Sistema abo e fator rh uma revisao bibliografica

1. FUNDAÇÃO EDUCACIONAL DE FERNANDÓPOLIS - FEF FACULDADES INTEGRADAS DE FERNANDÓPOLIS - FIFE CURSO DE FARMÁCIA EDMIR GERALDO DE SIQUEIRA FRAGA FLÁVIA VALÉRIO DOS SANTOS OLIVEIRA SISTEMA ABO E FATOR Rh: Uma revisão bibliografica Fernandópolis 2011

2. EDMIR GERALDO DE SIQUEIRA FRAGA FLÁVIA VALÉRIO DOS SANTOS OLIVEIRA SISTEMA ABO E FATOR Rh: uma revisão bibliografica Monografia apresentada a Fundação Educacional de Fernandópolis, como pré- requisito para a obtenção do título de Graduação em Farmácia Orientador: Prof. Dr. Anísio Stori Fernandópolis 2011

3. FOLHA DE APROVAÇÃO EDMIR GERALDO DE SIQUEIRA FRAGA FLÁVIA VALÉRIO DOS SANTOS OLIVEIRA SISTEMA ABO E FATOR Rh: UMA VISÃO SISTEMÁTICA Monografia apresentada a Fundação Educacional de Fernandópolis, como pré- requisito para a obtenção de graduação em Farmácia. Aprovada em: ___/___/2011 Examinadores: ___________________________________________ Prof. Ms. / Dr. Fundação Educacional de Fernandópolis Faculdades Integradas de Fernandópolis ___________________________________________ Prof. Ms. / Dr. Fundação Educacional de Fernandópolis Faculdades Integradas de Fernandópolis ___________________________________________ Prof. Ms. / Dr. Fundação Educacional de Fernandópolis Faculdades Integradas de Fernandópolis

4. DEDICATÓRIA Dedico em primeiro lugar a Deus, por estar ao meu lado em todos os momentos dessa caminhada, pelas alegrias aqui alcançadas em minha vida. Aos meus Pais, Ademir e Edna, que sempre me apoiaram em tudo e estiveram comigo em todos os momentos de minha vida, seja profissional ou como cidadão. E a minha esposa Deila pelo carinho, apoio, compreensão, sendo para mim uma companheira, conselheira e que acreditou em mim em todos os momentos necessários dessa trajetória de Vida Profissional e Pessoal. Edmir Geraldo de Siqueira Fraga

5. AGRADECIMENTOS Agradeço a minha amiga de Monografia Flávia Valério dos Santos Oliveira pela amizade e compreensão, passado esses anos de Graduação sendo uma boa parte de minha História. Aos professores da Fundação Educacional de Fernandópolis pela atenção e dedicação, em especial ao Dr. Anísio Storti, que me orientou e ajudou na realização desse trabalho, sendo um amigo de todas horas. Agradeço ao professor Dr. Marcos de Lucca Júnior, pela amizade desde a graduação em Biomedicina, sendo uma referência de conduta. Aos meus Pais, que tanto me apoiaram na realização de mais uma etapa de minha vida. A minha esposa pela dedicação, apoio e compreensão, sendo uma auxiliadora em todos os momentos. Em especial, agradeço a Deus por estar ao meu lado, por me conduzir nos caminhos do aprendizado e da Vida. Edmir Geraldo de Siqueira Fraga

6. “Um homem só pode descobrir novos oceanos se tiver coragem de perder a terra de vista.” (Myles Munroe)

7. RESUMO FRAGA, E.G.S. OLIVEIRA, F.V.S.; SISTEMA ABO E FATOR Rh: UMA VISÃO SISTEMÁTICA. 2011. 79 f. Monografia (Graduação em Farmácia) - Faculdades Integradas de Fernandópolis, Fundação Educacional de Fernandópolis, Fernandópolis-SP, 2011. Comprovando que havia diferenças no sangue de diversos indivíduos com a descoberta dos grupos sangüíneos no início do século XX, foi possível explicar então por que algumas pessoas morriam depois de transfusões de sangue e outras não. Os tipos sangüíneos são determinados pela presença, na superfície das hemácias, de antígenos que podem ser de natureza bioquímica variada, podendo ser compostos por carboidratos, lipídeos, proteínas ou uma mistura desses compostos. A determinação laboratorial dos grupos sanguíneos ABO e Rh era originalmente realizada fazendo-se reagir as hemácias do paciente com soros Anti- A, Anti-B e Anti-D produzidos em laboratório, em lâminas limpas de microscopia. Entretanto, no Brasil, determinou-se pela legislação que as provas de aglutinação não sejam feitas em lâminas, mas sim por métodos mais precisos, como os métodos em microplacas escavadas e/ou em tubos de ensaio, ou o método da gel- centrifugação, mais recente. É preconizada a realização da Prova direta e da Prova reversa no caso do Sistema ABO e Prova de Coombs no caso do Sistema Rh, se o mesmo apresentar negativo, possibilitando assim distinguir sorologicamente o antígeno RhD fraco de alguns antígenos RhD parciais presente na amostra. Encontramos no Sistema ABO o grupo sangüíneo hh, também chamado de grupo sangüíneo de Bombaim (Fenótipo de Bombaim), um grupo sangüíneo raro. Os indivíduos hh não expressam o antígeno H, que é encontrado no grupo sangüíneo O. Como resultado não consegue produzir quer o antígeno A, quer o B, nos seus glóbulos vermelhos, sendo, portanto conhecidos como “Falso O”. Não existem anticorpos naturais no sistema Rh, sendo os anticorpos presentes apenas nos indivíduos sensibilizados por inoculação prévia. A inoculação pode ocorrer por episódios de transfusão incompatível ou, na mulher, devido à introdução, no sangue materno da mãe Rh negativo, de hemácias provenientes de uma gravidez ou aborto de filho Rh Positivo levando a criança a ter a doença Hemolítica do Recém-nascido ou Eritroblastose Fetal. As transfusões são realizadas para aumentar a capacidade do sangue de transportar oxigênio, para restaurar o volume sangüíneo do organismo, para melhorar a imunidade ou para corrigir distúrbios da coagulação. Da combinação entre o Sistema ABO e do Fator Rh, podemos encontrar os chamados doadores universais (O negativo) e receptores universais (AB positivo). Palavras- chave: Grupos Sangüíneos.Tipagem Sangüínea.Sistema ABO e Fator Rh.

9. ABSTRACT FRAGA, E.G.S. OLIVEIRA, F.V.S; ABO and Rh SYSTEM: A SYSTEMATIC. 2011. 79 f. Monograph (graduation in Pharmacy) - Faculdades Integradas de Fernandópolis, Fundação Educacional de Fernandópolis, Fernandópolis-SP, 2011. Proving that there were differences in the blood of many people with the discovery of blood groups in the beginning of the twentieth century, it was then possible to explain why some people died after transfusion of blood and other not. The blood types are determined by the presence, on the surface of red blood cells of antigens that can be of varied nature biochemistry and may be composed of carbohydrates, lipids, proteins or a mixture of these compounds. The laboratory determination of Rh and ABO blood group was originally being held to react to red blood cells of patients with serum Anti-A, Anti-B and Anti-D produced in the laboratory, clean strip of microscopy. Meanwhile, in Brazil, it was determined by legislation that evidence of agglutination are not made to strip, but a more accurate methods, such as in microplates methods excavated and / or in test tubes, or the method of gel-centrifugation, later. It advocated the holding of direct evidence and the evidence in the case of reverse ABO system and Coombs Evidence in the case of Rh system, even if the present negative, thus enabling the distinguished serologically RhD antigen weak for some partial RhD antigen present in the sample. We found in the ABO blood group system hh, also called blood group of Mumbai (Bombay Phenotype), a rare blood group. Individual’s hh do not express the antigen H, which is found in the blood group O. As a result can not produce either the A antigen, or B, in their red blood cells and is therefore known as "The False." There are no natural antibodies in the Rh system, and the antibodies present only in subjects sensitized by prior inoculation. The inoculation may occur by episodes of incompatible transfusion or, in women, due to the introduction in maternal blood mother's Rh negative, the red blood cells from a pregnancy or abortion of Rh positive child taking the child to have hemolytic disease of the Newborn Fetal or Eritroblastose. The transfusions are carried out to increase the capacity of the blood to carry oxygen to restore blood volume of the body, to enhance immunity or to correct disturbances in coagulation. The combination

10. between the ABO system and the Rh factor, we can find so-called universal donor (O negative) and universal receivers (AB positive). Keywords: Blood Groups, Blood Typing, ABO System and Factor Rh.

11. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Fator Rh Fator Rhesus MHC Complexo principal de histocompatibilidade DHRN Doença Hemolítica do Recém-nascido ISBT Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea Teste AGH Teste da antiglobulina humana P. knowlesi Plasmodium knowlesi P. vivax Plasmodium vivax RN Recém-nascido IgM Imunoglobulina M (anticorpo) IgG Imunoglobulina G (anticorpo) cDNA DNA complementar kb Kilobases aa aminoácidos RFLP Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (marcadores moleculares mais amplamente utilizadas em genética e melhoramento de plantas) PCR Reação em Cadeia pela Polimerase FDA Food and Drug Administration. Órgão governamental dos Estados Unidos da América que faz o controle dos medicamentos, cosméticos, etc. AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Vírus HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (AIDS) Vírus HTLV Vírus linfotrópico de células T humanas Vírus HCV Vírus da Hepatite C Sistema YT Sistema Cartwright

12. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1- SOROS UTILIZADOS NA TIPAGEM DIRETA.............................................................33 Figura 2- TIPAGEM EM LÂMINA.............................................................................................35 Figura 3- SENSIBILIZAÇÃO MATERNA...................................................................................45 Figura 4- DOAÇÃO E RECEPÇÃO DO SISTEMA ABO E SISTEMA Rh......................................47

13. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 14 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 15 2.1 Sangue ......................................................................................................................... 15 2.1.1 Grupos Sangüíneos .......................................................................................... 15 2.1.2 Hemácias ............................................................................................................. 16 2.1.3 Complexo Principal de Histocompatibilidade – MHC .............................. 17 2.2 Grupos e Sistemas Sangüíneos ........................................................................... 18 2.3 Sistema ABO (ISBT n° 001) .................................................................................... 19 2.3.1 Genótipo do Sistema ABO .............................................................................. 20 2.3.2 Fenótipo do sistema ABO ............................................................................... 20 2.3.3 Genética do Sistema ABO ............................................................................... 21 2.4 Sistema H (ISBT n° 018) .......................................................................................... 28 2.5 Fenótipo Bombaim ................................................................................................... 29 2.6 Técnicas para Genotipagem ABO ........................................................................ 30 2.7 Determinação laboratorial dos grupos sanguíneos do Sistema ABO ....... 31 2.8 Discrepância na determinação do Sistema ABO ............................................. 33 2.9 Tipagem Sanguínea .................................................................................................. 33 2.9.1 Tipagem Sanguínea em lâmina .......................................................................... 33 Observando-se o resultado: ......................................................................................... 34 2.9.2 Tipagem sanguínea em tubo de ensaio........................................................... 35 Observando-se o resultado .......................................................................................... 35 3 Sistema Rh (ISBT n° 004) ........................................................................................... 35 3.1 Genética e Bioquimica do Sistema Rh............................................................ 36 3.2 Sistema Fisher ....................................................................................................... 37 3.3 Determinação laboratorial dos antígenos do sistema Rh ............................. 38 3.4 Du ou D Fraco ............................................................................................................. 39 3.5 Teste para a determinação de Rh Fraco ou D Fraco ....................................... 40 3.5.1 Amostra ................................................................................................................ 40 3.5.2 Coleta da amostra ............................................................................................. 40 3.5.3 Técnica em tubo................................................................................................. 40 3.5.4 Leitura ................................................................................................................... 41

14. 3.5.5 Resultado ............................................................................................................. 41 3.5.6 Observações relativas ao Sistema Rh ......................................................... 41 3.6 Prevalência Rh + e Rh (-) ........................................................................................ 42 3.7 Transfusões no sistema Rh ................................................................................... 42 3.8 Eritroblastose Fetal ou Doença Hemolítica do recém-nascido .................... 43 3.8.1 Sensibilização materna .................................................................................... 44 3.8.2 Sintomas e Tratamento .................................................................................... 44 3.8.3 Incidência............................................................................................................. 45 3.9 Grupos Sanguíneos em doação de Sangue .................................................. 45 3.9.1 Indicações para Transfusão ........................................................................... 47 4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 48 5 METODOLOGIA................................................................................................................. 49 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 50 REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 51

15. 14 1 INTRODUÇÃO Os grupos sangüíneos ou tipos sangüíneos foram descobertos no início do século XX (cerca de 1900 - 1901), quando o cientista austríaco Karl Landsteiner se dedicou a comprovar que havia diferenças no sangue de diversos indivíduos. Colhendo amostras de sangue de diversas pessoas, isolou os glóbulos vermelhos (hemácias) e fez diferentes combinações entre plasma e hemácias, tendo como resultado a presença de aglutinação dos glóbulos em alguns casos, e sua ausência em outros (BEIGUELMAN, 2003). Os grupos sanguíneos são constituídos por antígenos que são a expressão de genes herdados da geração anterior. Quando um antígeno está presente, isto significa que o indivíduo herdou o gene de um ou de ambos os pais, e que este gene poderá ser transmitido para a próxima geração. O Sistema ABO foi o primeiro dos grupos sanguíneos a ser descoberto, e se caracteriza pela presença ou ausência de dois antígenos (A e B), classificando os seres humanos em três grupos sanguíneos: A, B e O, Em 1902, seus colaboradores Von Decastello e Sturli encontraram e descreveram o grupo AB, mais raro (BEIGUELMAN, 2003). Levin e Stone, em 1939, relataram o caso de um feto natimorto gerado por uma mulher que posteriormente manifestou reação hemolítica transfusional ao receber sangue de seu marido (compatível quanto ao sistema ABO, o único então conhecido). Landsteiner e Wiener em 1940 descreveram um anticorpo produzido no soro de coelhos e cobaias, pela imunização com hemácias de Macacus rhesus, que era capaz de aglutinar as hemácias de 85% das amostras obtidas de um grupo de caucasóides americanos. Wiener e Peters no mesmo ano aproximaram as duas observações, determinando tratar-se do mesmo antígeno. O anticorpo produzido no sangue da cobaia foi denominado de anti-Rh (HENRY, 2001). Os indivíduos que apresentavam o fator Rh passaram a ser designados Rh+, o que geneticamente acreditava-se corresponder aos genótipos RR ou Rr. Os indivíduos que não apresentam o fator Rh foram designados Rh- e apresentavam o genótipo rr, sendo considerados geneticamente recessivos (HENRY, 2001).

16. 15 Numerosos sistemas antigênicos ertitrocitários foram descobertos, após as descobertas dos sistemas ABO e Rh. Em sua maioria apresentam antígenos públicos, comuns à maioria dos seres humanos. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Sangue O sangue é um tecido conjuntivo líquido que circula pelo sistema vascular sanguíneo dos animais vertebrados. Criado na medula ossea vermelha e tem como função a manutenção da vida do organismo,sendo constituído por diversos tipos de células (ocasionalmente chamadas de corpúsculos); esses elementos figurados (ou formadores) constituem a parte "sólida" do sangue e cerca de 45% de volume total. Já os 55% restantes são formados de uma parte líquida chamada plasma (ou soro - plasma sem fibrinogênio),formado por 90% de água, 1% de substâncias inorgânicas (como potássio, sódio, ferro, cálcio), 7% de proteínas plasmáticas (albumina, imunoglobulinas e fibrinogénio, principalmente) e 1% de substâncias orgânicas não protéicas, resíduos resultantes do metabolismo, hormonas (hormônios) e de aproximadamente 45% de outros componentes que agrupados constituem os elementos figurados do sangue. São dividos em Leucócitos ou Glóbulos Brancos (células de defesa), Glóbulos vermelhos, eritrócitos ou Hemácias (transporte de Oxigênio) e Plaquetas (fatores de coagulação sanguínea).Devido à presença da molécula da hemoglobina nas hemácias, nos animais vertebrados o sangue é de cor vermelha.A quantidade total do sangue no animais representa cerca de 8% de sua massa total (BEIGUELMAN, 2003). 2.1.1 Grupos Sangüíneos Segundo Beiguelman (2003) os grupos sangüíneos ou tipos sangüíneos foram descobertos no início do século XX (cerca de 1900 - 1901), quando o cientista austríaco Karl Landsteiner se dedicou a comprovar que havia diferenças no sangue de diversos indivíduos . Ele colheu amostras de sangue de diversas pessoas, isolou os glóbulos vermelhos (hemácias) e fez diferentes combinações entre plasma e hemácias, tendo como resultado a presença de aglutinação dos glóbulos em alguns

17. 16 casos, e sua ausência em outros. Landsteiner explicou então por que algumas pessoas morriam depois de transfusões de sangue e outras não. Em 1930 ele ganhou o Prêmio Nobel por esse trabalho. Os tipos sangüíneos são determinados pela presença, na superfície das hemácias, de antígenos que podem ser de natureza bioquímica variada, podendo ser compostos por carbobohidratos, lipídeos, proteínas ou uma mistura desses compostos. Estes antígenos eritrocitários são independentes do Complexo principal de histocompatibilidade (MHC), o qual determina a histocompatibilidade humana e é importante nos transplantes. 2.1.2 Hemácias Glóbulos vermelhos são células sem núcleo celular nem orgânulos, também designadas por eritrócitos, hemácias ou células vermelhas, que estão presentes no sangue em número de cerca de 6 milhões por milímetro cúbico, em condições normais. São constituídas basicamente por globulina e hemoglobina (composta de 4 moléculas protéicas de estrutura terciária e 4 grupamentos heme que contém o ferro (cada íon ferro é capaz de se ligar frouxamente a dois átomos de oxigênio), um para cada molécula de hemoglobina), e a sua função é transportar o oxigênio (principalmente) e o gás carbônico (em menor quantidade) aos tecidos. Os eritrócitos vivem por aproximadamente 120 dias. As hemácias costumam ficar na circulação por 150 dias, em média. Nos mamíferos, os eritrócitos são discos bicôncavos que não têm núcleo e medem 0,007mm de diâmetro; em outros vertebrados são ovais e têm núcleo. A cor vermelha se deve à alta concentração da molécula de transporte de oxigênio dentro das células, a hemoglobina. Há cerca de 5 milhões de eritrócitos em um milímetro cúbico de sangue humano; eles são produzidos numa velocidade de 2 milhões por segundo por um tecido especial que se localiza na medula óssea de quase todos os ossos no recém nascido, e apenas em ossos membranosos em adultos (arcos costais, corpo vertebral, esterno e ílio) o tecido hematopoiético, e as células velhas são destruídas e removidas pelo baço liberando bilirrubina. As baixas tensões de oxigênio, hipoxia, nas grandes altitudes estimulam maior produção de hemácias para que o transporte de oxigênio seja facilitado. A hipoxia é detectada pelo sistema renal, e este produz o hormônio Eritropoetina que estimula a medula óssea a produzir maior numero de células

18. 17 vermelhas, consequentemente causando a correção da hipoxia (BEIGUELMAN, 2003). Quando colocadas em solução hipotônica (menos concentrada), as hemácias sofrem hemólise, ou seja, se rompem. Em meio hipertônico (mais concentrado), perdem água e murcham, ocorrendo plasmólise. Quando os eritrócitos se rompem, liberam a hemoglobina, que é convertida em bilirrubina e eliminada pela vesícula biliar ao sistema gastrintestinal. Na membrana dos glóbulos vermelhos existem vários tipos de proteínas que são: a anquirina, actina, glicoforina, banda 3, espectrina e banda 4.1 (HENRY, 2001). 2.1.3 Complexo Principal de Histocompatibilidade – MHC O complexo principal de histocompatibilidade ou MHC (do inglês major histocompatibility complex) é uma grande região genômica ou família de genes encontrada na maioria dos vertebrados. É a região mais densa de genes do genoma dos mamíferos e possui importante papel no sistema imune, auto-imunidade e no sucesso reprodutivo. As proteínas codificadas pelo MHC são expressas na superfície das células de todos animais com mandíbula, e apresenta tanto antígenos próprios (fragmentos de peptídeos da própria célula) e antígenos externos (fragmentos de microorganismos invasores) para um tipo de leucócito chamado célula T que tem a capacidade de matar ou coordenar a morte de patógenos, células infectadas ou com função prejudicada (HENRY, 2001). De acordo com Henry (2001) cada indivíduo possui um conjunto diferente de antígenos eritrocitários, e por seu número, existem hoje cerca de 27 sistemas antigênicos conhecidos, mais alguns antígenos diferenciados que ainda não foram atribuídos a nenhum sistema específico. É difícil (se não impossível) encontrar dois indivíduos de mesma composição antigênica. Daí a possibilidaade da presença, no soro, de anticorpos específicos (dirigidos contra os antígenos que cada indivíduo não possui), o que resulta na aglutinação ou hemólise quando ocorre uma transfusão incompatível (ou, em determinações laboratoriais, quando se fazem reagir soros específicos com os antígenos correspondentes presentes nas hemácias). Diferentes sistêmas antigênicos se caracterizam por induzir a formação de anticorpos em intensidades diferentes; além do que, alguns são mais comuns e outros, mais raros. Estes dois fatos associados determinam a importância clínica de

19. 18 cada sistema. Os sistemas antigênicos considerados mais importantes são o sistema ABO e o Sistema Rh. Estes são os sistemas mais comumente relacionados às temidas reações transfusionais hemolíticas. Reações contra antígenos eritrocitários também podem causar a Doença Hemolítica do Recém-nascido (DHRN ou Ertiroblastose Fetal), cuja causa geralmente (mas não sempre) se associa a diferenças antigênicas relacionadas ao Sistema Rh. Para Alves, Berthier e Sad (1982) a determinação dos grupos sanguíneos tem importância em várias ciências: Em Hemoterapia, torna-se necessário estudar pelo menos alguns desses sistemas em cada indivíduo para garantir o sucesso das transfusões. Assim, antes de toda transfusão eletiva, é necessário se determinar, pelo menos, a tipagem ABO e Rh do doador e do receptor; Em ginecologia/obstetrícia e neonatologia, é possível se diagnosticar a DHRN através do seu estudo, adotando-se medidas preventivas e curativas; Em Antropologia, é possível estudar diversas raças e suas interrelações evolutivas, através da análise da distribuição populacional dos diversos antígenos, determinando sua predominância em cada raça humana e fazendo-se comparações; Em Medicina legal, é possível se determinar, por exemplo, o tipo sanguíneo de um criminoso a partir de material colhido na cena do crime, auxiliando na investigação criminal. 2.2 Grupos e Sistemas Sangüíneos A “Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea” (ISBT) instituiu um sistema numérico de nomenclatura para ajudar a regularizar a terminologia dos grupos sangüíneos. Essa convenção dizia que a cada sistema é dado um número e letra, e cada antígeno é numerado seqüencialmente em ordem de descobrimento. Com o designado mais de 20 sistemas de grupos sangüíneos (tabela 01) e 07 grupos de antígenos (tabela 02) foram definidos. Antígenos de alta-freqüência ou “públicos” e antígenos de baixa-freqüência ou “privados” não estão associados aos conhecidos sistemas ou grupos também delineados em números de série (CAVASINI et al., 2001).

20. 19 2.3 Sistema ABO (ISBT n° 001) De acordo com Alves, Berthier e Sad (1982) os Sistema ABO foi o primeiro dos grupos sanguíneos descobertos (1900-1901) no início do século XX em 1900), pelo cientista austríaco Karl Landsteiner. Fazendo reagir amostras de sangue de diversas pessoas, ele isolou os glóbulos vermelhos (hemácias) e fez diferentes combinações entre plasma e hemácias, tendo como resultado a presença de aglutinação dos glóbulos em alguns casos, e sua ausência em outros. Assim, Landsteiner classificou os seres humanos em três grupos sanguíneos: A, B e O, e explicou por que algumas pessoas morriam depois de transfusões de sangue e outras não. Em 1902, seus colaboradores von Decastello e Sturli encontraram e descreveram o grupo AB, mais raro. Em 1930 Landsteiner ganhou o Prêmio Nobel por seu trabalho. Beiguelman (2003) afirmou que este sistema se caracteriza pela presença ou ausência de dois antígenos (A e B) chamados aglutinógenos, isolada ou simultaneamente, em cada indivíduo. A grande maioria dos seres humanos (excetuados os lactentes até uma idade aproximada de 3 a 6 meses, e eventualmente os indivíduos que apresentam imunossupresão ou outras circunstâncias especiais) apresenta também anticorpos naturais ou aglutininas, dirigidos contra o(s) antígeno(s) que cada indivíduo não possui, estabelecendo assim as conhecidas regras de compatibilidade sanguínea para este grupo: Indivíduos do grupo O não possuem nenhum dos dois antígenos, portanto possuem anticorpos anti-A e anti-B; podem receber apenas sangue do grupo O, mas podem doar para todos os grupos. Indivíduos do grupo A possuem apenas o antígeno A, e portanto apresentam os anticorpos anti-B; podem receber sangue dos grupos O e A, e doar para os grupos A e AB. Indivíduos do grupo B possuem apenas o antígeno B, e portanto apresentam os anticorpos anti-A; podem receber sangue dos grupos O e B, e doar para os grupos B e AB. Indivíduos do grupo AB possuem ambos os antígenos, e nenhum anticorpo. Podem receber sangue de qualquer grupo, mas doam apenas para o grupo AB.

21. 20 Da combinação entre o Sistema ABO e do Fator Rh, podemos encontrar os chamados doadores universais (O negativo) e receptores universais (AB positivo) no concentrado de hemáceas. Estas regras não levam em conta o raríssimo O Bombay o qual somente pode receber sangue de outro indivíduo O Bombay nem os subgrupos de A e Bos quais não representam interferência na maioria das circunstâncias clínicas. 2.3.1 Genótipo do Sistema ABO As hemácias humanas podem apresentar na membrana as substâncias aglutinógenos ou aglutinogênios, sintetizadas pelos alelos IA ou IB sendo: aglutinógenos A ou aglutinógenos B ou a coexistência dos dois tipos e também a substância química aglutinina contida no plasma das hemácias: Anti-A, Anti-B ou ausência dessas (BEIGUELMAN, 2003). Na relação alélica existente, o alelo i é recessivo aos seus alelos IA e IB. Assim, quando em um indivíduo é encontrado homozigose do alelo recessivo i, esse pertencerá ao grupo O (genótipo ii). Caso sejam encontrados em heterozigose os alelos IA e IB, ambos manifestam seu caráter dominante, e o indivíduo será do grupo sangüíneo AB (genótipo IA IB). Um indivíduo pertencerá ao grupo sangüíneo A, se enquadrado em duas situações: quando em homozigose dominante IA IA, ou em heterozigose do alelo dominante IA com o recessivo i, apresentando genótipo IA i. Da mesma forma para o grupo sangüíneo B: quando em homozigose dominante IB IB, ou em heterozigose do alelo dominante IB com o recessivo i, apresentando genótipo IB i. A figura 01 esquematiza as possibilidades entre os alelos para determinação do sistema ABO (BEIGUELMAN, 2003). 2.3.2 Fenótipo do sistema ABO Beiguelman (2003) disse que a classificação dos fenótipos ABO eritrocitários correspondem a presença e/ou ausência de antígenos A e/ou B na membrana da hemácia. Os indivíduos formam naturalmente anticorpos contra os antígenos que não possuem. Esses anticorpos podem ser detectados no soro e/ou plasma. Portanto, para determinação do fenótipo ABO, recomenda-se pesquisar os antígenos (prova direta) e os anticorpos (prova reversa). Pode-se concluir que cada

22. 21 antígeno presente na hemácia corresponde ao anticorpo no soro e/ou plasma, de especificidade contra o antígeno que o indivíduo não possui. 2.3.3 Genética do Sistema ABO Os genes são codificados por meio de seqüências específicas presentes no DNA, localizadas em pontos estratégicos ao longo do cromossomo. Já os alelos são formas alternativas de genes, que ocupam um único lócus em cromossomos homólogos. Os principais alelos do gene ABO são A1, B e O, que darão origem aos quatro grupos sangüíneos: A, B, AB e O (YAMAMOTO et al., 1990). Noventa anos após a descoberta do grupo sangüíneo ABO, a base genética molecular do sistema foi definida e os polimorfismos dos alelos comuns a esse lócus estabelecidos. A clonagem do cDNA da transferase A, realizada por Yamamoto et. al., em 1990, foi baseada na seqüência parcial do gene dessa enzima, na sua forma solúvel, a partir do tecido do pulmão humano, e a construção da biblioteca de cDNA do gene ABO foi feita por meio do poli-A do RNA de células humanas cancerígenas do estômago, as quais expressaram altos níveis de antígeno A (YAMAMOTO, 2000). O lócus ABO estende-se por uma região de 18-20 kilobases (kb), na posição 9q34.1-9q34.2, consistindo de 7 éxons (cujo tamanho varia entre 26-688 pares de base, sendo que grande parte da seqüência codificadora se encontra nos éxons 6 e 7) e 6 íntrons. Desse modo, o gene ABO tem no total 19514 pares de bases (pb), contando desde o códon de iniciação até o terminal (o número exato de nucleotídeos pode variar entre os diferentes alelos). Alguns estudos realizados demonstraram que a proteína transferase apresenta três domínios: um N-terminal, transmembrana hidrofóbica e um C-terminal. A forma solúvel e purificada da enzima é ativa cataliticamente. A ausência dos domínios N-terminal e da transmembrana hidrofóbica, demonstraram que provavelmente a porção C-terminal da enzima, é a responsável pela sua atividade catalítica, sendo os exons 6 e 7, que respondem por aproximadamente 90% da seqüência codificadora do gene ABO, responsáveis pela tradução do domínio C-terminal da enzima glicosiltransferase. A análise da seqüência de nucleotídeos do cDNA da transferase A1 revelou uma região de código de 1062 pb, produzindo um polipeptídeo de 354 aminoácidos (aa), cuja massa molecular é de 41KDa (YAMAMOTO et al., 1990; YAMAMOTO, 2000). Yamamoto (2001) relatou que pesquisas realizadas com o gene ABO humano e seus homólogos, entre as diferentes espécies de mamíferos, demonstraram grau

23. 22 elevado de conservação durante a sua evolução. O gene ABO apresenta também uma elevada homologia entre os não-primatas para a a1,3-galactosiltransferase e para os pseudogenes humanos, que estão localizados no mesmo lócus. As substituições de nucleotídeos que ocorrem em um dos sete exons do gene ABO e que conduzem a mudança do aminoácido na proteína, podem alterar a atividade catalítica dos antígenos resultantes da enzima. As mutações encontradas nos vários subgrupos dos alelos A ou B tem sido revistas recentemente. Teoricamente, a menor reatividade encontrada nos subgrupos do sistema sangüíneo ABO é causada pelas mutações na região de código do gene, ou pela influência inibitória de outros loco no gene ABO. Poucos alelos (A1, A2, B, B(A), O2), até hoje, tiveram suas transferases expressas em sistemas sintéticos para estudo da causa e efeito entre as mutações e os fenótipos associados. O conhecimento da estrutura tridimensional da proteína junto com as propriedades cinéticas das enzimas quanto à especificidade entre o açúcar aceptor e o substrato, podem revelar como a substituição do nucleotídeo e/ou aminoácido afeta a atividade das glicosiltransferases dos subgrupos do sistema sangüíneo ABO (OLSSON et al., 2001). 2.3.3.1 Base estrutural do alelo A A clonagem e o seqüenciamento do cDNA da célula humana de adenocarcinoma de cólon dos fenótipos A, B e O, demonstraram que os dois principais alelos do gene ABO, A1 e B, diferem entre si em sete mutações: A297G, C526G, C657T, G703A, C796A, G803C e G930A, das quais apenas quatro (526, 703, 796 e 803) são responsáveis pelas substituições dos aminoácidos; Arg176Gly, Gly235Ser, Leu266Met e Gly26Ala. As duas últimas substituições são consideradas críticas na determinação da especificidade das glicosiltransferases. É importante lembrar que a seqüência do alelo A1 (A101) é tomada como base de comparação em relação a todos os outros alelos do gene ABO (OLSSON et al., 2001). 2.3.3.2 Subgrupos A1 e A2 Olsson et al., (2001) disse que a mudança estrutural no alelo A1 que dará origem ao A1variante ou A1v (A102), é decorrente da mutação no nucleotídeo (nt)

24. 23 467, que resulta na substituição do aminoácido Pro156Leu. Os dois alelos são comuns, porém com freqüências extremamente diferentes, nas poucas populações estudadas. Segundo Olsson et al., (2001) outros dois alelos A1 mutantes foram descritos, sendo que o primeiro apresenta as substituições C467T (Pro156Leu) e C564T, e o segundo a mutação silenciosa A297G. As alterações nesses dois alelos não afetam a atividade das transferases, mas a mutação A297G, presente também no alelo B, pode conduzir à predição errônea do genótipo se essa posição for utilizada como um dos marcadores para pesquisa em genotipagem desse alelo. O fenótipo A2, comum em caucasianos, é detectado, sorologicamente, por meio da capacidade desses eritrócitos aglutinarem com o soro anti-A e de não aglutinarem com o soro lectina anti-A1, ao contrário do fenótipo A1 cujas hemácias são aglutinadas na presença desse reagente. O alelo A2 (A201) é caracterizado pela substituição de uma única base no nt 467 e uma deleção no nt1060.11,14,21,37 Essa deleção ocorre em um dos três resíduos consecutivos de citosina (C), próximo à carboxila terminal. Em conseqüência disso são adicionados à transferase A 21 aminoácidos, o que diminui a sua atividade e leva a um espectro limitado de substrato aceptor. A mutação no nt 467, C-T, leva a troca do aminoácido prolina pela leucina, não apresentando nenhuma relação quanto à atividade da transferase (YAMAMOTO, 2001). Recentemente, alguns estudos demonstraram a presença de outros três variantes em indivíduos detectados sorologicamente como A2, A106, A107 e R101. Os alelos A106 e A107 são caracterizados pela alteração do nt 1054, (C-T e C-G, respectivamente), resultando na permuta do aminoácido 352 (Arg-Trp e Arg-Gly). Essa substituição Arg352Trp é encontrada também no alelo B3.12,38 O terceiro alelo R101, o mais raro dos três, tem 6 mutações quando comparado ao alelo A1, sendo 3 silenciosas, A297G, C657T e C771T, e 3 missenses, C526G, G703A e G829A, que resultam nas seguintes substituições de aminoácidos; Arg176Gly, Gly235Ser e Val277Met. Acredita-se que esse alelo (R101) tenha sua origem devido a uma recombinação gênica entre os alelos B (B101) e O1v (O102) na região dos nt703-771. Outro exemplo do alelo A2 onde não se detecta a mutação C467T foi descrito recentemente (YAMAMOTO, 2001).

25. 24 2.3.3.3 Subgrupo A3 Para Yamamoto (2000) os diversos estudos realizados sobre o alelo A3 (A301) têm demonstrado que esse subgrupo possui um alto grau de heterogeneidade, uma vez que diversas mutações já foram associadas a ele. Em investigações no cDNA de indivíduos A3, encontraram em dois exemplos de amostras A3B a mutação G871A, nas quais há substituição do aminoácido 291 (Acido Aspártico-Asparagina), nas outras amostras pesquisadas, as seqüências dos exons 6 e 7 mostraram-se idênticas à da transferase A1. Em um estudo com três famílias brasileiras sobre a heterogeneidade molecular do alelo A3, não encontrou a mutação 871, mas durante a análise da seqüência dos nucleotídeos dessas amostras identificou outras substituições (YAMAMOTO, 2001). Barjas e Saad (1997) em uma pesquisa disseram que duas amostras da mesma família (A3B e A3O1) foi encontrada a substituição C467T associada à del 1060C, essa última responsável pela redução da atividade da transferase, sendo característica do alelo A2. Na segunda família, em outras duas amostras (A3O1 e A3O1) analisadas, somente a del1060C estava presente, enquanto que nos dois membros da terceira família (A3O1V e A3O1) foram encontradas a del1060C e a mutação do nucleotídeo G829A associado. 2.3.3.4 Outros subgrupos de A Comparando com o consenso A1, o alelo Ax (A108) possui uma única mutação T646A, resultando na substituição do aminoácido 216, onde a fenilalanina é substituída pela isoleucina (YAMAMOTO et al., 1990). Nas pesquisas realizadas, por Olsson, para identificação do alelo Ael (A109), em 20 indivíduos pertencentes a 14 famílias suecas, foi encontrada em todas as amostras analisadas, a inserção de uma base G (guanina) no nucleotídeo 798-804 do gene da transferase A, produzindo uma fita de oito G e não sete, tendo como conseqüência a alteração do "frame" de leitura a partir do códon 268, estendendo a proteína traduzida em 37 aminoácidos (BARJAS E SAAD, 1997).

26. 25 2.3.3.5 Base estrutural do alelo B Para Olsson e Chester (2001) o tamanho do DNA traduzido nas transferases A e B (B101) é idêntico, diferindo apenas em sete substituições de nucleotídeos (A297G, C526G, C657T, G703A, C79A, G803C e G930A). Essas mutações resultam em apenas quatro mudanças de aminoácidos que serão expressas nas proteínas traduzidas (nt 526, 703, 796 e 803). Em um estudo detalhado sobre as diferenças moleculares e seus significados, adicionou a essas sete mutações, que diferenciam os alelos A1 e B, uma oitava substituição G109A, localizada além do códon terminal, que é útil para a triagem do genótipo ABO. Outros três variantes do alelo B têm sido pesquisados na população japonesa, sendo caracterizados pela perda de um dos pontos das mutações que os diferenciam da transferase A. Essa mutação resulta na alteração do aminoácido que será expresso na proteína em um desses variantes, na qual a primeira das quatro substituições de aminoácidos (nt 526) esta ausente, não alterando a expressão da atividade da transferase B. Esses 3 alelos raros, previsivelmente, devem ser formas intermediárias entre os alelos A e B, tendo sua origem provável nos eventos de conversão gênica (OLSSON; THURESSON; CHESSER, 1995). 2.3.3.6 Subgrupos de B Barjas e Saad (1997) afirmaram que os subgrupos de B são mais raros do que os de A. Eles são caracterizados pela fraca aglutinação dos eritrócitos com o soro anti-B e/ou anti-AB, bem como pela baixa absorção dessas células na presença de anti-B. A saliva dos indivíduos desses secretores exibem altas concentrações do antígeno H. Em geral e, ao contrário dos subgrupos de A, a classificação dos subgrupos de B é bastante controversa. Os fenótipos B, que possuem a atividade da transferase mais fraca que o normal, designados como B3, Bx e Bel, são de grande importância uma vez que permitem a caracterização das suas glicosiltransferases, pelo estudo das mutações presentes nesses alelos (YAMAMOTO et al., 1993). Em um estudo realizado com uma amostra A1B3, sobre o subgrupo B3 (B301), atribuiu a ele uma única mutação na posição do nucleotídeo 1054(C-T),

27. 26 resultando na troca do aminoácido 352(arginina - triptofano) (YAMAMOTO et al., 1993). Recentemente foram analisadas as seqüências dos sete exons e dos sítios adicionais de "splice" do gene ABO de 14 amostras de indivíduos com o fenótipo B3. Em uma das amostras foi encontrada a mutação missense G247T, localizada no exon 6 e responsável pela substituição Asp83Tyr, enquanto que as outras 13 amostras apresentaram a mutação G-A no nucleotídeo +5 do íntron 3 (IVS3 + 5G-A), que irá destruir a seqüência da região de splice levando a perda do exon 3 durante o processo do RNA mensageiro, com conseqüente diminuição de 19 aminoácidos no segmento N-terminal na proteína expressa, a transferase B. Investigações realizadas com o subgrupo Bx revelaram a mutação no nucleotídeo G871A, causando a substituição do aminoácido 291 (Ácido Aspártico-Asparagina), que por sua vez é encontrada nas amostras de indivíduos A3. Quanto ao subgrupo Bel, foram atribuídos a ele as mutações; T641G, que dará origem a substituição da metionina pela arginina na posição 214 (B105), e G669T, que irá alterar o ácido glutâmico pelo ácido aspártico na posição 223 (B106), encontradas isoladamente nas duas amostras analisadas. (OLSSON; THURESSON; CHESTER, 1995). 2.3.3.7 Subgrupos B(A) e cis-AB Em relação ao alelo B, o alelo B(A) possui duas mutações, T657C e A703G, resultando na alteração do aminoácido, Ser235Gli. A primeira substituição, T657C, torna o alelo idêntico ao alelo A, enquanto que a segunda, A703G, comum ao alelo B, está localizada no segundo dos quatro sítios que discriminam as transferases humanas A e B, possuindo uma influência significativa no reconhecimento e/ou ligação entre o substrato H e seus respectivos resíduos de açúcares. (YAMAMOTO, et. al., 1993). Para o fenótipo raro, cis-AB, dois mecanismos genéticos são propostos para explicá-lo. O primeiro é baseado em um crossing-over desigual resultando em um gene que irá apresentar partes tanto do alelo A quanto do B, enquanto que o segundo tem como base uma mutação estrutural do gene da glicosiltransferase A ou B, tendo como conseqüência a atividade bifuncional da mesma. A análise molecular mostrou que o alelo cis-AB é idêntico ao A1 à exceção de duas substituições de nucleotídeos; C467T (Pro156Leu) e G803C (Gli268Ala). Acredita-se que essas mutações na transferase A do alelo cis-AB, fizeram parte da

28. 27 evolução do gene ABO, ocorrendo antes da combinação entre os alelos A e B. Embora o fenótipo B(A) seja herdado em uma posição cis, ele é classificado separadamente do cis-AB devido às diferenças sorológicas entre esses dois alelos. Com a substituição da glicínia pela alatina (aa 268) no alelo cis-AB da transferase A, podemos dizer que ele tem a transferase B, porém com a estrutura principal da transferase A. Similarmente, a substituição da serina pela glicínia na posição 235 no alelo B(A) da transferase B, faz com que o mesmo tenha a transferase A, mas com a estrutura principal da transferase B. Esses resultados implicam que ambos os alelos cis-AB e B(A) codificam proteínas que possuem em sua estrutura quimeras das transferases A e B (YAMAMOTO et al., 1993). 2.3.3.8 Base estrutural do alelo O Estudos realizados demonstraram que as seqüências dos alelos do gene ABO possuem diferenças mínimas entre si, desse modo a inabilidade do gene O em codificar as transferases A ou B é devido a uma diferença estrutural em relação aos nucleotídeos e não devido à falha da expressão das transferases A ou B. (YAMAMOTO; MCNEIL, 1996). Nos testes sorológicos de rotina o grupo sangüíneo O é caracterizado por não apresentar os antígenos A e B na membrana das hemácias, assim os seus eritrócitos não aglutinam na presença dos soros anti-A, anti-B e anti-AB. (YAMAMOTO; MCNEIL, 1996). 2.3.3.9 Subgrupos de O Yamamoto, Mcneil e Hakamori (1995) disseram que o primeiro alelo O descrito, nomeado originalmente como O1 (O01), possui uma estrutura idêntica ao gene A1, com exceção de uma única deleção (G) no nt261 do exon 6, próximo à região N-terminal da proteína. Essa deleção irá causar uma alteração na leitura da proteína e com isso provocar um stop códon nos nucleotídeos 352-354 e conduzindo à tradução de uma proteína de 117 aminoácidos enzimaticamente inativa. Estudos posteriores revelaram um segundo alelo O denominado de O1 variante ou O1V (O02), que além de apresentar a deleção de uma única base no nt261 tem também outras 9 (nove) substituições de nucleotídeos (G106T, G188A, C189T, C220T,

29. 28 A297G, T646A, G681A, C771T e G829A) que o diferem da seqüência do consenso A1. Em 1994, Grunnet, identificou e seqüenciou um alelo O mutante, denominado posteriormente de O2 (O03), no qual a deleção na posição 261 estava ausente, mas diferindo do gene A1 em quatro substituições de nucleotídeos: 297 526, 802, e 1096, das quais apenas duas resultam em alterações de aminoácidos (C526G: Arg176Gly e G802A: Gly268Arg). Dessas quatro mutações, duas, nt297 e 526, são específicas do alelo B, enquanto que a terceira, G802A, é utilizada para explicar a perda da atividade da transferase A e B, uma vez que a alteração do aminoácido glicínia pela arginina, na posição 268, está localizada na região da glicosiltransferase envolvida com a atividade enzimática (YAMAMOTO, 2000). Para Yamamoto, Mcneil e Hakamori (1995) um alelo o inicialmente denominado de O3, encontrado em uma família sueca, mostrou as mutações C467T e del1060C, sendo que ambas são características do alelo A2. A esse variante foi adicionado também uma outra substituição passível de ser encontrada, que seria a inserção do nucleotídeo G (guanina) na posição 798-804, semelhante ao que ocorre no alelo Ael. Como outros exemplos de variantes do grupo sangüíneo O, podemos citar o alelo O4 que é caracterizado por uma inserção G no nt87-88, tendo por resultado a alteração na leitura da proteína e conseqüente stop códon no aa 56, e o alelo O5 com a mutação C322T que irá criar um stop códon direto. Recentemente uma série de outros alelos O tem sido pesquisados e acredita-se que eles são formados provavelmente devido a um crossing-over ou uma conversão gênica, eventos esses que ocorrem entre os alelos conhecidos do sistema ABO, como por exemplo: O1v-B, B- O1v, O1-A2, O1- O1v e O1v-O1 (OLSSON; CHESTER, 2001; YAMAMOTO, 2001). 2.4 Sistema H (ISBT n° 018) De acordo com Yamamoto e Mcneil (1996) o sistema H tem dois genes, H e h e um antígeno ou substrato H, sobre a qual ocorre a ação das glicosiltransferases para a formação dos antígenos A e B, podendo ser expresso tanto no estado homozigoto (H/H) como no heterozigoto (H/h). O alelo h é considerado amorfo e

30. 29 nenhum produto antigênico é associado a ele, enquanto que o gene hh é extremamente raro, e nessa situação nenhuma substância H é produzida. O seqüenciamento do gene humano H que codifica a enzima a1,2-L fucosiltransferase, identificou uma proteína de 365 aminoácidos com uma massa molecular de 41,249Da, que é codificada no lócus FUT1 no braço longo do cromossomo 19. Esse gene é formado por quatro exons, sendo que a região de código da proteína está localizada no éxons 4 (YAMAMOTO et al., 1990). O primeiro variante deficiente do gene H foi detectado ,em 1952, chamado de fenótipo Bombay ou Oh. Esse fenótipo é caracterizado sorologicamente pela perda total da atividade das transferases ABH nos eritrócitos e nas secreções corpóreas e pelas grandes quantidades de anti-H que fazem com que os eritrócitos Oh sejam incompatíveis com aqueles do tipo O, uma vez que esses últimos apresentam antígeno H na superfície dos seus eritrócitos. Outro variante deficiente do gene H, é caracterizado como para-Bombay (Ah, Bh, e ABh). Portadores desse fenótipo são identificados por apresentarem quantidades mínimas dos antígenos A e B nos eritrócitos e pouco ou nenhum antígeno H. Nesse fenótipo, ao contrário do Bombay, a transferase H esta presente com atividade muito fraca, sendo que as poucas quantidades de substância H produzidas são convertidas aos antígenos A e B pelas suas respectivas transferases (YAMAMOTO et al., 1990). Yamamoto e Mcneil (1996) fizeram investigações moleculares em amostras Bombay e para-Bombay identificaram um número grande de mutações, sendo que a maioria dessas produzem alelos silenciosos que, quando transcritos codificam uma fucosiltransferase inativa. Alguns alelos, entretanto, codificam a fucosiltransferase, porém com baixa atividade, as quais são responsáveis pela expressão fraca do gene H. 2.5 Fenótipo Bombaim O grupo sangüíneo hh, também chamado de grupo sangüíneo de Bombaim (Bombay phenotype), é um grupo sangüíneo raro. Os indivíduos com o raro fenótipo de Bombaim (hh) não expressam o antígeno H, que é encontrado no grupo sangüíneo O. Como resultado não conseguem produzir quer o antígeno A, quer o B, nos seus glóbulos vermelhos, não importando quais alelos eles venham a ter dos

31. 30 genes dos grupos A e B, porque os antígenos A e B são produzidos a partir do antígeno H (YAMAMOTO; MACNEILL, 1996) O paciente que receber sangue contendo um antígeno que jamais esteve no seu próprio sangue terá uma reação imune. Assim sendo, os indivíduos com o fenótipo de Bombaim podem doar sangue para qualquer membro do sistema ABO (a não ser que outro fator sangüíneo, como o Rh, seja incompatível), mas não podem receber de nenhum membro do sistema ABO (cujo sangue contém sempre um ou mais antígenos A, B e H); somente recebem sangue de indivíduos com o fenótipo de Bombaim. Os testes costumeiros para o sistema ABO apontam-nos como integrantes do grupo O (BEIGUELMAN, 2003). 2.6 Técnicas para Genotipagem ABO Segundo Beiguelman (2003) os avanços na biologia molecular na última década têm providenciado aos bancos de sangue o conhecimento de diferentes alelos ABO, assim como diversas técnicas para sua detecção. Ao longo de todo esse tempo, mais de 30 diferentes métodos para a genotipagem do gene ABO têm sido descritos em diversas publicações científicas. Entre os mais freqüentes métodos descritos para a genotipagem do lócus ABO, destacam-se a reação de polimerase em cadeia (PCR) juntamente com o estudo do polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism), a amplificação do DNA por meio dos primers alelos específicos (ASP), a detecção de alterações de conformação das cadeias simples do DNA (SSCP-Single Strand Conformation Polymorphism) e outras diversas técnicas como o seqüenciamento automático (BEIGUELMAN, 2003). Para Olsson e Chester (2001) o polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP), obtido pelo tratamento do DNA com enzima de restrição, consiste na digestão do produto amplificado com uma ou mais endonucleases, seguido de eletroforese para separação dos fragmentos de acordo com o seu comprimento. O número de fragmentos obtidos corresponde ao número de sítios de restrição reconhecidos pela(s) enzima(s). Por exemplo, a deleção G261-encontrada no alelo O1 pode ser convenientemente detectada pelo uso de duas endonucleases, a KpnI que é apta para clivar o alelo O1, mas não o é para o consenso A1 no nt261, e a enzima BstEII que tem ação inversa.

32. 31 Em 1995, através de uma pesquisa de um método de triagem para genotipagem do gene ABO, por meio de uma reação "multiplex" de amplificação utilizando vários primers simultaneamente; mo46, mo57, mo71 e mo101 e as enzimas de restrição KpnI e HpaII para identificação dos alelos A1, A2, B, O1 e O2. Esse método utiliza a observação prévia da existência de um sítio de clivagem para a enzima HpaII na região 3' UTR (untraslated region) dos alelos A1 e O1, sendo que os alelos B e O2 não possuem esse sítio. Assim, a mutação G1096A presente nesses dois últimos alelos (B e O2) é utilizada como um marcador genético, uma vez que ela irá abolir o sítio de clivagem com a enzima HpaII. A presença das mutações associadas aos alelos A2 (C467T), B (G703A e G1096A) e O2 (G1096A) também removem os sítios da HpaII presentes na seqüência do consenso do gene ABO (SBHH, 2011). Outra técnica amplamente empregada é o PCR alelo específico, onde cada amostra de DNA é submetida a duas amplificações com o intuito de que o polimorfismo do gene ABO seja detectado por meio de primers específicos para a seqüência pesquisada, sendo considerada "positiva" a reação que apresentar o alelo pesquisado e "negativa" a reação que não apresentar o alelo em questão. Esses primers são formulados de maneira que permitam a amplificação de uma região pré- determinada do gene onde se encontra a mutação do nucleotídeo que se deseja detectar, devendo ter entre 19 e 21 pb, e permitir uma hibridização diferencial baseada em uma única mudança de base, fornecendo uma especificidade elevada com o lócus a ser estudado. Os fragmentos obtidos após amplificação deverão ser separados e identificados por meio de eletroforese. Esse tipo técnica pode ser utilizada em conjunto com o RFLP, uma vez que é possível criar sítios de clivagem para determinadas enzimas, com uso de primers durante as reações de amplificação (DENOMME; RIOS; REID, 2000). 2.7 Determinação laboratorial dos grupos sanguíneos do Sistema ABO Para Beiguelman (2003) à determinação do grupo sanguíneo ABO era originalmente realizada fazendo-se reagir às hemácias do paciente com soros Anti-A e Anti-B produzidos em laboratório, em lâminas limpas de microscopia. Entretanto, no Brasil, determinou-se pela legislação que as provas de aglutinação não sejam feitas em lâminas, mas sim por métodos mais precisos. Podem ser utilizados os

33. 32 métodos em microplacas escavadas e/ou em tubos de ensaio, ou o método da gel- centrifugação, mais recente. É preconizada a realização da Prova direta e da Prova reversa, após a centrifugação do sangue a ser testado, separando-se o soro (ou plasma) das hemácias. É recomendada, em todos os métodos, a determinação dos subgrupos de A: A1 e A2. Na prova direta, faz-se reagir uma porção das hemácias (de tipagem conhecida) com soros anti-A, anti-B e anti-AB. Hemácias que reagem com o soro anti-A são ditas do grupo A, e hemácias que reagem com o soro anti-B são do grupo B. Hemácias do grupo AB reagem com ambos os anti-soros, e hemácias do grupo O não reagem com nenhum dos anti-soros. O soro divalente anti-AB é usado como confirmatório, e somente não reagirá com hemácias do grupo O. O procedimento oposto é feito na prova reversa, em que se faz reagir o soro (de tipagem desconhecida) com hemácias conhecidas dos grupos A e B. Assim, o soro de indivíduos do grupo O reagirá com ambas às hemácias (pois possuem ambos os anticorpos); se do grupo A, reagirá apenas com as hemácias B, e se do grupo B, apenas com as hemácias A. O soro do grupo AB não reagirá com nenhuma das hemácias. Esta prova pode ser complementada pelo uso de hemácias conhecidas A1 e A2, o que auxilia na diferenciação destes dois subgrupos e na solução das principais discrepâncias ABO (BEIGUELMAN, 2003). Caso as provas direta e reversa apresentem resultados de alguma maneira contraditórios (discrepância ABO), deverão ser feitas investigações adicionais para determinação de sua causa, antes da liberação definitiva do resultado do exame (BEIGUELMAN, 2003). Figura 1 – Soros utilizados na Tipagem Direta. Fonte: Vamos ao Laboratório: Qual o meu grupo sangüíneo? 2008. Disponível em: www.dossierdebiologia.com/dossierbio12/laboratorio.htm

34. 33 2.8 Discrepância na determinação do Sistema ABO De acordo com Harmening (1999), Henry (2008) e SBHH (2011) é considerado discrepância quando o resultado das provas direta e reversa não são concordantes. Muitas das discrepâncias são devidas a erros técnicos. Quando isso ocorrer verificar: a) Se o soro e as hemácias usadas pertencem ao mesmo paciente/doador. b) Se os reativos usados não estão contaminados e funcionam adequadamente, para isso, testar uma amostra de grupo já conhecida, por exemplo, uma bolsa de sangue coletada e tipada há 3 dias. c) Se a concentração de hemácias usada no teste está correta (pode haver muita ou pouca hemácia). Preparar uma suspensão em salina a 5%, colocando 1 gota da "papa de hemácias"e 19 gotas de salina. d) Se as provas foram centrifugadas na velocidade e/ou tempo correto. e) Se o registro das reações e interpretações é correto. f) Após verificar todas estas etapas, repetir o teste com uma suspensão de hemácias lavadas. Caso continue o problema deve se pensar na possibilidade de contaminação da amostra do paciente. Nova amostra deve ser coletada e testada. Coletar algumas informações sobre o paciente que podem esclarecer o problema, dentre elas: idade, sexo, doença base (se for o caso), testes imunológicos anteriores e resultado de outras classificações. 2.9 Tipagem Sanguínea 2.9.1 Tipagem Sanguínea em lâmina 1. Coloca-se numa lâmina de microscopia, lado a lado, uma gota de soro anti-A e outra de soro anti-B. 2. Sobre cada gota de soro coloca-se uma gota do sangue a ser identificado (HARMENING ,1999; HENRY, 2008; SBHH, 2011).

35. 34 Observando-se o resultado: a) Se não houver aglutinação em nenhum dos lados, o sangue em exame é do grupo O. b) Se houver aglutinação nos dois lados, o sangue é do grupo AB. c) Se houver aglutinação somente com o soro anti-A, o sangue é do grupo A. d) Se aglutinar somente com o soro anti-B, o sangue é do grupo B (HARMENING, 1999; HENRY, 2008; SBHH, 2011). Figura 02 – Tipagem em Lâmina Fonte: Tipagem Sangüínea. Disponível em: www.iped.com.br/colegio/biologia/tipagem-sanguinea

36. 35 2.9.2 Tipagem sanguínea em tubo de ensaio 1. Coletar sangue total, no mínimo 2 mL de sangue, com ou sem anticoagulante; 2. Preparo da suspensão de hemácias: Colocar no tubo 100 µL de sangue e adicionar 1000 µl solução fisiológica; 3. Para cada amostra de sangue marcar três tubos de ensaio com a identificação: A, B, e AB 4. Colocar em cada tubo duas gotas de anti-soro correspondente, como segue: 5. Tubo A: soro anti A, Tubo B: soro anti B Tubo AB: soro anti AB 6. Colocar em cada tubo duas gotas da suspensão de hemácias; 7. Centrifugar a 2.700 rpm por um minuto; 8. Fazer a leitura. Consiste na observação da presença ou ausência de aglutinação. (HARMENING ,1999; HENRY, 2008; SBHH 2011). Observando-se o resultado a) Se houver aglutinação nos soros A e AB, o sangue é do grupo A; b) Se houver aglutinação nos soros B e AB, o sangue é do grupo B; c) Se houver aglutinação tanto nos soros A, B e AB, o sangue é do grupo AB; d) Se não houver aglutinação em nenhum dos soros, o sangue é do grupo O. Obs.: Na tipagem em tubo, a liberação do botão de hemácias formado no fundo do tubo após a centrifugação deve ser delicada, pois movimentos bruscos podem desmanchar aglutinações mais fracas. (HARMENING, 1999; HENRY, 2008; SBHH, 2011). 3 Sistema Rh (ISBT n° 004) Para Alves, Berthier e Sad (1982) o sistema Rh é o maior, mais complexo e mais imunogênico sistema de grupos sanguíneos. Representa um dos sistemas de maior interesse clínico, por seu envolvimento na Doença Hemolítica Peri-Natal, nas Reações Transfusionais Hemolíticas e nas Anemias Hemolíticas Auto-Imunes. Sua deterninação, juntamente com a dos antígenos pertencentes ao sistema ABO, no

37. 36 procedimento laboratorial denominado Tipagem sanguínea (ABO e Rh),ou simplesmente tipagem sanguínea, é obrigatória antes de qualquer transfusão sangüínea. Foi relatado em 1939 o caso de um feto natimorto gerado por uma mulher que posteriormente manifestou reação hemolítica transfusional ao receber sangue de seu marido (compatível quanto ao sistema ABO, o único então conhecido). Landsteiner e Wiener (1940) descreveram um anticorpo produzido no soro de coelhos e cobaias, pela imunização com hemácias de Macacus rhesus, que era capaz de aglutinar as hemácias de 85% das amostras obtidas de um grupo de caucasóides americanos. Wiener e Peters (1940) aproximaram as duas observações, determinando tratar-se do mesmo antígeno. O anticorpo produzido no sangue da cobaia foi denominado de anti-Rh. Os indivíduos que apresentavam o fator Rh passaram a ser designados Rh+, o que geneticamente acreditava-se corresponder aos genótipos RR ou Rr. Os indivíduos que não apresentam o fator Rh foram designados Rh- e apresentavam o genótipo rr, sendo considerados geneticamente recessivos (BEIGUELMAN, 2003). 3.1 Genética e Bioquimica do Sistema Rh Segundo Beiguelman (2003) os antígenos do sistema Rh são de natureza glicoprotéica, de grande variabilidade. Com o avançar das pesquisas, o sistema se revelou na prática bem mais complexo do que a tipificação simplesmente em Rh Positivo e Rh negativo. Hoje, conhecem-se mais de 40 antígenos diferentes pertencentes a este sistema. A presença de vários fenômenos de expressão incompleta, fraca e/ou parcial dos antígenos, além da síndrome do Rh Nulo (caracterizada pela ausência total de antígenos do sistema Rh, associada a uma anemia hemolítica compensada e à presença de estomatócitos no sangue periférico) dificulta o estabelecimento de uma teoria única, capaz de explicar todos os fenômenos observados. Duas teorias são atualmente aceitas para explicar a fenomenologia do sistema Rh. A teoria de Fischer-Race (Race,1944; Race et al, 1944) estabeleceu sua determinação pelos pares de alelos autossômicos D,_, C,c e E,e , resultando em um conjunto de variações genotípicas desde o CCDDEE até o cc,ee , correspondendo cada variação genética a uma expressão antigênica diferente. (o antígeno correspondente ao alelo

38. 37 d do gene D, nunca foi encontrado é considerado inexistente). Esta teoria nunca foi aceita unanimemente. Uma outra teoria, de Wiener, também aceita por alguns autores, propõe que cada um dos alelos determinaria a produção de um aglutinógeno, o qual seria um antígeno de efeitos múltiplos capaz de produzir diferentes anticorpos distintos, correspondentes a fatores de antígenos. Existiriam portanto os fatores Rh0, rh´, rh´´, hr´ e hr´´, correspondendo, respectivamente, aos antígenos D, C, E, c e e da teoria de Fisher-Rice. A teoria de Fisher-Rice é a mais utilizada na prática, embora se tenha revelado que nenhuma das duas explica completamente todos os fenômenos observados no sistema Rh. Assim, foi realizada uma correspondência entre as duas teorias, na tentativa de se chegar a uma teoria consensual. Desta maneira, às oito combinações gênicas de Fischer - respectivamente cDe, CDe, cDE, CDE, cde, Cde, cdE e Cde - corresponderiam os alelos de Wiener: R0, R1, R2, Rz, r, r´,r´´, e ry. As combinações dos oito haplótipos de Fischer (ou dos alelos de Wiener) resultariam na formação dos diversos antígenos associados ao sistema Rh. Do ponto de vista prático as duas teorias são [1] equivalentes, sendo a teoria de Fischer-Race de mais fácil memorização. Entretanto nenhuma das duas teorias explica todas as mutações existentes, e outras variáveis antigênicas originalmente não previstas, como as variantes Cx, Cw e Ew (e os anticorpos correspondentes) já foram descobertas. Numerosos outros fenômenos muito raros, mas também bastante complexos, resultam em antígenos e aglutinogênios que ainda hoje desafiam a imunohematologia (ALVES; BERTHIER; SAD, 1982; BEIGUELMAN, 2003). 3.2 Sistema Fisher É sabido que o sistema Rh é muito complexo, e o conhecimento atual é baseado no sistema Fisher (tabela 04). Existem três genes determinando o antígeno Rhesus: C, D e E, encontrados no cromossomo 1. Existem dois alelos possíveis em cada lócus: c ou C; d ou D e e ou E. Um aplotipo consiste em c/C, d/D, e/E e é herdado de cada um dos pais. O tipo resultante Rhesus de um indivíduo depende do genótipo herdado. Aos aplotipos é dado um código (BEIGUELMAN, 2003). Se um genótipo Rh de um indivíduo contém pelo menos um dos antígenos C, D, E eles são Rhesus positivo. Apenas indivíduos com o genótipo cde/cde (rr) são Rhesus negativo. Com objetivo a transfusão sanguínea, doador possuidor de C ou

39. 38 E, mesmo tipo Rh r’r e r”r são classificados como Rh positivo. Receptores de transfusão sanguínea com os tipos Rh r’ e r” devem receber sangue Rh negativo (rr). Isso para prevenir a sensibilização a antígenos Rh e subseqüente formação de anticorpos Rh. O mais comum anticorpo Rh é anti-D, mas é possível formar anticorpos para c, C, e e E também, e formar combinações de anticorpos. Não existe o anti-d (BEIGUELMAN, 2003). 3.3 Determinação laboratorial dos antígenos do sistema Rh Para Beiguelman (2003) e Henry (2008) não existem anticorpos naturais no sistema Rh, sendo os anticorpos presentes apenas nos indivíduos sensibilizados por inoculação prévia. A inoculação pode ocorrer por episódios de transfusão incompatível ou, na mulher, devido à introdução, no sangue materno da mãe Rh negativo, de hemácias provenientes de uma gravidez ou aborto de filho Rh Positivo. Este fato tem duas implicações importantes: Toda mulher Rh negativa grávida de um pai Rh Positivo deve tomar medidas especiais para evitar ser sensibilizada. Inexiste na determinação laboratorial dos antígenos do sistema Rh, prova reversa análoga à praticada no caso do sistema ABO. A presença de antígenos fracos torna desaconselhável a determinação dos antígenos do sistema Rh em lâmina, pois nesta metodologia alguns dos antígenos mais fracos (que deveriam ser classificados como Rh positivos) podem ser incorretamente classificados como Rh negativos. No Brasil, a legislação estabelece como necessária à determinação do fator Rh em microplacas escavadas e/ou através da centrifugação em tubos de ensaio. Nessas metodologias, é obrigatória a investigação dos antígenos Rh fracos (antigamente designados como Du ou D Fraco) por meio de incubação a 37ºC e com acréscimo de Albumina bovina a 22%, e pela prova de Coombs. É também possível à determinação direta do D fraco pelo método de gel-centrifugação, também admitido na legislação brasileira. Neste método, o Rh fraco é determinado diretamente através da intensidade de aglutinação, classificada em ausente ou se positiva em intensidades de (+) até (++++). (ALVES; BERTHIER; SAD, 1982; HENRY, 2008). Em todos os métodos, é recomendada para os pacientes Rh negativos a determinação dos antígenos C, c E, e, a qual pode ser executada através do uso de

40. 39 soro poliespecífico "CDE". Isto classifica estes pacientes em Rh Negativo e Rh negativo, CDE Positivo (HENRY, 2008). 3.4 Du ou D Fraco A grande importância em se caracterizar molecularmente o antígeno RhD fraco deve-se ao fato de não ser possível distinguir sorologicamente o antígeno RhD fraco de alguns antígenos RhD parciais e não se conseguir determinar o tipo de antígeno RhD fraco presente na amostra. De acordo com a literatura, a maioria dos indivíduos que apresentam o fenótipo RhD fraco não desenvolve anticorpos anti-D e pode ser transfundida com sangue RhD positivo (WAGNER; FLEGEL, 2004). Para Wagner et al., (2000) o antígeno RhD fraco, apresenta fraca expressão do antígeno RhD e, dependendo do anti-soro anti-D utilizado, reage apenas pelo teste da antiglobulina humana. O antígeno RhD fraco surgiu como uma conseqüência de mutações de ponto missenses em diferentes éxons do gene RHD.9 Atualmente, mais de 30 tipos já foram descritos. As substituições dos aminoácidos dos diferentes tipos de RhD fraco estão localizadas nos segmentos transmembranares e intracelulares da proteína RhD. Este fato explica a fraca expressão do antígeno RhD na membrana da hemácia, bem como a ausência de aloanticorpo anti-D na maioria dos indivíduos RhD fracos. O mecanismo relacionado com a expressão reduzida do antígeno RhD fraco não está totalmente esclarecido, e sua expressão difere dependendo do tipo presente na membrana da hemácia. Mutações missenses que ocorrem no gene RHD fraco parecem envolver regiões importantes relacionadas com a integração da proteína Rh com a membrana das hemácias ou com a glicoproteína RhAG (WAGNER et al., 2000). O reconhecimento de amostras com fraca expressão do antígeno RhD depende do método e da qualidade do reagente anti-D empregado. A utilização de anti-D monoclonais de baixa afinidade e a dificuldade na obtenção de anti-D policlonais de boa qualidade têm causado discrepâncias entre os resultados da fenotipagem RhD e algumas vezes deixado de detectar antígenos RhD fraco com baixa densidade antigênica. (WAGNER et al., 2000). A não detecção destes antígenos em doadores de sangue pode causar aloimunização anti-D nos pacientes RhD- negativo transfundidos com estas

41. 40 hemácias. Por outro lado, muitos indivíduos classificados sorologicamente como RhD fraco são na verdade RhD parcial. Como a diferenciação entre os antígenos RhD fraco e RhD parcial é difícil de ser caracterizada na rotina sorológica, muitos pacientes têm produzido anti-D pelo fato de terem sido considerados RhD positivo. (MOLLISON; ENGELFRIET; CONTRERAS, 1997) Anti-soros monoclonais anti-D IgG e IgM têm sido produzidos para substituir os policlonais na determinação do antígeno D. No entanto, pouco se conhece a respeito da utilização destes reagentes na detecção dos antígenos RhD fraco (MOLLISON; ENGELFRIET; CONTRERAS, 1997). 3.5 Teste para a determinação de Rh Fraco ou D Fraco 3.5.1 Amostra Sangue total 3.5.2 Coleta da amostra Colher no mínimo 2 mL de sangue total com ou sem anticoagulante. 3.5.3 Técnica em tubo Obs.: Os itens “a ao f” é o teste para determinação do fator Rh. Caso a pesquisa para o "D Fraco" seja feita imediatamente após o Rh deve ser continuado com esses mesmos tubos (BEIGUELMAN, 2003; HENRY, 2008). a) Para cada amostra de paciente marcar dois tubos de ensaio com a identificação: D, C; b) Colocar em cada tubo duas gotas de soro correspondente, como segue: c) tubo D: soro anti-D; tubo C: controle de Rh; d) Colocar em cada tubo duas gotas da suspensão de hemácias; e) Centrifugar a 2.700 rpm por um minuto; f) Fazer a leitura. Continuar o teste se esta leitura for negativa ou duvidosa;

42. 41 g) Colocar esse tubo no Banho-Maria a 37° por 15 minutos junto com os mesmos C tubos de ensaio identificados como D e C da classificação direta no Banho-Maria; h) Centrifugar por 15 segundos a 2.500 rpm; i) Fazer a leitura; j) Lavar 03 (três) vezes com salina; k) Adicionar 02 gotas de soro antiglobulina humana; l) Centrifugar por 1minuto 2.700 rpm; m) Fazer a leitura. 3.5.4 Leitura Consiste na observação da presença ou ausência de aglutinação. Aglutinação: esta leitura deve ser feita utilizando o aglutinoscópio como fonte de luz abaixo dos tubos, e verificando a presença de aglutinação (grumos). Graduar a reação quanto à intensidade da reação. Obs.: A liberação do botão de hemácias formado no fundo do tubo após a centrifugação deve ser delicada, pois movimentos bruscos podem desmanchar aglutinações mais fracas (BEIGUELMAN, 2003; HENRY, 2008). 3.5.5 Resultado Doador com teste para a variante D Fraco Positivo: deverá ser tratado como Rh positivo para fins de uso desse sangue em transfusão. Paciente com teste para a variante D Fraco Negativo: deverá ser tratado como Rh foi negativo (BEIGUELMAN, 2003; HENRY, 2008). 3.5.6 Observações relativas ao Sistema Rh No tubo C não deve haver aglutinação, pois é um controle negativo. Caso isso ocorra, não é valido o resultado obtido na classificação. Repetir a prova com uma suspensão de hemácias lavadas. Caso continue o problema deve se pensar na possibilidade de contaminação da amostra do paciente. Nova amostra deve ser coletada e testada.

43. 42 Coletar algumas informações sobre o paciente que podem esclarecer essa discrepância. São elas: idade, sexo, diagnóstico, medicamentos em uso, testes imunológicos anteriores, resultado de outras classificações. Se após essas mudanças iniciais continuar o problema, solicitar ajuda ao bioquímico responsável pelo setor ou ao médico diretor plantonista do dia. Sempre que a classificação o paciente/doador for negativa, deve ser feito o teste para determinar a presença da variante D fraco (BEIGUELMAN, 2003; HENRY, 2008). 3.6 Prevalência Rh + e Rh (-) 85% das pessoas possuem nas hemácias um antígeno Rh. Estas pessoas são Rh+ (positivas). 15% das pessoas não possuem nas hemácias o fator Rh e são Rh- (negativas) (PORTARIA 1.376 DO MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008). 3.7 Transfusões no sistema Rh Segundo Henry (2008) três situações descrevem os fenômenos encontrados na quase totalidade das situações clínicas: Os pacientes Rh negativo representam em torno de 15% dos receptores; estes pacientes devem receber sangue Rh negativo, e podem doar para qualquer tipo. Em circunstâncias especiais, é considerada aceitável a transfusão de sangue Rh negativo, CDE positivo a estes pacientes. Esta, contudo, deve ser evitada. Pacientes Rh negativo, CDE positivo perfazem menos de 1% dos indivíduos. Devem receber sangue Rh negativo, mas seu sangue ordinariamente é doado a receptores Rh positivo. Os pacientes Rh fraco (antigamente designados como Rh negativo, Du positivo) são equiparados aos pacientes Rh Positivo, considerando-se haver uma diferença apenas quantitativa (e não qualitativa) na expressão de seu antígeno. Juntos, perfazem o total de aproximadamente 85% dos indivíduos. Podem receber sangue de qualquer tipo, mas doam apenas aos pacientes Rh positivo ou fraco.

44. 43 3.8 Eritroblastose Fetal ou Doença Hemolítica do recém-nascido A eritroblastose (do grego eritro, "vermelho" e blastos, "germe", "broto") fetal, doença de Rhesus, doença hemolítica por incompatibilidade Rh ou doença hemolítica do recém-nascido ocorre quando uma mãe de Rh- que já tenha tido uma criança com Rh+ (ou que tenha tido contacto com sangue Rh+, numa transfusão de sangue que não tenha respeitado as regras devidas) dá à luz uma criança com Rh positivo. Depois do primeiro parto, ou da transfusão acidental, o sangue da mãe entra em contacto com o sangue do feto e cria anticorpos contra os antígenos presentes nas hemácias caracterizadas pelo Rh+. Durante a segunda gravidez, esses anticorpos podem atravessar a placenta e provocar a hemólise do sangue da segunda criança. Esta reação nem sempre ocorre e é menos provável se a criança tiver os antigénios A ou B e a mãe não os tiver (CHAUDHURI et al., 1995). Os anticorpos anti-Rh não existem naturalmente no sangue das pessoas, sendo fabricados apenas por indivíduos Rh-, quando estes recebem transfusões de sangue Rh+. Pessoas Rh+ nunca produzem anticorpos anti-Rh, pois se o fizessem provocariam a destruição de suas próprias hemácias (CHAUDHURI et al., 1995). No passado, a incompatibilidade podia resultar na morte da mãe ou do feto, sendo, também, uma causa importante de incapacidade em longo prazo - incluindo danos cerebrais e insuficiência hepática. A situação era tratada através da transfusão do sangue do bebe, caso este sobrevivesse, logo após o nascimento ou, mais raramente (e com alguma controvérsia) através de terapia fetal, como em 1963 - altura em que se realizou a primeira transfusão de sangue a um feto. Hoje se pode tratar com alguns anti-soros anti-Rh (+) (Mathergan, Partogama ou RhoGAM - esta última também designada por imunoglobulina anti-D, em referência ao antigénio D, o mais importante antigénio do fator Rh). Nesse caso, sempre que uma mãe tenha sangue RhD negativo (o D refere-se especificamente ao antigénio D - não aparece nas habituais análises para determinação do grupo sanguíneo), é necessário verificar qual é o grupo sanguíneo do bebe. Se este for Rh+, a mãe deve receber uma injeção de imunoglobulina contra o fator Rh nas primeiras 72 horas após o parto, de forma a impedir a formação dos anticorpos que poderiam criar complicações nas gestações seguintes (CHAUDHURI et al., 1995; HENRY, 2008).

45. 44 3.8.1 Sensibilização materna De acordo com Henry (2008) mulheres Rh- produzem anticorpos anti-Rh ao gerarem filhos Rh+. Durante a gravidez, e principalmente na hora do parto, ocorrem rupturas na placenta, com passagem de hemácias da criança Rh+ para a circulação da mãe. Isso estimula a produção de anticorpos anti-Rh e adquirir a memória imunitária, ficando sensibilizada quanto ao fator Rh. Na primeira gravidez a sensibilização é geralmente pequena e o nível de anticorpos no sangue não chega a afetar a criança. Na hora do parto, porém, a sensibilização é grande, de modo que, em uma segunda gestação, se o feto for Rh+, o sistema imunológico já está preparado e vacinado contra o fator Rh, os anticorpos anti-Rh atravessam a placenta e destroem as hemácias fetais, processo que ocorre incessantemente ao longo de todo período da gestação. Figura 3 – Sensibilização Materna Mãe Sensibilizada pelo sangue Passagem do anti- Anticorpos da mãe Rh- Rh+ do filho produzindo Rh da mãe para o atacando as Hemácias do filho anticorpos anti-Rh. feto Rh+, causando a hemólise destas. Fonte: Eritroblastose Fetal. Autora: Sandra Eulália Santos. Disponível no site: www.ufv.br 3.8.2 Sintomas e Tratamento A destruição das hemácias leva à anemia profunda, e o recém-nascido adquire icterícia (pele amarelada), devido ao acúmulo de bilirrubina, produzida no fígado a partir de hemoglobina das hemácias destruídas. Como resposta à anemia, são produzidas e lançadas no sangue hemácias imaturas, chamadas de

46. 45 eritroblastos. A doença é chamada de Eritroblastose Fetal pelo fato de haver eritroblastos em circulação ou doença hemolítica do recém-nascido. (HENRY, 2008). Se o grau de sensibilização da mãe é pequeno, os problemas se manifestam apenas após a criança nascer. Nesse caso, costuma-se substituir todo o sangue da criança por sangue Rh-. Com isso, os anticorpos presentes no organismo não terão hemácias para aglutinar. Como as hemácias têm em média três meses de vida, as hemácias transferidas vão sendo gradualmente substituídas por outras fabricadas pela própria criança. Quando o processo de substituição total ocorrer, já não haverá mais anticorpos da mãe na circulação do filho (HENRY, 2008). Logo após uma mulher Rh- dar à luz a um filho Rh+, injeta-se nela um a quantidade de anticorpos anti-Rh, imunoglobulina, cuja função é destruir rapidamente as hemácias fetais Rh+ que penetram na circulação da mãe durante o parto, antes que elas sensibilizem a mulher, para que não haja problemas nas seguintes gestações (YAMAMOTO, 2001; HENRY, 2008). 3.8.3 Incidência Estima-se que a incompatibilidade do fator RH seja a causa do retardamento mental de 3 a 4% dos portadores de deficiência mental institucionalizados na Associação dos Pais e Amigos dos Excepcionais de Araraquara (APAE). Calcula-se haver um caso em cada 150 a 200 nascimentos (APAE, 2008). 3.9 Grupos Sanguíneos em doação de Sangue Há quatro principais grupos sangüíneos: A, B, AB, e O. Esses grupos diferem quanto à presença ou à ausência das duas substâncias químicas (A e B) nos glóbulos vermelhos, e quanto à presença ou à ausência dos dois fatores (anti-A e anti-B) no soro (tabela 08). Deve-se notar que embora o soro e o plasma sejam semelhantes, a diferença entre eles é que no soro, o fator fibrinogênio e muitos dos outros fatores coagulantes estão ausentes. Assim, o soro, por si só, não se pode coagular por causa da falta desses atores, os quais encontram-se, ao contrário, no plasma (BEIGUELMAN, 2003; HENRY, 2008). Um indivíduo do grupo O (ó) é conhecido como doador universal, em vista do fato de que os seus glóbulos vermelhos não contêm a substância A nem a B.

47. 46 Contudo, tal indivíduo não poderá receber sangue de ninguém a não ser de um outro do grupo O, uma vez o soro deste contém ambos os fatores Anti-A e Anti-B. Por outro lado, uma pessoa com o grupo AB pode receber transfusão de sangue de qualquer doador, e será denominado receptor universal; mas poderá doar sangue somente a uma outra pessoa do grupo AB (BEIGUELMAN, 2003; HENRY, 2008). Além dos grupos A, B, O, um outro item de suma importância no trabalho de transfusão é o fator Rh, como mostra a figura 07. Esse fator ou essa substância é transportado/a nos glóbulos vermelhos do sangue. Cerca de 83% da população tem o fator Rh no sangue, e diz-se que pessoas nessa condição possuem fator Rh positivo. Os restantes 17 por cento, que não possuem o fator Rh no sangue, são ditas ter o fator Rh negativo. Assim sendo, se uma pessoa de sangue Rh negativo receber a transfusão de sangue de Rh positivo, seu corpo começará a produzir anticorpos, coisa que, conseqüentemente, destruirá o sangue transfundido. A sensitização (ou seja, o processo de se produzirem anticorpos), que costumeiramente resulta, poderá causar uma séria reação. Talvez seja necessário aqui acrescentarmos que, antes de se aceitar o sangue de um doador em potencial, é preciso que se o analise para se detectar doenças como a hepatite, malária, sífilis e a síndrome da deficiência imunológica adquirida (AIDS), em vista do fato de que essas doenças poderão ser transmitidas pela transfusão (BEIGUELMAN, 2003; HENRY, 2008). Figura 04 – Doação e Recepção do Sistema ABO e Sistema Rh. Fonte: AnikLab: Site de apoio para estudantes e profissionais da área de Analises Clínicas. Por Carlos Eduardo Maia. Disponível em: http://aniklab.blogspot.com/2007/05/tipos-de-sangue.html

48. 47 3.9.1 Indicações para Transfusão Segundo Beiguelman (2003) e Henry (2008) há basicamente duas razões generalizadas que poderão necessitar de uma transfusão, e estas são: (a) perda de sangue e (b) falta de elementos vitais no sangue. a) Perda de Sangue A perda de sangue poderá resultar na redução do volume de sangue em circulação, e isso poderá ser precipitado pelos seguintes fatores: Hemorragias causadas por ferimentos, ou em casos de úlcera e distúrbio gastrointestinal, ou nos partos. Ferimentos, queimaduras e escaldamento, em casos acidentais. Cirurgia operatória, como no caso da cardiovascular, e em outras formas de cirurgia. Incompatibilidade de sangue entre a mãe e o filho. Em tais casos, uma troca de transfusões tem de ser empreendida para salvar a vida da criança. Anemia, aguda e crônica, bem como desordens coagulatórias, tal como hemofilia. b) Falta de Elementos Vitais O paciente poderá às vezes não requerer a transfusão por inteiro, mas precisará apenas e certos elementos vitais, como nos seguintes casos: Um paciente anêmico que esteja sofrendo de falta de glóbulos vermelhos poderá então requerer a transfusão apenas dos glóbulos vermelhos. Um paciente com hemofilia, resultante de uma desordem congênita, estará arriscado a ter anemia ou uma perigosa perda de sangue, caso mantenha aberto qualquer ferimento, por menor que seja. Isso é por causa que o seu (dele ou dela) sangue tende a se coagular mui lentamente. Portanto, para estancar a sangria ou hemorragia ele ou ela iria requerer a transfusão do plasma sangüíneo. Alternativamente, o paciente deverá ser injetado com preparados de FAH (isto é, fator antihemofílico). Deve ser notado aqui que, uma vez que o plasma é destituído de corpúsculos sangüíneos, um paciente que sofre de séria hemorragia necessita pelo menos de um quartilho (0, 568 mL) de sangue integral para cada quartilho de plasma transfundido.

49. 48 4 OBJETIVOS 4.1 GERAL Os objetivos gerais deste trabalho foram: • Verificar textos relacionados ao assunto a ser estudado; • Conhecer a forma como esse assunto foi abordado e analisado em estudos anteriores. 4.2 ESPECÍFICO Os objetivos específicos deste estudo foram: • Conhecer os Sistemas de Grupos Sangüíneos ABO e Fator Rh; • Determinar a tipagem sanguínea;

50. 49 5 METODOLOGIA Foi realizado um levantamento bibliográfico, utilizando-se as palavras-chave "Grupos Sanguíneos, Sistema ABO e Fator Rh" nos indexadores MEDLINE (Literatura Internacional em Ciências da Saúde), PubMed, LILACS (Literatura Latinoamericana em Ciências da Saúde), COCHRANE, SCIELO (Scientific Electronic Library Online), BIREME, Google Scholar, dissertações e teses no período até outubro de 2011, estudos adicionais foram manualmente pesquisados nas listas de referências bibliográficas dos artigos potencialmente relevantes. Foram consideradas somente publicações em língua portuguesa, espanhola e inglesa.

51. 50 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS O Sistema ABO foi descrito em 1900 e permanece até hoje como o sistema mais importante dentro da prática transfusional, seguido pelo Sistema Rh, descoberto em 1940. A transfusão ABO/Rh incorreta pode resultar na morte do paciente, com uma reação hemolítica intravascular, seguida de alterações imunológicas e bioquímicas. Quando observamos o sistema ABO temos, nas hemácias, dois tipos de proteínas denominadas aglutinogênios A e aglutinogênios B, determinando o fenótipo sangüíneo. O plasma sangüíneo pode abrigar outras duas proteínas denominadas aglutininas anti-A e anti-B. Assim, os indivíduos pertencentes ao grupo AB possuem aglutinogênios A e aglutinogênios B, mas são desprovidos de quaisquer aglutininas. Os indivíduos portadores de sangue tipo A possuem aglutinogênios A e aglutininas anti-B. Os pertencentes ao grupo B possuem aglutinogênios B e aglutininas anti-A. Os indivíduos do grupo O, possuem aglutininas anti-A e aglutininas anti-B, ou seja, não possui aglutinogênios. Além do tipo de sangue A, B, AB ou O, o fator Rh tem grande importância clínica, pois uma pessoa com Rh negativo recebendo sangue de um doador com Rh positivo poderá produzir anticorpos anti Rh. O sistema Rhesus é o segundo mais importante sistema de tipagem e classificação sanguínea, descoberto nos anos 40 por Landsteiner e Wiener, quando perceberam que, injetando sangue do macaco do gênero Rhesus em cobaias, ocorria a produção de anticorpos para combater as hemácias introduzidas, sendo assim, concluíram que na membrana das hemácias do macaco Rhesus havia um antígeno denominado fator Rh (Rhesus). Testando sangue humano com anticorpos anti-Rh cientistas verificaram que em 85% do sangue humano testado ocorria aglutinação, ou seja, os anticorpos anti-Rh reconheciam o antígeno Rh na superfície das hemácias humanas. Foram descritos cinco antígenos Rh diferentes (C, c, D, E, e) sendo o antígeno RhD o mais imunogênico. Portanto, o termo fator Rh refere-se somente ao antígeno RhD. Indivíduos que apresentam o antígeno RhD na superfície das suas hemácias são denominados de Rh positivos (Rh+) e os que não possuem o antígeno RhD são chamados de Rh negativos (Rh -).

52. 51 REFERÊNCIAS ALVES, L.M.; BERTHIER, ME.; SAD W.E. Transfusion, United States of America, ed. 3, v.22, p.246-247, maio/jun. 1982. Disponível em: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/trf.1982.22.issue-3/issuetoc>. Acesso em: 10 julho. 2011. APAE - Associação dos pais e amigos dos axcepcionais de Araraquara, 2008. Disponível em: <www.apae.com.br/araraquara>. Acesso em: 28 setembro. 2011. BARJAS, M.L.R.; SAAD, S.T.O. Absence of the G871A mutation in A3 blood donors from Brazil. Transfusion, United States of America, ed. 5, v. 37, p.564, maio. 1997. Disponível em: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1537- 2995.1997.37597293890.x/abstract>. Acesso em: 17. agosto 2011. BEIGUELMAN, B. Os sistemas sanguíneos eritrocitários. Ribeirão Preto: Funpec, 2003. 3. ed. 243 p. Cavasini et al. Duffy blood group genotypes among malaria patients in Rondônia, Western Brazilian Amazon. Revista Sociedade Brasileira Medicina Tropical, v. 34, n. 6, p.591-595, dez. 2001. Disponível em: <http://www.sbhh.com.br/reservado/revista/20050002/79.pdf> Acesso em: 15 julho. 2011. CHAUDHURI, A.; POLYAKOVA, J.; ZBRZEZNA, V.; POGO, O. The coding sequence of Duffy blood group gene in humans and simians: restriction fragment lenght polymorphism, antibody and malarial parasite specificities, and expression in non-erithroid tissues in Duffy negative individuals. Blood, United States of America, v. 85, n. 3, p. 615-621, fev. 1995. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=Link&db=pubmed&dbFrom=PubMed &from_uid=7833467>. Acesso em: 26 setembro 2011.

53. 52 DENOMME, G.A, RIOS, M.; REID, M.E. Molecular Protocols in Transfusion Medicine. 1. ed. San Diego: Academic Press, 2000. 186 p. HARMENING, D.M. Modern blood banking and transfusion practices. 4. ed. Philadelphia: F. A. Davis Co, 1999. 2069 p. HENRY, J.B. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais. 20 ed. São Paulo: Manole, 2008. 304 p. Imunohematologia Eritrocitária – SBHH – Sociedade Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. Disponível em:<http://www.sbhh.com.br/home/imunoterapia.htm>. Acesso em: 02 outubro. 2011. MOLLISON, P.L.; ENGELFRIET, C.P.; CONTRERAS, M. Transfusion in Clinical Medicine. 10. ed. Oxford: Blackwell Science, 1997. 1010 p. OLSSON, M.L.; CHESTER, M.A. Polymorphism and recombination events at the ABO locus: a major challenge for genomic ABO blood grouping strategies. Transfusion Medicine, United States of America, v. 11, n. 4, p. 295-314, ago. 2011. Disponível em: < http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365- 3148.2001.00320.x/full>. Acesso em: 14 agosto. 2011. OLSSON, M.L.; THURESSON, B; IRSHAID, N.M.; HOSSEINI-MAAF, B.; HELBERG, A.; MOULDS, M.K.; SARENEVA, H.; CHESSER, A. Genomic analysis of clinical samples with serologic ABO blood grouping discrepancies: identification of 15 novel A and B subgroup alleles. Biochem Biophys Res Commun, United States of America, v. 216, n. 2, p. 642-647, nov. 1995. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s151684842003000100008>. Acesso em: 16 agosto. 2011. PORTARIA 1.376 DO MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008. Disponível em: <www.pros angue.sp.gov.br/prosangue/arquivos/constituição/portaria.> Acesso em: 04 outubro. 2011.

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