Recolección y criopreservación de células madre de médula ósea

1. AFÉRESIS DE PROGENITORES
HEMATOPOYÉTICOS
Ubaldo Bedoya M.- Bacteriólogo
M. Sc. Biotecnología
Versión 003

2. AFERESIS
Técnica mediante la cual se separan los componentes de la
sangre, siendo seleccionados los necesarios para su aplicación
en medicina y devueltos al torrente sanguíneo el resto de componentes.
El objetivo de este proceso es recolectar los PH y conservarlos hasta el
momento de la reinfusión con el fin de hacer un rescate de la función
hematopoyética.
La recolección de PH requiere la administración de citocinas debido a que
su concentración en sangre periférica es muy baja además de un equipo
separador de células.
Carreras, E. et al. Man Trasp Hemop 3ª ed.
2004
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Versión 003

3. AFERESIS
Criterios para la aceptación de donantes sanos de PH
• Controles previos de Hb > 11g/dL , plq > 150.000/mL
resultados negativos de HCV, HBsAg y VIH 10 días anteriores.
• Si no se consigue la celularidad necesaria con un solo proceso
de aféresis y es necesario repetir el procedimiento, el recuento
de plaquetas debe ser mayor a 100.000/mL
• La edad no debe suele ser un factor limitante.
Momento del comienzo
Por calendario:
• G-CSF por lo general al 4 o 5 día de movilización.
• Con QT: depende del esquema, entre 9 y 14 días post QT
Según recuento periférico de CD34+ > Mayor a 15 cel/uL
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4. AFERESIS
El equipo separa las células por centrifugación en sus
distintos componentes por gradientes de densidad.
 VST
= Peso * Cte.
 VP
= 3-4
 # ciclos
= VST * VP/ 1000
 El anticoagulante de preferencia es ACD-A.
 Se hacen 3 volemias máximo 4. Depende de la tolerancia del
paciente. Depende del CD34+
La tasa de mortalidad es bastante baja, tres muertes
estimadas por 10.000 procedimientos*
J Clin Apher. 1990;5(2):70-73
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Versión 003

5. Separación de componentes
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6. Conexión del paciente al citoseparador
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7. Criterios de recolección de PH
Para iniciar el proceso de recolección de PH es necesario que el
paciente haya sido catalogado como buen movilizador. CD34+ > 10
cel/μL
5° o 9° día de movilización
Catéter y recogida
Actualmente, se considera mínima una concentración de 2 x 106 células
CD34+/kg de peso corporal la cual se obtiene en el 94% de los casos con
un recuento de CD34+ preaféresis >20 x 106 cel/uL
Concentraciones menores a esta se relacionan con retraso en
recuperación de plaquetas. Correlación positiva con el arraigo o
prendimiento del injerto*
Eur J Haem. 2008. 80(9): 287-295.

8. Criterios de recolección de PH
La ultima dosis de filgrastin o lenograstim debe ser
administrada 2 o 3 horas antes del conteo en
sangre periférica y 3 o 4 horas antes de la aféresis
programada.
Pierelli et al. TRANSFUSION. 2012.

9. Criterios de recolección de PH
Constantes según sexo y peso
C
D
34
P
R
E
A
F
E
R
E
S
I
S
0
5
10
15
20
25
30
38
50
70
80
90
110
130
160
200
250
300
1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,3
1,7
2,4
2,8
3,2
3,9
4,5
5,7
7,2
9
10,9
2
0,3
0,5
0,8
1
1,3
1,5
1,9
2,5
3,5
3,9
4,4
5,4
6,4
7,9
9,8
12,3
14,7
VOLEMIAS
PROCESAD
AS
3
0,5
0,8
1,1
1,4
1,7
2
2,5
3,3
4,5
5,1
5,7
6,9
8,2
10
12,4
15,5
18,6
4
0,7
1,1
1,5
1,8
2,2
2,6
3,2
4
5,5
6,2
7
8,4
9,8
12,1
15,1
18,7
22,4
5
1
1,4
1,8
2,3
2,7
3,1
3,8
4,8
6,5
7,4
8,3
10
11,7
14,3
17,7
22
26,3
Sexo
masculino
Femenino
6 Predicción
1,2
1,7
C
2,2
D
2,7
34
3,2
3,6
P
4,4
O
5,6
S
7,6
8,5
A
9,5
F
11,5
E
13,4
R
16,4
E
20,3
S
25,2
I
30,1
S
VOLUMEN SANGUINEO(mL/Kg de peso)
Obeso
Delgado
Normal Muscular
60
65
70
75
55
60
65
70
Predicción de CD34+
Pos aféresis basado
en el recuento previo
en sangre periférica

10. Ejemplo
Paciente varón con 67 kg
CD34+ en aféresis = 1640/μL
Vol. de la aféresis = 200 mL
Viabilidad = 0,998
# cel/kg peso = cel/μL * Viab * Vol * 1000
Peso pte
= 1640*0,998*200*1000
67
= 4.885.731 cel/kg peso
> 4 x 106 cel/Kg peso IDEALES
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11. Ventajas y desventajas
Sangre periférica
Médula ósea
Sin anestesia
Extracción única
Arraigo más rápido
Sin catéteres
Menos células tumorales
Sin citocinas
Requiere más de una
aféresis
Requiere anestesia gral.
Se requiere catéter
Arraigo mas lento
Hemorragias, embolias e
infecciones
Mayores tasas de morbi/mort

12. Efectos adversos
 Toxicidad del citrato: hipocalcemia
 Trombocitopenia
 Hipovolemia
 Mal funcionamiento del catéter.
 Infección

13. Recomendaciones

Se realiza hemograma post-aféresis:
Plaquetas – Hemoglobina – Leucocitos.

Realizar hemocultivo a las unidades de PH para descartar contaminación.

La mezcla del citrato + heparina disminuye los efectos colaterales del ACD
que cuando se emplea solo.

No emplear en caso de historial de reacciones anafilácticas, antecedente
de enfermedad autoinmune o inflamatoria.

14. Unidad de progenitores hematopoyéticos

15. C R I O P R E S E R VA C I Ó N
El objetivo principal de la criopreservación de los progenitores
hematopoyéticos es mantener la viabilidad y funcionabilidad de las
células a bajas temperaturas durante cortos períodos de tiempo o
incluso décadas.

16. Temperatura de conservación
4º C:
Empleo a corto plazo
↓ viabilidad 5% en 24H
50 -70% en 7 días
-80º C: Empleo antes de 6 meses
-196 º: >6 meses
4°C
- 30°C
- 80°C : mejor viabilidad
Nevera a -84 C.

17. Lesión por congelación




Daño mecánico por formación de hielo intra y extracelular
Daño mecánico por expansión térmica
Hiperosmolaridad extracelular y deshidratación
Desnaturalización de proteínas

18. Lesión por congelación
Daño osmótico (deshidratación)
Espacio extracelular
normosmótico.
Célula sanguínea
normosmolar.
Centros de nucleación
de hielo.
Célula sanguínea
deshidratada.
Espacio extracelular
hiperosmolal.

19. Lesión por congelación
Daño mecánico
Célula
sanguínea.
Centros de nucleación
de hielo.
Célula sanguínea
destruida.

20. CRIOPROTECTORES
Características:
 Sustancias muy hidrosolubles
 Baja toxicidad
 Disminuyen punto eutéctico de una solución

T mínima a la que una solución esta en estado liquido
 Pueden ser penetrantes y no penetrantes

21. CRIOPROTECTORES
Las substancias crioprotectoras más utilizadas son:





DMSO (dimetilsulfóxido).
Proteínas.
Soluciones salino/glucosadas.
HES (hidroxietilalmidón).
Glicerol.
Transfus Med Hemother 2011;38:107–123

22. CRIOPROTECTORES
Espacio extracelular
normosmótico.
Molécula de
DMSO.
Célula
sanguínea.
Célula sanguínea
con poco estrés
osmótico.
Centros de nucleación
de hielo.
Espacio extracelular
ligeramente
hiperosmolal.

23. Propiedad coligativa de los solutos.
0ºC
Solución eutéctica
(con menor punto de
congelación).
0ºC
Solución
.superenfrianda
Centros de nucleación
de hielo.
0ºC
0ºC
Solución eutéctica con
más solutos segregados
(aún con menor punto
de congelación).

24. CRIOPRESERVACIÓN DE PHSP
• DMSO utilizado a una concentración final del 5-10% en
solución proteica ( plasma autólogo o albumina humana)
• DMSO tóxico celular > 4 C: mezcla de las soluciones
celular y criopreservante se hace a 4 C
• Mezcla de DMSO y fracción proteica: 30 minutos antes.

25. CRIOPROTECTORES
PROTEINAS
• Aumentan la supervivencia de las células ya que
modifican la viscosidad y la temperatura de la
transición hialina de la solución crioprotectora.
• La fuente puede ser autóloga: plasma
• Albumina humana al 4%

26. ALMACENAMIENTO
• Congeladores mecánicos de-120 a -86 C
• Almacenamiento de células criopreservadas es en bolsas de plástico
de PVC/poliolefin y en frascos de polietileno.
De la bolsa de recolección a la de criopreservación

27. DESCONGELAMIENTO
Descongelamiento rápido
 Se tiene mejor viabilidad celular con descongelamiento rápido
 Se colocan las bolsas en baño de maría entre 37 y 42 C. Agua
destilada.
 Cerciorarse de que toda la bolsa quede sin grumos.
 Se realiza en la habitación del paciente.
 El orden de descongelación/infusión de las bolsas (en caso de ser +
de una) será de mayor a menor celularidad CD 34+.

28. CONTROL DE CALIDAD
Prueba de viabilidad por exclusión con tinción azul de
trípano o citometría de flujo: CD34+ y 7AAD
La viabilidad post aféresis permite compararla con la
pre-aféresis
Ideal superior al 90%

29. BIBLIOGRAFIA
1. Smith DM, Ness MJ, Landmark JD, Haire WW, Kessinger A. Recurrent neurologic symptoms during
peripheral stem cell apheresis in two patients with intracranial metastases. J Clin Apher. 1990;5(2):70-73.
2. Movilización y aféresis de las células madre hematopoyéticas: Guía práctica para el personal de
enfermería y otros profesionales de la atención sanitaria relacionados. EBMT. 2009.
3. Carreras, E. et al. Manual de Trasplante Hemopoyético. 3° Ed. Pag 259-263. 2004.
4. Conference report: Best practice for peripheral blood progenitor cell mobilization and collection in adults
and children: results of a Società Italiana Di Emaferesi e Manipolazione Cellulare (SIDEM) and Gruppo
Italiano Trapianto Midollo Osseo (GITMO) consensus process_3385. 2011
5. Esa Jantunen, Taru Kuittinen. Blood stem cell mobilization and collection in patients with
lymphoproliferative diseases: practical issues. Eur J Haem. 2008
6. Armitage, S. et al. CD34 counts to predict the adequate collection of peripheral blood progenitor cells.
Bone Marrow Transplant 1997;20:587–91.
7. Cryopreservation of Human Stem Cells for Clinical Application: A Review Transfus Med Hemother
2011;38:107–123.
8. Pierelli et al. Best practice for peripheral blood progenitor cell mobilization and collection in adults and
children: results of a Società Italiana Di Emaferesi e Manipolazione Cellulare (SIDEM) and Gruppo
Italiano Trapianto Midollo Osseo (GITMO) consensus process_3385 1..13. TRANSFUSION. 2012

30. Gracias
#aferesisTAMO
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