuba, Nicarágua, Peru e Chile. A espécie é mundialmente empregada como antiinflamatório, anti-úlcera, purgativo, estimulante, afrodisíaco e droga tônica64. Segundo a medicina popular, suas folhas possuem propriedades adstringentes, diuréticas e colagogas, a raiz purgativa e drástica, os ramos excelente diurético e as sementes, violento efeito emético-catártico55. Flavonóides tais como miricetina, quercetina, miricetina-3-O-β-D- ramnosideo, quercetina-3-O-β-D-ramnosideo e canferol foram isolados das folhas e o alcalóide cafeína foi isolado das sementes. Estudos dos efeitos das frações do extrato hidroalcoólico do caule de D.rugosa em lesões gástricas em ratos sugerem a Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 12 Medicamentos Fitoterápicos.
  31. 31. Introdução atividade antiúlcera64. As frações mais polares do extrato da planta sugerem efeito estimulante na atividade motora65. Um efeito ansiolítico foi observado com o extrato hidroalcoólico inteiro65. O Doliscarpus pubens, uma espécie das Dileniáces, é chamada de cipó- caboclo-venenoso ou cipó-vermelho sendo seus frutos tóxicos e sua casca útil contra febres palustres55. 1.4.1.2. Plumeria lancifolia O gênero Plumeria originou-se da América Central e suas espécies são mundialmente distribuídas em países tropicais66. Plumeria lancifolia Müll (Apocynaceae) é conhecida na medicina popular como “agoniada” sendo empregada como febrífuga, emenagoga, purgativa 67, auxiliar da concepção e regularizador da menstruação55. O extrato mostrou possuir atividade antiúlcera. Desta espécie foram isolados iridóides, uleína e dimetoxiaspidospermina 67. 1.4.1.3. Erythrina mulungu Erythrina mulungu Mart., vulgarmente conhecida como mulungu, mulungu-coral, tiricero, capa-homem e suína-suinã, é uma planta espinhenta encontrada em Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso do Sul, São Paulo e na floresta latifoliada semidecídua da bacia do Paraná58. Na medicina popular, o extrato da casca é usado em banhos para acalmar a excitação do sistema nervoso e também para combater insônias. O cozimento das cascas é utilizado em bronquites asmáticas e nas inflamações do fígado e do baço 57. Extrato hidroalcoólico de Erythrina mulungu apresentou efeitos antinociceptivos em ratos68. Foram isolados alcalóides69. 1.4.1.4. Cereus jamacaru Cereus jamacaru, da família das Cactáceas, é um arbusto que vegeta em Pernambuco e outros Estados do norte do Brasil. É vulgarmente conhecida como Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 13 Medicamentos Fitoterápicos.
  32. 32. Introdução jamacaru, urumbeva e cumbela. É utilizada pela medicina popular em tratamento de problemas nas vias respiratórias, como bronquites, afecções pulmonares e tosses persistentes. Usa-se também contra o escorbuto e febres gástricas. Externamente, em cataplasmas, é utilizada no tratamento de úlceras e tumores70. 1.5. Legislação de Fitoterápicos O primeiro ato normativo de expressão referente às plantas medicinais no Brasil, foi a publicação da primeira edição da Farmacopéia Brasileira 51, que refletia as características da terapêutica da época, fundamentada em fitoterápicos e produtos biológicos, oficializando a utilização de plantas medicinais como matéria- prima farmacêutica71. A profissão farmacêutica e seu exercício foram normatizados através do Decreto nº 19606 de 19 de janeiro de 1931. Este decreto foi regulamentado pelo Decreto nº 20377 de 08 de setembro do mesmo ano, que marca o início formal das atividades de vigilância sanitária no país71. Com relação aos procedimentos de registro de medicamentos, o Decreto nº 19606 estabeleceu exigência de licença, que corresponde hoje ao registro, no órgão nacional de saúde antes de serem entregues ao consumo; estabeleceu ainda uma classificação dos medicamentos em oficiais e especialidades farmacêuticas, liberando os primeiros da necessidade de licença, sem definir o que seriam tais produtos, quais os limites dessa liberalização e os critérios ao controle administrativo e de qualidade. Determinava também, a apreensão e inutilização de plantas medicinais sob classificação botânica falsa ou desprovidas de ação terapêutica. Esses decretos estabeleciam o comércio direto de plantas medicinais de aplicações terapêuticas com o consumidor, como privativo de farmácias e ervarias71. No Brasil, houve então a constituição do Grupo de Estudos de Produtos Fitoterápicos (GEPFITO) em 1994, posteriormente alterada pela CONAFIT em 1998. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 14 Medicamentos Fitoterápicos.
  33. 33. Introdução O primeiro trabalho do GEPFITO foi a publicação de normatização de registro de produtos fitoterápicos por meio de uma proposta aberta de consulta pública em 1994, que resultou na Portaria SVS nº 6 de 31 de janeiro de 1995 71. A Portaria SVS nº 6 conceituou os fitoterápicos como medicamentos preparados exclusivamente por matérias ativas oriundas de plantas medicinais, obedecendo integralmente aos requisitos técnicos para a preparação farmacêutica e o uso terapêutico; padronizou os conceitos e termos técnicos próprios da área; estabeleceu padronização para qualquer fitoterápico, a cerca dos critérios de segurança e eficácia baseado em modelos farmacológicos adequados; fixou normas de qualidade para a matéria-prima, processamento e para o produto final. No pedido de registro, a empresa deveria apresentar as técnicas desenvolvidas para o controle de qualidade72. A Portaria SVS nº 6 foi aprimorada em alguns de seus itens pela SVS nº 1.029/98, cuja maior finalidade é o procedimento diferenciado ao registro de produtos fitoterápicos tradicionais71. A norma vigente, durante o desenvolvimento deste trabalho, sobre o registro de medicamentos fitoterápicos, foi a RDC nº 17 de 25 de fevereiro de 200073, que dispõe sobre registro de medicamentos fitoterápicos, não só nacionais, mas também importados. Regulariza o conceito de medicamento fitoterápico e define como devem ser industrializados, embalados e comercializados em nosso país. Apresenta o regulamento técnico que trata de medicamentos fitoterápicos novo, tradicional e com base na similaridade; da isenção de registro; da revalidação do registro de fitoterápicos registrados até 31 de janeiro de 1995; da embalagem e bula dos medicamentos. Para os medicamentos fitoterápicos importados, estabelece que devem cumprir os mesmos requisitos previstos neste regulamento e na legislação específica em vigor. O ano de 2002 apresentou várias consultas públicas74 que sugeriam mudanças no que se refere à legislação brasileira de medicamentos fitoterápicos. Na Consulta Pública nº 59 de 12 de agosto, sugeriu-se alterações na Resolução nº Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 15 Medicamentos Fitoterápicos.
  34. 34. Introdução 17/2000. As seguintes Consultas Públicas: nº 61/2002 e nº 84/2002 sugeriam atualização da normatização de registro de medicamentos fitoterápicos junto ao Sistema de Vigilância Sanitária. A Consulta Pública nº 84/2002 é por sua vez, complementada pelas Consultas Públicas nº 87/2002 e nº 88/2002 que trazem guias para a realização de alterações, inclusões e notificações pós-registro de medicamentos fitoterápicos e um guia para notificação de Lotes-Piloto de medicamentos. Estas consultas públicas, publicadas em outubro de 2002, não se transformaram em legislações em função das grandes controvérsias ainda existentes sobre o assunto. A Consulta Pública nº 94 de 6 de novembro de 2003 resultou na Resolução RDC nº48 de 16 de março de 2004 74. A Resolução RDC nº 4875 visa atualizar a normatização do registro de medicamentos fitoterápicos. Este regulamento abrange medicamentos cujos princípios ativos são exclusivamente derivados de drogas vegetais. Segundo a resolução, não é objeto de registro ou cadastro planta medicinal ou suas partes, após processos de coleta, estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada. Segundo a nova resolução, a partir de 360 dias contados de sua publicação, todos os testes referentes a controle de qualidade (quando terceirizados), deverão ser executados em instituições credenciadas no sistema REBLAS - Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde ou por empresas fabricantes de medicamentos que tenham certificado de BPFC (Certificado de Boas Práticas de Fabricação e Controle emitido pela ANVISA) atualizado e satisfatório. A partir desta data, a apresentação dos resultados destes testes será exigida pela ANVISA no registro e na renovação do registro. Estabelece também um regulamento técnico mais criterioso para os fitoterápicos quanto a medidas antecedentes ao registro, ao pedido de registro e medidas pós-registro. Em relação à legislação anterior, a nova resolução em demonstra mais detalhamento nas exigências sobre controle de qualidade química, estudos de toxicidade, eficácia e indicações terapêuticas dos medicamentos fitoterápicos. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 16 Medicamentos Fitoterápicos.
  35. 35. Introdução 1.6. Técnicas Instrumentais de Análise As aplicações da cromatografia cresceram de modo explosivo nos últimos cinqüenta anos e isto se deve não somente ao desenvolvimento de novos tipos de técnicas cromatográficas, mas também à necessidade crescente dos cientistas de melhores métodos para caracterizar misturas complexas76. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é a mais usada de todas as técnicas analíticas de separação devido a sua sensibilidade, fácil adaptação para determinações quantitativas acuradas, sua adequação à separação de espécies não-voláteis ou termicamente frágeis e, acima de tudo, sua ampla aplicabilidade a substâncias de grande interesse para indústria, para muitos campos da ciência e para o público. Exemplos desses materiais incluem: aminoácidos, ácidos nucléicos, pesticidas, drogas e muitas substâncias inorgânicas76. Na última década, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi uma das técnicas mais utilizadas para análise e isolamento de produtos naturais a partir de matrizes complexas, por exemplo, extratos de plantas. A CLAE tem sido utilizada de maneira rotineira como “piloto” para o isolamento em escala preparativa de produtos naturais pela otimização das condições experimentais, pelo controle de diferentes frações obtidas durante o isolamento e pelo controle da pureza final dos compostos isolados3. Detectores baseados em absorção de luz ultravioleta (UV), fluorescência, índice de refração, difração de luz e eletroquímica proporcionam boa detecção e sensibilidade. Uma desvantagem, apesar do custo menor desses detectores em relação aos detectores de espectrometria de massas (EM) e ressonância magnética nuclear (RMN), é a pouca ou nenhuma informação estrutural fornecida 3. A introdução das técnicas de acoplamento, tais como CLAE-UV equipada com detector com arranjo de fotodiodos (CLAE/UV-DAD) e o acoplamento com a espectrometria de massa (CLAE-EM) e ressonância magnética nuclear (CLAE-RMN) Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 17 Medicamentos Fitoterápicos.
  36. 36. Introdução proporcionou um real avanço na identificação estrutural, em linha, de produtos naturais3. A cromatografia em fase gasosa (CG) é muito utilizada na realização de separações com relação a sistemas bioquímicos, complexos orgânico-metálicos ou orgânicos, constituídos de espécies voláteis ou de espécies que podem reagir e formar produtos voláteis76. Dentre os detectores mais usados estão o de condutividade térmica, ionização por chama e captura de elétrons. O detector de ionização por chama é excelente na análise destes compostos orgânicos em nível de traços devido à seletividade por esses compostos77. A cromatografia em fase gasosa (CG) possui detectores universalmente aplicáveis como detectores de ionização por chama e de condutividade térmica 78. Os detectores da CLAE não possuem esta característica. Uma tendência importante é o acoplamento com a espectrometria de massa (CG-EM)76, apesar de seu alto custo se comparado com outros detectores empregados nesta técnica. 1.7. Validação de Métodos Analíticos A validação de um método analítico é realizada para garantir que uma metodologia analítica seja exata, específica, reproduzível e robusta dentro de uma faixa de aplicação em que o analito será analisado 79,80. Assegura credibilidade às medidas obtidas80,81,82. Tem se tornado requisito indispensável para publicação de novas metodologias, tendo alguns periódicos83 publicado os parâmetros mínimos de validação. A validação permite que a transferência de um método entre laboratórios ocorra da forma mais satisfatória82, pois avalia a influência de parâmetros como mudança de temperatura, pH, analistas, equipamentos, entre outros parâmetros no Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 18 Medicamentos Fitoterápicos.
  37. 37. Introdução resultado final de uma análise. Os mesmos princípios gerais podem ser aplicados com sucesso em métodos cromatográficos e não cromatográficos84. As normas internacionais, nacionais e sistemas de qualidade destacam a importância da validação de métodos analíticos e a documentação do trabalho de validação para a obtenção de resultados confiáveis e adequados ao uso pretendido85. Para validação de métodos analíticos, guias da US Food and Drug Administration (FDA)86,87,88, United States Pharmacopeia (USP)89 e Internacional Conference on Harmonization (ICH)90,91 entre outros, fornecem a descrição dos parâmetros principais. O uso da validação no desenvolvimento de novas metodologias tem aumentado consideravelmente em todo o mundo. No Brasil, o aumento do interesse pela validação gerou a necessidade da formulação pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária –ANVISA- da Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 79, que descreve os parâmetros a serem avaliados para a validação de métodos analíticos e bioanalíticos para determinação de fármacos e suas impurezas, podendo ser aplicado também a métodos imunológicos e microbiológicos. 1.7.1. Desenvolvimento do método Um protocolo de validação inicia-se com a definição do objetivo do 80 método : quais os resultados pretendidos (identificação, quantificação, etc.); qual matriz será utilizada (comprimido, ar, plasma, etc.); possíveis interferentes e quais os níveis de exatidão, precisão, sensibilidade, limite de detecção requeridos. Durante o desenvolvimento do método, identifica-se a (s) substância (s) de interesse na matriz e otimiza-se um método de extração. No processo de otimização, várias substâncias extratoras, formas e tempos de extração são testados. Após obtenção do método otimizado, realiza-se o procedimento de recuperação que avalia a eficiência do processo de extração. A recuperação Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 19 Medicamentos Fitoterápicos.
  38. 38. Introdução consiste em submeter a amostra com adição de diferentes concentrações da substância de interesse (analito) ao método otimizado para avaliar a porcentagem de recuperação. Uma boa recuperação do método garante que o analito seja analisado na totalidade de sua massa presente na amostra79,93,94. Para o monitoramento dos testes é necessário qualificar um equipamento analítico que seja compatível com a avaliação do analito (absorção atômica, cromatógrafo líquido, entre outros). Após a escolha do equipamento, realiza-se o teste de adequação do sistema que estabelece se os dados obtidos terão qualidade aceitável. No caso da cromatografia líquida de alta performance, por exemplo, o fator de capacidade, repetitividade de injeção, retenção relativa, resolução, fator de cauda e pratos teóricos devem ser avaliados80. Para a avaliação da estabilidade das soluções analíticas são testadas soluções de amostras e padrões durante 24 horas em condições de estocagem. A concentração das soluções de amostras e padrões não deve variar mais que 2% em relação a amostras frescas e seus cromatogramas devem ser equivalentes 80. 1.7.2. Parâmetros de validação Os principais parâmetros de validação são: especificidade, exatidão, precisão, linearidade, faixa de aplicação, sensibilidade, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. A seguir são descritos os parâmetros de validação de metodologias, segundo as principais referências citadas em artigos científicos. 1.7.2.1. Especificidade / seletividade Especificidade/seletividade é a capacidade de um método diferenciar um composto em presença de outros componentes da amostra (impurezas, intermediários de síntese, excipientes, produtos de degradação e componentes da matriz)93,94,95,96. Na literatura podemos encontrar uma diferenciação dos dois termos: especificidade refere-se a um método que produz resposta somente para um único analito, e seletividade diz respeito a um método que produz resposta para um Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 20 Medicamentos Fitoterápicos.
  39. 39. Introdução determinado número de substâncias químicas que podem ou não ser 82,94 79,86 distinguíveis . Algumas normas trazem os dois termos juntos ou optaram por um deles88,89,90. A seletividade / especificidade pode ser dividida em duas categorias: análises qualitativas e análises quantitativas. Para análise qualitativa é necessário demonstrar a capacidade de seleção do método entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes79,90. Para análise quantitativa e análise de impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados obtidos de amostras fortificadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras não fortificadas, para demonstrar que o resultado do teste não é afetado por esses materiais. Estas comparações devem incluir amostras armazenadas sob condições de estresse (por ex. luz, calor, umidade, hidrólise ácida/básica, oxidação) 79,90,95. A determinação da especificidade é extremamente importante durante a validação de um método não cromatográfico, porque este não contém uma fase de separação que garanta a não interferência dos excipientes. Os métodos não cromatográficos contam com diferenças intrínsecas às propriedades físicas ou químicas, para garantir sua capacidade de determinar a concentração da substância em exame, mesmo em amostras contendo misturas complexas84. Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias para garantir a separação dos picos cromatográficos. A utilização de testes de pureza de pico (por exemplo, com auxílio de detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas) é interessante para demonstrar que o pico cromatográfico é atribuído a um só componente79,90,95. 1.7.2.2. Limite de quantificação (LQ) Limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas79,81,82,88,93,94,95. É um parâmetro determinado Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 21 Medicamentos Fitoterápicos.
  40. 40. Introdução principalmente, para ensaios quantitativos de impurezas e produtos de degradação, sendo expresso em concentração do analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/v, partes por milhão) na amostra79. Várias metodologias para a determinação do LQ são possíveis, dependendo do procedimento ser instrumental ou não. Os modos atuais mais aceitáveis são descritos a seguir: a) baseado na avaliação visual: é determinado pela análise de várias amostras com quantidades conhecidas de analito, estabelecendo-se o nível mínimo em que pode ser quantificado com aceitável exatidão e precisão. É utilizado principalmente para métodos não instrumentais90. b) baseado na relação sinal-ruído (Figura 5): pode ser aplicado somente em procedimentos analíticos que exibem ruído de linha de base. É determinado pela comparação da medida dos sinais de amostras com baixas quantidades conhecidas de analito, estabelecendo-se a mínima concentração em que o analito pode ser quantificado com confiabilidade. A relação sinal-ruído típica é 10:1 (concentração do analito que produz sinal 10 vezes superior ao ruído da linha de base) 79,90,95. Figura 5 – Pico de CLAE-UV representando uma relação sinal-ruído de 10:1. c) baseado no desvio padrão da resposta e no coeficiente angular da curva de calibração: o LQ pode ser expresso como LQ = 10 (DP/S), onde S é a inclinação da curva de calibração e o DP é o desvio padrão da resposta que pode ser determinado com base no DP do branco79,82,90,95, no DP da análise de amostras Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 22 Medicamentos Fitoterápicos.
  41. 41. Introdução com baixas quantidades de analito84, no DP do residual da linha de regressão90,95 ou no DP da intersecção do y das linhas de regressão79,90,95. Para este último cálculo do DP, são necessárias, no mínimo, três curvas de calibração contendo concentrações do analito próximas ao suposto limite de quantificação79. A relação 10 DP é associada a um erro de 30% com 99% de probabilidade97. O termo limite observado de quantificação (LOQ) pode ser encontrado em análises de resíduos98. Um outro termo encontrado na literatura é o limite inferior de quantificação (LIQ) utilizado em análises de matrizes biológicas79,88. 1.7.2.3. Limite de detecção (LD) Limite de detecção é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser detectada, porém não necessariamente quantificada, sob as condições experimentais estabelecidas. Pode ser determinado com base na avaliação visual 79,90, na relação sinal- ruído, cuja relação sinal-ruído típica é 2:188,89,90 ou 3:179,89,90 ou ainda, pode ser expresso como LD = 3,3 (DP/S)90, onde S é o coeficiente angular da curva de calibração e o DP é o desvio padrão da resposta que pode ser determinado pelos mesmos métodos descritos para LQ. A relação LD = 3 (DP/S) também é encontrada na literatura79. Na determinação pela relação 3,3 ou 3 DP/S, o resultado será um verdadeiro reflexo do limite de detecção se S for bem definido e a intersecção for essencialmente zero82. 1.7.2.4. Linearidade e faixa de aplicação Linearidade é a habilidade do método produzir resultados diretamente proporcionais à concentração do analito num dado intervalo de variação 81,90,94,95,96. Intervalo é a faixa de variação entre o maior e o menor nível de analito que demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade usando o método descrito79. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 23 Medicamentos Fitoterápicos.
  42. 42. Introdução Para análise da linearidade do método, recomenda-se o número de cinco 79,90 concentrações em replicata (n>2) nas seguintes faixas mínimas de variação: para doseamento, 80 a 120% da concentração do teste 79,86,90; para teste de impurezas, do nível esperado até 120% do limite máximo especificado; em análises de resíduos, de ½ a 5 LOQ98; em testes de uniformidade de conteúdo: 70 a 130%79,90 e em ensaios de dissolução: ± 20% em relação à faixa de variação do teste79,90. Em toxicologia os limites devem se adequar às quantidades a serem controladas79,86,90. A linearidade pode ser demonstrada pelo exame visual do gráfico (Figura 6) que relaciona os sinais obtidos na análise e a concentração do analito 79,88. A equação da reta é definida por: y = ax + b 93, onde y= resposta do analito, x= concentração, a= coeficiente angular e b= coeficiente linear. Figura 6 – Curva de calibração por padrão externo. A avaliação da linearidade pode ser realizada de diversas formas dependendo da natureza da análise: a) pela construção de curva de calibração a partir de soluções-padrão (padrão externo) de analito em diferentes concentrações81 (Figura 6). Relaciona a resposta do aparelho com a massa do analito 81,94 sem levar em conta a interferência da matriz94. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 24 Medicamentos Fitoterápicos.
  43. 43. Introdução b) pela construção da curva de calibração com adição do analito à matriz, a qual elimina a interferência da matriz e de outras etapas do método 94. O analito pode ser adicionado na etapa inicial do método ou na fase final, imediatamente antes da realização da medida pelo equipamento. Geralmente é utilizada quando há impossibilidade de se obter uma matriz branca (sem a presença do analito) (Figura 7)81,94. Neste caso, o intercepto da curva no eixo y (coeficiente linear) corresponde ao sinal do analito presente na matriz sem adição81. Figura 7 – Curva de calibração por adição de padrão na matriz contendo o analito c) pela construção da curva de calibração com adição de padrão interno. A curva é construída a partir de soluções-padrão de analito em diferentes concentrações, nas quais é adicionada uma concentração fixa de padrão interno 81,94 (Figura 8), cuja medida permite comparação relativa com o analito. O padrão interno é uma substância de tempo de retenção próximo e boa resolução em relação ao analito, alta pureza e estabilidade81,94. Figura 8 – Curva de calibração com adição de padrão interno. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 25 Medicamentos Fitoterápicos.
  44. 44. Introdução Havendo relação linear aparente, os resultados deverão ser tratados por métodos estatísticos apropriados para determinação da soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear, do coeficiente de correlação, da intersecção com o eixo y, do coeficiente angular e desvio padrão relativo79,90. Figura 9 – Regressão linear de uma curva de calibração. Reta vermelha, reta ideal estimada por regressão linear. A regressão linear (método dos mínimos quadrados) (Figura 9) é uma forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente93, geralmente realizada por programas computacionais. O coeficiente de correlação (r) expressa a relação de x e y na curva, em que os valores ideais esperados são 1 e –1 , ou seja, quanto mais próximo da unidade maior a relação, maior a probabilidade de existir uma relação linear definida. Caso os valores tendam a zero, indica que não há relação linear 15. Alguns critérios mínimos aceitáveis são r= 0,9979 e  0,99986. A maioria dos artigos avalia a linearidade pelo coeficiente de determinação: o quadrado do coeficiente de correlação (r2)99,100,101. 1.7.2.5. Sensibilidade Pode-se definir sensibilidade como sendo a capacidade de um método distinguir, com determinado nível de confiança, duas concentrações próximas 81,86,94. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 26 Medicamentos Fitoterápicos.
  45. 45. Introdução Na literatura há uma divergência sobre o conceito de sensibilidade que pode ser definido pela determinação dos limites de quantificação e detecção 81,96 ou pela coeficiente angular da curva de calibração 82,94,95. Segundo os defensores do segundo conceito, sensibilidade não é uma referência ao conceito atual de limite de detecção e quantificação. Pode ser utilizada como parâmetro comparativo entre dois métodos. Quanto maior for o coeficiente angular da curva de calibração, maior a sensibilidade do método82,94. 1.7.2.6. Exatidão Exatidão é o grau de concordância ou compatibilidade entre o valor médio dos resultados e o valor de referência aceito79,81,82,86,93,94,95,96. O cálculo é realizado pela fórmula79: %Exatidão = Concentração média experimental 100% Concentração de referência aceita ou em termos de inexatidão94: %Inexatidão = Concentração obtida – Concentração esperada 100% Concentração esperada Os termos exatidão e acurácia são utilizados como sinônimos, sendo o termo exatidão mais comum na literatura brasileira. Apenas uma das literaturas consultadas designa acurácia como a medida que combina precisão e exatidão82. Várias formas de avaliação da exatidão estão disponíveis: análise de amostra de concentração conhecida (padrão de referência) e comparação dos dados com o valor verdadeiro79,90,95; comparação dos dados do método novo com os de uma metodologia bem caracterizada de exatidão estabelecida 79,90,95; recuperação Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 27 Medicamentos Fitoterápicos.
  46. 46. Introdução de quantidades conhecidas de analito adicionadas a matrizes brancas 79,90,95 e recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas a matrizes com o analito79,90. Este último é mais utilizado quando há impossibilidade de obter matriz branca, como por exemplo, em medicamentos fitoterápicos. %Recuperação = Concentração obtida 100% Concentração adicionada Recomenda-se que a análise da exatidão seja realizada com nove determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 concentrações, baixa, média e alta, com 3 réplicas cada79,90,96. Na literatura podemos encontrar os níveis de concentração baixo, médio e alto indicados como 80, 100 e 120% da concentração usual da amostra 86. A concentração recomendada para avaliação da exatidão varia de acordo com as matrizes ou quantidade de analito na amostra. Na avaliação de recuperação de resíduos de pesticidas por exemplo, recomenda-se que as três concentrações sejam: 1L OQ, 2 LOQ e 10 LOQ 98. Valores de exatidão de 98 a 102% são recomendados para métodos de doseamento, inclusive de produtos farmacêuticos96. No caso de dosagem de impurezas: 0,1% absoluto ou 10% relativo80. Para resíduos: 70 a 120% de exatidão98. Em análises bioanalíticas considera-se valores  15%, ou  20% no LQ79,88. 1.7.2.7. Precisão Precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas do método79,82,93. É calculada pelo coeficiente de variação (CV): %CV = desvio padrão das medidas 100% concentração média determinada Pode ser avaliada em três níveis: repetitividade, precisão intermediária e reprodutividade. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 28 Medicamentos Fitoterápicos.
  47. 47. Introdução  Repetitividade: expressa a precisão entre os resultados de medidas do mesmo método para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador usando mesmo equipamento em um curto intervalo de tempo79,82,86,90,93,94,95. Deve ser avaliada pela análise de amostras em 3 concentrações em triplicata contemplando intervalo linear ou 6 determinações a 100% da concentração teórica da amostra79,80,90,95. Amostras autênticas são utilizadas para evitar diferenças devido à interação entre o analito e a matriz 94. Em análises bioanalíticas utiliza-se 3 concentrações em quintuplicata79,80,90. A repetitividade do instrumento também deve ser avaliada através de 10 injeções de uma mesma amostra86. Para doseamento recomenda-se que a variação seja  2% e a precisão do instrumento  1%80. No caso de impurezas,  5% no LQ e a precisão do instrumento 10%80. Em análise de resíduos valores até 20% são aceitos98.  Precisão intermediária expressa a precisão dos resultados obtidos usando o mesmo laboratório, mas em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes79,81,82,86,90,95,96. Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes79,94. O uso de amostras autênticas também é indicado90.  A reprodutividade expressa a precisão dos resultados obtidos pelo mesmo método e mesma amostra, por diferentes operadores, usando diferentes equipamentos em diferentes laboratórios79,82,90,93,94,95. Geralmente avaliada em estudos colaborativos, aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias 79,90. O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores superiores a 5%79. Em análises bioanalíticas, o valor limite é 15%, sendo no LIQ, valores menores ou iguais a 20%79,88. Alguns aspectos da precisão, como precisão intermediária e reprodutividade, estão intimamente associados à robustez do método 82. Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 29 Medicamentos Fitoterápicos.

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