Faculdade de Ciências e Tecnologias da Universidade Nova de Lisboa
Instituto de Medicina Molecular
Unidade de Bioquímica F...
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Agradecimentos
Neste projecto tive oportunidade de contar com o valioso apoio de várias pessoas, sem o
contributo das qu...
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Índice
Resumo 7
Introdução 8
Vírus HIV 9
Morfologia do vírus 10
Ciclo de replicação 11
Processo de fusão 12
Estrutura da...
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Métodos 26
Partição para membranas 26
Anisotropia de fluorescência em estado estacionário 27
Variações no potencial dipo...
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Resumo
Em 1965 foram descritos os primeiros sistemas de bicamadas fosfolipídicas fechadas,
denominadas de lipossomas. Du...
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Summary
In 1965 the first liposomes, suspended bilayered structures composed by lipid molecules, were
described. During ...
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Introdução
O vírus HIV é o responsável pela SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida.
Esta doença surgiu por adapta...
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 Os Inibidores da Protéase, inibem a enzima de clivar poliproteínas impedindo-a de
criar proteínas de menor tamanho e c...
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Morfologia do vírus
Figura 1- Estrutura da partícula viral HIV-1 (Adaptado da referência [1] )
O vírião do HIV é formad...
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Ciclo de replicação
Figura 2 – representação do ciclo de vida do vírus HIV-1- adaptado da referência [4]
O ciclo de vid...
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A fase tardia inicia-se com a clivagem das moléculas de RNA viral no núcleo da célula
hospedeira, sendo estas posterior...
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Figura 3 - Representação do processo de fusão e do mecanismode inibição
Estrutura da Proteína viral gp41
A gp 41 é uma ...
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Lipidoma e interacções lipídicas
Estudos demonstraram que o envelope lipídico do vírus HIV-1deriva da membrana
plasmáti...
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A dependência das membranas virais por colesterol e esfingomielinas sugere a utilização de
fármacos capazes de perturba...
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Inibidores de fusão
Inibidores de fusão são uma das classe de fármacos anti-retrovirais utilizadas no tratamento
da inf...
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CDR2 e CDR3), que reconhecem e ligam-se especificamente a um determinado
antigénico, formando um complexo antigénio-ant...
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durante o processo de fusão. As alterações conformacionais que ocorrem na gp41 durante o
processo de fusão conduzem à e...
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Figura 5 – Mecanismo de actuação do inibidor de fusão, Enfuvirtide, na inibição do vírus HIV.
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Sifuvirtide
O Sifuvirtide é um péptido inibidor de fusão de segunda geração com uma eficácia
melhorada e com resultados...
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LJ001
O LJ001 é uma molécula anfipática, de pequenas dimensões, derivada da rodanina, que é
derivada de tiazolidinas pr...
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Lipossomas
Estas vesículas podem ser definidas como associações coloidais de lípidos anfipáticos,
organizadas em estrut...
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No entanto, a área de maior interesse científico tem sido na utilização como sistemas
transportadores de fármacos com a...
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Lipossomas como sistemas de drug delivery
Apesar dos avanços médicos em prolongar a vida das pessoas mantém-se as dific...
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A extrusão de lipossomas representa assim uma primeira tentativa para produzir uma
população de vesículas unilamelares ...
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Parte Experimental
Reagentes e Químicos
Os sdAb F63, F63-MPR e F63-CRAC foram expressos e purificados pelo grupo do
Pro...
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(1:1) e POPC:Chol (2:1). O tampão de amostra foi utilizado para preparar todas as restantes
amostras a não ser que menc...
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onde IW e IL correspondem, respectivamente, à intensidade de fluorescência da amostra em
meio aquoso e em concentrações...
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Resultados e Discussão
Interacção dos Single Domain Antybody com modelos miméticos
Figura 7 - Interacção dos sdAb com m...
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Figura 8 – Variações no potencial dipolar membranar. Espetros de excitação diferenciais da sonda di-8-
ANEPPS (4µM) ins...
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Em membranas com colesterol podemos observar um ligeiro aumento do sinal para
anticorpos que possuem motivos estruturai...
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Quadro 2 - Coeficientes de partição da interacção do Sifuvirtide com misturas lipossomais
catiónicas.
O Sifuvirtide ads...
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vesiculas induz um aumento da hidrofobicidade do meio que leva a um aumento da
estabilização do péptido, ocorrendo um m...
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Quadro 2 - Coeficientes de partição da interacção do Sifuvirtide com misturas lipossomais
catiónicas.
Na presença de LU...
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Para fins de vectorização de Sifuvirtide e Enfuvirtide deverá sempre ter-se em conta uma
razão péptido/lipído catiónico...
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Efeito do LJ001 sobre a rigidez membranar
Figura 11 – Efeito da molécula de LJ001 na rigidez de membranas lipídicas. Va...
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Combinação do Sifuvirtide e LJ001 nas mesmas membranas lipossomas
Figura 12 – Presença de Sifuvirtide e LJ001 nas mesma...
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rígidas e por este não particionar para membranas fluidas, ainda que a presença de LJ001
posso rigidificar este tipo de...
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Combinação do Enfuvirtide e LJ001 nas mesmas membranas lipossomas
Figura 13 – Presença de Enfuvirtide e LJ001 nas mesma...
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Este ensaio foi realizado de forma a verificar a presença do péptido e do LJ001 em ambas
as membranas lipídicas, sendo ...
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Conclusão
O vírus HIV possui uma grande capacidade de mutação, é altamente transmissível e de
difícil erradicação, e po...
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tidos em conta, uma vez que a agregação diminuirá a biodisponibilidade e a acção
pretendida para este sistema.
A vector...
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Referências Bibliográficas
[1] Turner, B.G., and Summers, M.F. (1999). Structural biology of HIV. Journal of
Molecular ...
44
[12] Gallo, S.A., Finnegan, C.M., Viard, M., Raviv, Y., Dimitrov, A., Rawat, S.S., Puri, A.,
Durell, S., and Blumenthal...
45
[22] Conrath, K., Lauwereys, M., Wyns, L. and Muyldermans, S. (2000). Camel Single-
domain Antibodies as Modular Buildi...
46
[31] Yao, X., Chong, H., Zhang, C., Waltersperger, S., Wang, M., Cui, S., and He, Y.
(2012). Broad Antiviral Activity a...
47
[43] Matos, P.M., Franquelim, H.G., Castanho, M.A.R.B., and Santos, N.C. (2010).
Quantitative assessment of peptide–lip...
48
Anexos
Sequência dos anticorpos
sdAb F63 (18,6kDa)
E L V L T Q T P S S V P A A V G G T V T I N C S G G G S D S T D Y C ...
49
Tabela A1- Protocolo de adições para titulação de LUV
#
[L]
/mM
Vcuvette
/μL
V cumulativo
/μL
Vadicionar
/μL
CDiluição
...
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Figura A1- Mecanismo de ligação do vírus à membrana plasmática de uma célula.
Figura A2 – Representação das regiões Fab...
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Figura A3 – Esquema da estrutura da proteína gp41 do vírus HIV-1 e a sequência de
aminoácidos do Enfuvirtide localizada...
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Figura A5 - Esquema representativo das várias utilizações dos lipossomas e inter-relação
entre os diversos parâmetros q...
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Projecto final

  1. 1. Faculdade de Ciências e Tecnologias da Universidade Nova de Lisboa Instituto de Medicina Molecular Unidade de Bioquímica Física Desenvolvimento de um sistema transportador de fármacos anti-HIV que actuam ao nível do envelope viral Sónia Alves Projecto Licenciatura em Bioquímica Projecto orientado pelo Professor Doutor Miguel A. R. B. Castanho 2013
  2. 2. 3 Agradecimentos Neste projecto tive oportunidade de contar com o valioso apoio de várias pessoas, sem o contributo das quais este projecto de investigação não teria sido possível. Nomeio em primeiro lugar o professor Miguel Botas Castanho, orientador deste projecto, a quem agradeço ter-me dado a oportunidade de integrar o grupo de investigação de sistemas transportadores de fármacos anti-HIV, que desenvolve os seus trabalhos no Instituto de Medicina Molecular. O seu curriculum profissional conjugado com o seu prestígio académico constituem para mim um exemplo e funcionam como incentivo adicional para seguir esta licenciatura. De seguida tenho de nomear o Tiago Nascimento Figueira, a quem coube a tarefa de guiar os meus primeiros passos no acompanhamento desta investigação, pelo apoio e pela supervisão do trabalho desenvolvido. Agradeço-lhe pela paciência, pela dedicação e pelo seu exemplo. Não posso ainda deixar de mencionar todos os outros investigadores do Instituto de Medicina Molecular que de alguma forma se relacionaram comigo no decorrer deste projecto. Todos eles foram prestáveis, atentos e conhecedores, contribuindo de forma sempre positiva para o esclarecimento de dúvidas, para o direccionamento correcto das minhas opções e para que pudesse efectuar um trabalho melhor. A todos, o meu apreço por esta oportunidade de aprender e contribuir em projectos de investigação de tão grande valor. Neste momento, cabe-me ainda lembrar todos os professores da licenciatura de Bioquímica na Faculdade de Ciências e Tecnologia. Foram eles que primeiro me transmitiram os ensinamentos e experiências que agora tentei colocar em prática na elaboração deste trabalho. Por fim, e não menos importante, agradeço o apoio incondicional da minha família e o incentivo que me deram ao longo destes anos. Aos meus amigos mais próximos, aos colegas de curso mais chegados, agradeço a atenção e o tempo que me dedicaram. A todos, Obrigada!
  3. 3. 4 Índice Resumo 7 Introdução 8 Vírus HIV 9 Morfologia do vírus 10 Ciclo de replicação 11 Processo de fusão 12 Estrutura da proteína viral gp 41 13 Lipidoma e interacções lipídicas 14 Inibidores de fusão 15 Single Domain Antibody 15 Enfuvirtide 17 Sifuvirtide 19 LJ001 20 Lipossomas 21 Classificação dos lipossomas 21 Aplicações 21 Lipossomas como sistema de drug delivery 22 Parte Experimental 25 Reagentes e Químicos 25 Preparação de amostras 25 Instrumentação 26
  4. 4. 5 Métodos 26 Partição para membranas 26 Anisotropia de fluorescência em estado estacionário 27 Variações no potencial dipolar membranar 27 Resultados 28 Interacção dos Single Domain Antybody com modelos miméticos 28 Interacção do péptido Sifuvirtide com membranas catiónicas 31 Interacção do péptido Enfuvirtide com membranas catiónicas 33 Efeito do LJ001 sobre a rigidez membranar 36 Combinação do Sifuvirtide e LJ001 37 Combinação do Enfuvirtide e LJ001 39 Conclusão 41 Referências 42 Anexos 48
  5. 5. 6 Resumo Em 1965 foram descritos os primeiros sistemas de bicamadas fosfolipídicas fechadas, denominadas de lipossomas. Durante as últimas décadas desenvolveram-se grandes avanços nas indústrias médicas e farmacêuticas devido às potencialidades dos lipossomas como sistemas de transportes de fármacos. Os lipossomas nas suas várias formas têm a possibilidade de proporcionar a eficácia terapêutica na área da entrega de drogas e ao mesmo tempo servir a investigação científica fundamental como modelos simples de sistemas com elevada complexidade. Neste trabalho estudou-se por métodos de espectroscopia de fluorescência, quais as melhores composições lipídicas para a interacção de alguns inibidores de fusão do vírus do HIV, Sifuvirtide, Enfuvirtide e LJ001, com o objectivo de se desenvolver um sistema combinado de transporte de fármacos (drug delivery) lipossomal. Foi ainda estudada a interacção de um novo tipo de single domain antibodies (fragmentos de anticorpo) inibidores da fusão do HIV com modelos membranares lipossomais miméticos para o envelope viral e células do hospedeiro. Verificou-se selectividade diferente dos single domain antibodies para membranas com composições diferentes. A presença de colesterol nas membranas miméticas virais contribuiu para uma maior afinidade por parte dos anticorpos. Na presença de misturas de lípidos catiónicos, o Sifuvirtide apresentou resultados promissores para membranas fluidas, com as quais não possui afinidade na ausência de carga. Embora tenha demonstrado elevada afinidade para membranas catiónicas, o potencial de agregação com as vesículas do Enfuvirtide diminui a sua adaptabilidade para o transporte lipossomal. A capacidade de ambos os péptidos de se combinar com o LJ001 nos mesmos lipossomas reforça a hipótese colocada para um transportador dual.
  6. 6. 7 Summary In 1965 the first liposomes, suspended bilayered structures composed by lipid molecules, were described. During the last decades, substantial progress has been made in the pharmaceutical industry due to the potentials and applicability of liposomes as drug delivery systems. Liposomes in their various forms have the possibility to provide high therapeutic efficiency to the targeted delivery of biologically unstable drugs and at the same time serve fundamental scientific research as relatively simple models of more complex systems. In the present work we have studied, through fluorescence spectroscopy methodology, how different lipid compositions suit the interaction of HIV fusion inhibitor molecules Sifuvirtide, Enfuvirtide and LJ001, for the development of a combined liposomal drug delivery system. We also studied the interaction of a new type of single domain antibodies that also inhibit HIV entry with model membranes of the viral envelope and host cell membrane. Results show the studied single domain antibodies have different selectivity for the models used. Presence of cholesterol in liposomal models contributed for an increase in antibody interaction and higher apparent partition to the lipid phase. In the presence of cationic lipid mixtures, Sifuvirtide presented promising results for fluid phase liposomes that are unable to induce its partition when neutral. Although cationic liposomes ensued a high partition of Enfuvirtide, the observation of peptide mediated aggregation of vesicles in solution compromises its potential for drug delivery in these types of carriers. As both peptides were able to partition to the same zwitterionic liposomes as LJ001, the hypothesis for a dual delivery system that combines synergistic inhibitors is reinforce and new approaches become available.
  7. 7. 8 Introdução O vírus HIV é o responsável pela SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida. Esta doença surgiu por adaptação do retrovírus SIV que infecta chimpanzés e da África central, contudo, a doença não se manifestava nestes animais. Supõe-se que, durante muitos anos, o HIV manteve-se isolado numa pequena percentagem de população africana e os seus efeitos devastadores não foram suficientes para chamar a atenção do mundo científico. No entanto, com a mobilidade populacional intensificou-se a transmissão do vírus, permitindo que este se propagasse e fosse evoluindo por adaptação. Os estudos posteriores demonstraram que o HIV possuía uma grande capacidade de mutação tendo-se identificado duas estirpes: o HIV-2, uma versão menos agressiva, e o HIV-1, altamente mortífero. O vírus HIV foi isolado em 1983, pelos médicos e pesquisadores Robert Gallo (o qual demonstrou que o vírus era responsável pela SIDA) e Luc Montagnier (responsável pelo isolamento do vírus). Actualmente, estima-se que o número de pessoas infectadas por esta doença seja superior a 40 milhões em todo o mundo. Altamente transmissível e sem cura, tem-se apostado no tratamento com medicamentos anti-HIV com vista á diminuição da quantidade de vírus no organismo, de forma, a aumentar a qualidade de vida da pessoa infectada, atrasando a evolução da doença e prevenindo a ocorrência de outras doenças associadas ao vírus – doenças oportunistas [1] . Durante os últimos anos a cura e o tratamento desta doença têm sido as motivações de trabalho de muitas comunidades científicas. No entanto, a capacidade de mutação do vírus provocou o surgimento de inúmeras estirpes de HIV, inviabilizando o desenvolvimento de uma vacina que permita. Os tratamentos mais usuais são compostos por diferentes classes de medicamentos que têm por principal objectivo o de retardar os danos causados pelo vírus e reduzir a sua quantidade na corrente sanguínea - até que a sua detecção seja quase impossível, o que significa que a reprodução do vírus é mínima e a doença não progride. Na terapêutica da SIDA [1] utilizam-se vários tipos de inibidores que actuam em diferentes fases do ciclo de reprodução do vírus, sendo os mais relevantes:  Os inibidores de Integrase que impede a inserção do material genético do vírus no genoma da célula hospedeira.  Os Inibidores da Transcriptase Reversa, actuam dentro da célula CD4, inibindo esta enzima, e impedem que o RNA viral seja convertido em DNA viral evitando que ocorra multiplicação do vírus para contágios de novas células.
  8. 8. 9  Os Inibidores da Protéase, inibem a enzima de clivar poliproteínas impedindo-a de criar proteínas de menor tamanho e com a conformação desejada pelos viriões do HIV. Desse modo, ao inibirmos a protéase, os viriões perdem a capacidade de infectar novas células.  Os Inibidores de Fusão actuam nas membranas lipídicas do vírus e dos linfócitos CD4 impedindo a fusão e, por consequência, a passagem do material genético do vírus para a célula. Sendo estes os inibidores utilizados no trabalho experimental. Vírus HIV A Síndrome da Imunodeficiência adquirida (SIDA) foi descoberta em 1981, constituindo-se como uma grande ameaça para a saúde humana desde então. A causa desta doença seria identificada em 1983 e, posteriormente, foi nomeado o vírus da imunodeficiência humana (VIH). O HIV é o retrovírus envelopado, que provoca a infecção principalmente a partir de células do sistema imunitário - células-T e macrófagos, o que resulta em infecções oportunistas fatais. [2] Tratamentos actuais envolvem uma mistura de antivirais combinados, visando a inibição do vírus nas várias etapas do seu ciclo de vida, aumentado consideravelmente o tempo de vida dos pacientes e a sua qualidade de vida, porém continua a não estar disponível uma estratégia eficaz e capaz de erradicar o vírus do organismo. [2] A magnitude desta epidemia, e o desafio de desenvolver um tratamento eficaz, conduziu a uma extensa investigação sobre os mecanismos moleculares de compostos que actuam no ciclo de vida do vírus em diferentes fases. O HIV-1, a versão mais severa e com taxa de transmissão mais elevada, pertence à família Retroviridae, género Lentivirus, que inclui os retrovírus com genomas mais complexos.[1] [2]
  9. 9. 10 Morfologia do vírus Figura 1- Estrutura da partícula viral HIV-1 (Adaptado da referência [1] ) O vírião do HIV é formado por uma bicamada lipídica do envelope viral de origem celular e inclui várias proteínas derivadas da célula hospedeira, incluindo os principais antigénios de histocompatibilidade, actina e de ubiquitina [3] . Associadas ao envelope viral existem dois tipos de glicoproteínas responsáveis pela ligação a receptores presentes na membrana das células hospedeiras: a glicoproteína externa (gp120) e a glicoproteína transmembranar (gp41). A glicoproteína externa e a transmembranar organizam-se em heterodímeros com estrutura trimérica formando os espigões virais [4] . A proteína matriz (p17) reveste a superfície interna da membrana viral, que envolve uma cápside (p24) de forma icosaédrica que ocupa o centro do virião. No interior da cápside existem duas cópias de RNA viral de cadeia simples positiva estabilizadas por um complexo de proteínas da nucleocápside (p7) formando um complexo ribonucleoproteíco que contém três enzimas essenciais: a protease (RP), a transcriptase reversa (RT) e a integrase (IN). Na cápside ainda existem outras proteínas virais Nef, Vif, Vpr e Vpu (não ilustradas na Figura 2).
  10. 10. 11 Ciclo de replicação Figura 2 – representação do ciclo de vida do vírus HIV-1- adaptado da referência [4] O ciclo de vida pode ser dividido em duas fases. A primeira fase inicia-se com o reconhecimento da célula alvo pelo virião maduro e envolve todos os processos que conduzem à integração do DNA viral no cromossoma da célula hospedeira. A segunda fase designa-se por fase tardia e começa com a expressão regulada do genoma viral integrado e envolve todos os processos até á maturação do vírus [1] . A fase inicial começa com a fusão do invólucro viral e da membrana plasmática da célula hospedeira. A fusão é mediada pelas proteínas do invólucro viral, gp120 e gp41. A ligação ocorre através de interacções específicas entre as glicoproteínas do envelope viral e os receptores de quimioquinas (CCR5 ou CXCR4) presentes nas células. As células susceptíveis à infecção são as células CD4+, nomeadamente linfócitos T CD4+, macrófagos, monócitos e células dendítricas. A ligação ao receptor induz uma série de mudanças estruturais na gp120 que são desencadeadas pela gp41 para expor, estender e inserir a sua extremidade N-terminal do péptido de fusão hidrofóbico em membranas celulares. [1] [5] Após a fusão, a cápside do virião é libertada no citoplasma celular onde sofre desintegração expondo o seu conteúdo, e o RNA viral é convertido em DNA viral de cadeia dupla, reacção essa que é catalizada pela enzima transcriptase reversa (RT). O DNA viral de cadeia dupla é exportado para o núcleo para ser integrado no genoma da célula hospedeira pela integrase viral, e ser transcrito, pela maquinaria celular.
  11. 11. 12 A fase tardia inicia-se com a clivagem das moléculas de RNA viral no núcleo da célula hospedeira, sendo estas posteriormente transportadas para o citoplasma, onde originam as proteínas reguladoras Nef, Tat e Rev. [1] [5] No retículo endoplasmático rugoso, ocorre tradução de RNAm originando a glicoproteína do invólucro viral (gp160), [6] que ao sofrer clivagem e origina as proteínas gp41 e gp120 , que são incorporadas na região da membrana celular que vai constituir o invólucro externo do virião. [6] O RNAm não clivado é retido no núcleo, onde permanece até ser processado ou degradado, permanecendo latente. A razão pela qual a erradicação do vírus não tem sido possível é devido a este estado de latência, em células infectadas, durante um longo período de tempo. Processo de fusão Como em todos os vírus envelopados, o vírus HIV-1 deve fundir a sua bicamada fosfolipídica à membrana da célula hospedeira com a finalidade de transportar o seu genoma viral para o compartimento citoplasmático. A glicoproteína do envelope (env) do HIV medeia esta entrada através do processo de fusão. Estas glicoproteínas são produzidas a partir de um precursor, a gp160, que é clivada por uma protease no complexo de Golgi. Esta clivagem origina uma subunidade exterior, a gp120, e uma porção transmembranar, a gp41, necessária, mas não suficiente para que o processo de fusão. Após a proteólise, a gp120 e gp41 permanecem acopladas ao envelope viral como heterodímeros não covalentes. [6][8][9] Uma vez presente no organismo, o vírus é reconhecido pelas células dendríticas, formando um complexo que migra até aos nódulos linfáticos onde é apresentado às células T ocorrendo transferência do vírus para as células CD4+ por sinapse virológica. Para infectar as células CD4+ o genoma viral e algumas proteínas virais devem ser transferidas para o interior da célula, através da fusão das membranas, que leva á formação de um poro na superfície da membrana celular. Desta forma, o primeiro passo da fusão é o reconhecimento da gp120 da célula CD4+ e dos seus co-receptores de quimiocina (CCR5 ou CXCR4 que induzem uma série de mudanças estruturais na gp120, que causam um rearranjo dos domínios “inner” e “outer” da gp120. As alterações na gp120, levam á formação á conformação “pre-hairpin” da gp41, ou seja, á exposição de uma região altamente hidrofóbica da gp41, denominada por péptido de fusão (extremidade N-terminal) que se insere na membrana celular levando á fusão das membranas.[8] Para completar o processo de fusão, a membrana viral tem de assumir curvatura positiva para que ocorra formação do poro de fusão, e o seu material genómico entre no citoplasma da célula hospedeira. [4] [9] [10]
  12. 12. 13 Figura 3 - Representação do processo de fusão e do mecanismode inibição Estrutura da Proteína viral gp41 A gp 41 é uma glicoproteína transmembranar com uma estrutura trimérica, constituída por duas regiões conservadas hidrofóbicas com estrutura de hélice α intercaladas por uma loop: a região N-terminal ou HR2 (ectodomínio), onde está situado o péptido de fusão (região hidrofóbica de quinze aminoácidos que está envolvida no processo de fusão), a região C- terminal ou HR1 (domínio transmembranar que interage com proteína matriz). No seu estado nativo a gp160 encontra-se numa configuração não-fusogénica, em que a proteína gp41 está no seu estado nativo e é metaestável, sendo estabilizada pela gp120. No entanto, verificou-se que alterações conformacionais na gp120 permitem que a gp41 exponha as suas regiões HR1 e HR2 atingindo um estado mais estável. A gp41 enrola-se numa estrutura hairpin de seis hélices α expondo assim a região HR2, que possui o péptido de fusão que penetra na membrana do hospedeiro para que ocorra a fusão das membranas.[1] [12]
  13. 13. 14 Lipidoma e interacções lipídicas Estudos demonstraram que o envelope lipídico do vírus HIV-1deriva da membrana plasmática da célula do hospedeiro[13] , devido á presença de elevados níveis de lípidos encontrados nas membranas celulares, no entanto, existem algumas variações na sua composição, devido aos elevados teores de colesterol e esfingomielinas. A membrana celular é composta principalmente por glicerofosfolípidos, esfingolípidos e colesterol. A presença de elevadas quantidades de colesterol está directamente relacionada com a baixa fluidez da membrana, pelo que a composição lipídica da célula alvo tem um papel importante no processo de fusão do HIV, uma vez que foi verificado que o baixo conteúdo de colesterol pode ser um factor negativo no processo de fusão. A alteração do teor de glicoesfingolípidos nas células alvo também pode contribuir para a baixa susceptibilidade á entrada do vírus. Podemos portanto supor que os baixos valores destas moléculas nas membranas celulares contribuem como um mecanismo de defesa contra infecções, uma vez, que se encontram altamente presentes nas membranas virais.[11][14] O colesterol é sintetizado no reticulo endoplasmático e é subsequentemente transportado para os seus destinos celulares através do complexo de Golgi pela via secretora de vesiculas. Coincidentemente a síntese e transporte de esfingolípidos também ocorre no complexo de Golgi. Foi sugerido que a proximidade dos esfingolípidos e do colesterol no complexo de Golgi pode levar á formação de estruturas precursoras, denominadas de jangadas lipídicas, que podem ser transportadas para a superfície da membrana em vesiculas.[15] Jangadas lipídicas foram propostas para funcionarem como plataformas envolvidas na transdução de sinal e como veículos de patogenicidade. Vários agentes patogénicos, como o HIV-1, utilizam estas jangadas lipídicas em várias etapas do seu ciclo de replicação para obter controlo das células alvo e para exercer os seus efeitos patogénicos. Estudos verificaram que a depleção de colesterol destabiliza a estrutura do virião, provocando alterações conformacionais na gp41,provando que o colesterol é essencial para o processo de fusão, no entanto, isto não significa que o vírus tenha perdido a capacidade de se ligar às células alvo. [14] [15] Uma vez que o colesterol desempenha um papel fundamental na manutenção da membrana das jangadas lipidicas, argumentou-se que a inibição da infecção por HIV-1 pela depleção de colesterol é devida baixa densidade de co-receptores. No entanto, têm sido oferecidas explicações alternativas em relação ao papel do colesterol na entrada do HIV-1:  Colesterol é necessário para o processo de fusão das membranas;  Colesterol é necessário para a conformação e função adequada do CXCR4;  Toxicidade após a remoção do colesterol nas células.
  14. 14. 15 A dependência das membranas virais por colesterol e esfingomielinas sugere a utilização de fármacos capazes de perturbar a composição lipídica dos viriões como inibidores da infecção e do processo de fusão.[16] [17] Jangadas lipidicas em membranas biológicas apresentaram tamanhos pequenos entre 10 a 100nm devido á presença de proteínas membranares integrais que actuam como barreiras que limitam o tamanho destes domínios lipídicos. Estas proteínas possuem sequências de aminoácidos consensos que reconhecem e interactuam com o colesterol e estão envolvidas na regulação do seu transporte dentro da membrana.[18] Verificou-se recentemente que a gp41 possui uma região adjacente á extremidade N- terminal (segmento rico em resíduos de triptofano) termina com uma sequência de 5 aminoácidos (LWYIK) que corresponde ao motivo CRAC. Este motivo é inserido nas bicamadas lipídicas das células alvo durante o processo de fusão, verificando-se maior inserção nas bicamadas contendo maior quantidade de colesterol. Mutações na sequência do motivo CRAC resultaram na perda da captação de colesterol, que no caso do HIV-1é um factor negativo para a fusão de membranas. Concluiu-se que a presença de colesterol é essencial para a constituição de jangadas lipídicas, que contribuem para o aumento da patogenicidade do vírus, e é essencial a sua presença nas membranas virais e celulares para que ocorra o processo de fusão. [18] [19]
  15. 15. 16 Inibidores de fusão Inibidores de fusão são uma das classe de fármacos anti-retrovirais utilizadas no tratamento da infecção do vírus HIV. Esta classe de fármacos interfere com a fusão e a entrada do virião na célula hospedeira devido a alterações conformacionais das membranas virais ou celulares ou na proteína de fusão. Alguns destes fármacos são produzidos com base nas sequências das proteínas envolvidas no processo de fusão, que mimetizam regiões dessas proteínas que competem pelas regiões de ligação, impedindo transições entre a curvatura positiva para negativa necessárias para que ocorra a fusão das membranas. Single Domain Antibody São fragmentos de anticorpos que consistem num único domínio monomérico variável. Os anticorpos são glicoproteínas, produzidas pelos linfócitos B em resposta á presença de substâncias estranhas – os antigénios. As principais acções dos anticorpos são a neutralização de toxinas, destruição celular e fagocitose auxiliada pelo sistema complemento. Figura 4 – Representação da estrutura do anticorpo Os anticorpos encontram-se distribuídos por cinco classes (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE), sendo esta classificação dependente da região efectora do anticorpo, da posição e do número de ligações de dissulfureto. [20] A estrutura do anticorpo é globular, em forma de Y, sendo composto por quatro cadeias polipeptídicas interligadas e idênticas duas a duas. Possui duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) distintas pelo número e sequência de aminoácidos.A cadeia leve de um anticorpo consiste numa região variável (V) e numa região constante (C) que contêm, respectivamente, as extremidades amina (NH2) e carboxilo (COOH). Cada cadeia pesada é constituída na porção N-terminal por um domínio variável (VH ) e um domínio constante (CH1 ) ligados por uma porção C-terminal constituída por dois domínios constantes (CH2 e CH3 ). Cada região variável contém três sub-regiões em forma de ansa, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR1,
  16. 16. 17 CDR2 e CDR3), que reconhecem e ligam-se especificamente a um determinado antigénico, formando um complexo antigénio-anticorpo ou complexo imune. A região do antigénio reconhecida pelo anticorpo é denominada de epítopo, enquanto a região do anticorpo que reconhece o antigénio é o paratopo. O tratamento com uma protease permite a clivagem desta região originando o Fab (fragment antigen binding) e o Fc (constant region) que interage com a superfície das células. (Imagem em anexo) Fragmento Fab é composto pela cadeia L inteira e pelo domínio da cadeia H que contém a extremidade amina, enquanto o Fc engloba os segmentos de ambas as cadeias H em que estão as extremidades carboxilo. O Fc não está envolvido na especificidade do anticorpo ao antigénio, mas exerce funções de efector, tais como a fixação a proteínas do sistema de complemento. Como foi referido em cima, a maioria dos anticorpos são compostos por duas cadeias pesadas e duas leves e ambas as cadeias, na sua região variável contribuem com dois locais de ligação ao antigénio. Além destes anticorpos convencionais os camelos, tubarões, lamas produzem anticorpos incomuns compostos apenas por cadeias pesadas, com o domínio variavel constituído por três CDR e não possuem o domínio CH1. Portanto, o local de ligação ao antigénio é formado por um único domínio, Fc. O domínio variável é designado VHH para camelos e VNAR para tubarões, mas mais geralmente, anticorpo de domínio único (single domain antibody). [20] [21] Contrariando o esperado estes anticorpos apresentam um nível de afinidade similar aos anticorpos no seu formato original, sendo os três CDR suficientes para o reconhecimento do antigénio. Os sdAbs (single domain antibody) são os anticorpos com menor massa molecular (~15kDa), o que lhes confere características vantajosas como a elevada solubilidade e estabilidade térmica, a capacidade de re-enrolamento e a boa penetração no tecido in vivo possibilitando a sua aplicação em tratamentos e diagnósticos bem como a produção e manipulação rentável e eficiente em larga-escala (elevados níveis de expressão em bactérias e leveduras). Os sdAbs são uma grande expectativa para a elaboração de uma vacina, pois o seu tamanho reduzido permite-lhes que se liguem a antigénios de difícil acesso, como o HIV-1. No entanto, o seu tamanho reduzido também pode ser uma desvantagem in vivo, pois são rapidamente eliminados pelo sistema. A solução encontrada seria a formatação dos sdAbs em multímeros de forma a aumentar a sua massa molecular. [21] [23] Pretende-se com a utilização destes anticorpos inibir a entrada do HIV-1 na célula hospedeira, através do bloqueio das alterações conformacionais que ocorrem no gp41
  17. 17. 18 durante o processo de fusão. As alterações conformacionais que ocorrem na gp41 durante o processo de fusão conduzem à exposição de zonas conservadas, tais como a região HR1, permitindo a inibição por parte dos anticorpos mais precisamente nesta região. Enfuvirtide O Enfuvirtide, também designado por T-20, DP178 e Fruzeon, é um dos primeiros inibidores de fusão utilizados no tratamento da infecção do HIV e o único aprovado pela FDA para ser comercializado. [24] O Enfuvirtide é um péptido sintético com 36 aminoácidos, que previne a fusão do envelope viral com a célula CD4 inibindo a acção da gp41, ou seja bloqueando as alterações estruturais necessárias para que ocorra a fusão, e é administrado por injecção cutânea. [25] O ectodomínio da gp41 contém duas regiões de heptad repeat: HR1 ou terminal NHR, e HR2 ou terminal CHR. Estas duas sequências foram modeladas para péptidos sintéticos se associarem numa estrutura secundária em hélicesα. Estudos de cristalografia raio-X da gp41 mostram que os dois domínios de repetição contêm três membros (um trímero) em cada domínio, sugerindo que o trímero tem um papel importante nas mudanças conformacionais essenciais para a fusão da membrana de HIV-1 com as células do sistema imunitário.[6] O Enfuvirtide possui uma parte da sequência igual à região HR2 da gp41 e por isso, liga-se à cadeia complementar do gp41 (HR1) bloqueando a formação do domínio de seis hélices (six hélix bundle), prevenindo a progressão da conformação do pré-hairpin, resultando na inibição da fusão das membranas. O péptido contém uma parte da região NHR e do domínio lipid-binding, mas carece do domínio pocket-binding, bloqueando a fusão das membranas ligando a sua sequência N-terminal à gp41 e o seu C-terminal à membrana da célula. [24] [26] A sequência de Enfuvirtide e o seu arranjo numa eventual hélice-α (Figura 1), com segmentos anfipáticos, sugere claramente que pode interagir com as membranas biológicas. Estas interacções permitem definir um sistema lipossomal capaz de transportar o péptido até ás membranas onde deverá actuar [27]
  18. 18. 19 Figura 5 – Mecanismo de actuação do inibidor de fusão, Enfuvirtide, na inibição do vírus HIV.
  19. 19. 20 Sifuvirtide O Sifuvirtide é um péptido inibidor de fusão de segunda geração com uma eficácia melhorada e com resultados clínicos promissores. É um péptido com propriedades antivirais, constituído por 36 aminoácidos, com carga formal negativa. [28] [29] [30] O efeito anti-viral do péptido é proveniente da similaridade das sequências de aminoácidos comuns á glicoproteína gp41 do envelope viral, bloqueando a formação dos 6 hélices que permitiriam a fusão das membranas. Um dos obstáculos para o tratamento do HIV-1 é a sua variabilidade genética extremamente elevada, o que resulta em três grupos principais com diversos subtipos e formas recombinantes. Assim, o Sifuvirtide está um pouco limitado, ainda que inclua um grande painel de subtipos do vírus HIV-1, os quais representam a grande maioria das infecções em todo o mundo. Verificou-se que o Sifuvirtide não particiona para membranas compostas por POPC e membranas de POPC/Colesterol, possuindo maior afinidade para membranas compostas por fosfolípidos de colina mais rígidas, como o DPPC, sendo um dos lípidos mais comuns na constituição das jangadas membranares dos vírus. Outra das propriedades deste inibidor de fusão é que possui maior afinidade para membranas catiónicas e as interacções são mediadas por forças electrostáticas. [28][29][31] Viu-se uma oportunidade de utilizar estes lípidos como transportadores do péptido aniónico para as membranas celulares e os envelopes virais, com vantagens sobre a estabilidade e eficácia do medicamento. Constata-se, assim, que o Sifuvirtide constitui uma boa alternativa ao Enfuvirtide, por possuir uma maior actividade inibitória e uma menor toxicidade. Figura 6-Estrutura secundária do Sifuvirtide
  20. 20. 21 LJ001 O LJ001 é uma molécula anfipática, de pequenas dimensões, derivada da rodanina, que é derivada de tiazolidinas presentes, na proteína NS5A do vírus da Hepatite C. O LJ001 actua sobre as membranas lipídicas constituintes das capsulas virais, inibindo a sua capacidade de fusão vírus-célula. Alguns dos vírus susceptíveis á acção antiviral do LJ001 são o HIV-1, o Influenza A, Vírus da Hepatite C, Ebola, e outros. A LJ001 intercala em bicamadas lipídicas, provavelmente através do anel fenilo na sua extremidade não-polar, e posiciona o seu farmacóforo na extremidade polar oposta à actividade. Os danos provocados pelo LJ001 afectam a fluidez das bicamadas lipídicas comprometendo a sua capacidade para sofrer transições entre a curvatura positiva para negativa necessárias para que ocorra a fusão e pode ainda representar um mecanismo de inibição viral com alvo um largo espectro de vírus envelopados.[32][33] Os vírus envelopados replicam-se dentro das células hospedeiras, recrutando as suas próprias proteínas, e acumulam-se junto à membrana do hospedeiro onde, por endocitose, são libertadas em vesiculas, servindo como veículo de transporte de DNA viral para a próxima célula a ser infectada. Embora a membrana lipídica viral derive da do hospedeiro, esta não possui algumas das propriedades bioquímicas e biofísicas das membranas celulares, como por exemplo a capacidade de reparação da membrana. A actividade do LJ001 é dependente da luz e presença de oxigénio molecular e tem como alvo cadeias insaturadas dos fosfolípidos. O LJ001 medeia a oxidação com radicais de oxigénio, que reagem com as ligações duplas (alcenos) das cadeias insaturadas dos ácidos gordos, que resultam em fosfolípidos com grupos hidroxilos no meio da cadeia dos ácidos gordos. Estas alterações têm um impacto negativo nas membranas virais, afectando a fluidez (aumento da rigidez). [32][33] Desta forma, crê-se que o LJ001 actua como um fotossensibilizador lipofílico, nas membranas virais e não nas celulares isto porque as células têm múltiplos mecanismos endógenos de cito-protecção contra hidroperóxidos de fosfolipídios, conseguindo por isso superar os danos oxidativos feitas por LJ001 na membrana celular. [33] O LJ001 não possui intensidade de fluorescência em solventes aquosos mas possui elevada intensidade de fluorescência quando inserido em meios lipídicos intactos, permitindo assim a utilização de técnicas de espectroscopia de fluorescência na detecção da interacção da molécula com as membranas. Um das vantagens do uso deste antiviral é sua capacidade de limitar o desenvolvimento de resistência por parte dos vírus, embora, ainda estejam a decorrer estudos para o comprovar.
  21. 21. 22 Lipossomas Estas vesículas podem ser definidas como associações coloidais de lípidos anfipáticos, organizadas em estruturas fechadas e esféricas, podendo ser de origem natural ou formadas a partir de lípidos sintéticos, disponíveis comercialmente. Os lipossomas revelam potencial para transporte de fármacos até às células alvo, apresentando as seguintes vantagens: acesso a locais antes inacessíveis; protecção contra deposição indesejada; velocidade de transporte controlada; menor quantidade do princípio activo. [34] O objectivo destes transportadores é aumentar o potencial terapêutico de um composto, impedindo que este se perca no trajecto para um alvo específico, evitando simultaneamente a ocorrência de efeitos secundários nocivos noutra parte do organismo. Contudo, até hoje, nenhum sistema estudado conseguiu cumprir eficazmente este objectivo, de modo a ser largamente aceite pela indústria farmacêutica. [35][36] Neste trabalho, a produção de lipossomas como modelos miméticos das membranas virais e celulares permitiu observar qual a membrana que os inibidores fusão melhor se inserem. Classificação dos Lipossomas. Os lipossomas podem ser classificados pelo número de bicamadas presentes na vesícula, pelo método da sua preparação, ou pelo seu tamanho, no entanto, as classificações mais comuns para descrever os lipossomas são pela lamelaridade e tamanho. Quando os lipossomas são descritos com base no número de bicamadas são denominados por Vesículas unilamelares (ULV) ou vesículas multilamelares (MLV), Vesículas de evaporação de fase reversa (REV) ou Vesículas de prensa francesa (FPV) Quando a descrição é feita com base no método de preparação é-lhes atribuída a designação de Vesículas de Injecção de Éter (EIV). Já quando a descrição é feita com no seu tamanho as designações utilizadas são de grandes vesículas unilamelares (LUV) ou vesículas unilamelares pequenas (SUV). [37][38] Esquema representativo das características e utilizações dos lipossomas encontra-se em anexo. Aplicações Os lipossomas têm provado durante os últimos anos serem úteis em várias áreas:  Aplicações biomédicas  Aplicações nas indústrias de cosméticos  Aplicações indústrias agrícolas e pecuárias.
  22. 22. 23 No entanto, a área de maior interesse científico tem sido na utilização como sistemas transportadores de fármacos com aplicações em tratamentos e diagnóstico de tumores e infecções. Em aplicações clinicas, os lipossomas têm provado ser muito úteis devido á sua capacidade de incorporação de fármacos, independentemente da sua carga ou massa molecular e por reduzirem os efeitos secundários dos fármacos encapsulados em relação às drogas livres. No entanto, índices terapêuticos (medição da eficácia sobre a toxicidade) revelaram que os ganhos devem-se mais á redução da toxicidade do que á eficácia. Isto porque os lipossomas são retidos nos tecidos endoteliais nas junções selantes e são expostos a vários agentes de defesa do organismo que tendem a reduzir a sua presença no organismo, comprometendo muitas das suas aplicações. Ainda assim, a sua depuração tende a ser mais lenta que no caso de fármacos livres.
  23. 23. 24 Lipossomas como sistemas de drug delivery Apesar dos avanços médicos em prolongar a vida das pessoas mantém-se as dificuldades no tratamento da doença. O problema do contágio continua a ser a grande limitação, a que se associa o aumento do número de estirpes com resistência aos antivirais, a dificuldade de distribuição dos medicamentos e as perdas de efeito destes por acumulação ou rápido metabolismo. Desta forma, tem-se procurado desenvolver um sistema capaz de transportar compostos terapêuticos até aos alvos específicos, evitando efeitos indesejáveis como perdas do agente terapêutico por retenção ou degradação devido á acção de outros compostos. Porém, por mais atractivos e simples que possam parecer, são muito poucos os sucessos até agora obtidos. [34][35][36] Em 1965, davam-se os primeiros passos nesta área, com a publicação por Alec Bangham e colaboradores de um trabalho de investigação sobre a difusão de iões através de membranas lipídicas artificiais, ainda que sem qualquer ligação ao sistema transportador de fármacos. As estruturas fosfolipídicas viriam a ser designadas por lipossomas que passariam a servir de modelo para o estudo de membranas biológicas. Em 1971, estas vesículas passaram a ser utilizadas para fins médicos e farmacológicos, após o sucesso na incorporação de enzimas nos lipossomas.[35] Os lipossomas são formados espontaneamente quando os fosfolípidos estão dispersos num meio aquoso, ocorrendo um rearranjo em que as cabeças polares dos lípidos ficam rodeadas pela água, mantendo as cadeias apolares e hidrofóbicas protegidas no interior, resultando na formação de vesículas esféricas multilamelares e unilamelares. A utilização de lipossomas como veículos de fármacos exige a preparação e a caracterização das vesículas de lipossomas de forma a garantir uma boa distribuição, com dimensões adequadas para aprisionar no seu interior os medicamentos e sem acumulação de drogas no organismo. [34] Nos poucos estudos sobre a distribuição das vesiculas nos tecidos, em que o tamanho dos lipossomas foi variado, verificou-se que as pequenas vesículas unilamelares sonicadas apresentavam uma semi-vida mais longa em circulação do que as vesículas multilamelares, e grandes quantidade de vesiculas multilamelares de maiores dimensões no organismo acumulavam-se nos tecidos pulmonares. Concluiu-se, através destes estudos, a importância de definir o tamanho das preparações de lipossomas, levando à invenção de um método conveniente para a produção de vesículas multilamelares com distribuição de tamanhos reprodutíveis e bem definidos. Para obter este resultado, recorreu-se ao método de extrusão sequencial de vesículas multilamelares através de uma membrana de policarbonato com poros de diâmetro menor.
  24. 24. 25 A extrusão de lipossomas representa assim uma primeira tentativa para produzir uma população de vesículas unilamelares com uma distribuição de tamanho bem definido e caracterizado. A extrusão é conveniente e facilmente reprodutível, não introduzindo impurezas nas vesículas, e não induzindo a repartição dos fosfolípidos. As vesículas podem ser extrusadas através de membranas de 0,2 pm, permitindo a produção de uma preparação estéril para injecção in vivo.
  25. 25. 26 Parte Experimental Reagentes e Químicos Os sdAb F63, F63-MPR e F63-CRAC foram expressos e purificados pelo grupo do Professor João Gonçalves (Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa) em colaboração com a Unidade de Bioquímica Física. O péptido Sifuvirtide foi encomendado à Bachem AG (Bubendorf, Suíça) e o péptido Enfuvirtide foi amavelmente cedido pela Roche (Palo Alto, Califórnia, EUA). A molécula de LJ001 foi sintetizada e amavelmente cedida pelo grupo do Professor Benhur Lee (Universidade da Califórnia, LA). Os lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (POPC), 1-palmitoil-2- oleoil-sn-glicero-3-etilfosfatidilcolina (EPOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina (DPPC) e 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfatidilcolina (EDPPC) foram comprados à Avanti Polar Lipids (Alabaster, US-AL) enquanto que o colesterol (Chol) foi comprado à Sigma Aldrich (St. Louis, US-MO). As sondas difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH) e 4-[2-[6-(dioctilamino)-2-naftalenil]etenil]-1-(3-sulfopropil) (di-8-ANEPPS) foram também compradas à Sigma. O L-triptofano (Trp), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N′-2- etanosulfonico (HEPES), NaCl, dimetil sulfóxido (DMSO) e clorofórmio (os últimos dois de grau espectroscópico) foram comprados à Merck (Darmstadt, Alemanha). O glicerol usado é da VWR (Radnor, US-PA). Preparação de amostras As soluções stock de Sifuvirtide (1mg/mL), Enfuvirtide (1mg/mL) e Trp (3.6mM) foram preparadas com um tampão HEPES 10mM a pH 7.4, com uma concentração salina de 150mM NaCl (tampão de amostra). As soluções stock de sdAb F63 (10µM) F63-MPR (42 µM) e F63-CRAC (25 µM) foram mantidas em tampão de amostra com 5% de glicerol. A molécula de LJ001 (10mM) e a sonda DPH (8mM) foram solubilizadas em DMSO enquanto que a sonda ANNEPS (1mg/mL) foi solubilizada em etanol. As suspensões de LUV foram preparadas pelos procedimentos descritos previamente na literatura [39] [40] [41] . Resumidamente, a formulação lipídica foi primeiro dissolvida em clorofórmio num balão de fundo redondo. Formou-se um fino filme lipídico por evaporação do solvente sob fluxo de azoto e secagem em vácuo (overnight). A ressuspensão do lípido foi feita com tampão de amostra seguido de 8-10 ciclos de congelação e descongelação rápida. Esta resultante suspensão de MLV foi extrusada por uma membrana de policarbonato Nuclepore da Whatman/GE Healthcare (Kent, Reino Unido) com poros de 100nm de diâmetro. As formulações de LUV preparadas foram POPC, DPPC, misturas de POPC:EPOPC e DPPC:EDPPC na gama de (4:1), (3:1), (2:1) e
  26. 26. 27 (1:1) e POPC:Chol (2:1). O tampão de amostra foi utilizado para preparar todas as restantes amostras a não ser que mencionado o contrário. Instrumentação Medidas de absorvência foram realizadas num esptrofotómetro Genesys 10UV- Visible da Thermo Fisher Scientific (Waltham, US-MA). Medidas de fluorescência em estado estacionário foram realizadas num espetrofluorímetro Cary Eclipse da Varian (Mulgrave, Austrália) para ensaios com os sdAb e LJ001 e num espetrofluorímetro da série FLS920 da Edinburgh Instruments (Livingston, Reino Unido) para ensaios que envolveram os péptidos. Em ambos os fluorímetros as medições foram feitas a 25ºC. Foram utilizadas cuvettes de quartzo da Hellma Analytics (Müllheim, Alemanha) com percurso óptico de 0.5cm em todos os ensaios. Extrusão das suspensões de MLV foi realizada num Mini-Extruder com suporte para aquecimento da Avanti. Métodos Partição para membranas LUV de uma solução stock à concentração de 15mM foram adicionadas cumulativamente a amostras de Sifuvirtide (15µM), Enfuvirtide (10µM), F63 (13µM), F63- MPR (13µM) e F63-CRAC (13µM), atingindo-se concentrações finais na gama de 0-5mM como descrito na Tabela A1 (anexos). Permitiu-se um tempo de incubação de 10min entre cada adição. Para os ensaios em que as LUV foram pré-incubadas com LJ001, a razão molécula/lípido utilizada foi de 1/150 (0.66 mol% de LJ001 relativamente à concentração stock de LUV). A extensão de partição foi acompanhada por medidas da fluorescência em estado estacionário do triptofano presente nos péptidos e sdAb, para cada concentração de lípido. O comprimento de onda de excitação (λexc) utilizado foi 280nm e os espectros foram traçados de 300 a 450nm. A intensidade de fluorescência foi corrigida para a diluição da amostra, background, e dispersão da luz. [41] Os coeficientes de partição (Kp) foram determinados pelo ajuste da equação 1 aos dados experimentais [43] [44] : [ ] [ ]
  27. 27. 28 onde IW e IL correspondem, respectivamente, à intensidade de fluorescência da amostra em meio aquoso e em concentrações de lípido saturantes, γL é o volume molar do lípido e [L] é a concentração de lípido. Nos ensaios de partição dual de péptidos e LJ001 para a mesma membrana, o espetro de emissão da molécula foi recolhido dos 480 aos 580nm, fixando o λexc nos 450nm. Anisotropia de fluorescência em estado estacionário LUV de POPC e DPPC a 3mM foram incubadas durante 15min com a sonda DPH numa proporção molar final de 1/150 (0.66 mol% de DPH relativamente à concentração de lípido na amostra). A molécula de LJ001 foi titulada da solução stock (10mM) para as LUV marcadas atingindo concentrações finais na gama de 0-140µM, como descrito na tabela A2. Para cada adição a amostra foi deixada a incubar durante 10min. Um λexc de 350nm e um comprimento de onda de emissão (λemi) de 450nm foram utilizados para, respectivamente, excitar e recolher a emissão polarizada da sonda. A anisotropia em estado estacionário (<r>) da emissão do DPH foi calculada, para cada concentração final de LJ001, através da equação 2: onde Ivv e Ivh representam respectivamente a intensidade de fluorescência detectada nos polarizadores vertical ou horizontal, com excitação polarizada vertical e G (G=Ihv/Ihh) é um factor de correcção geométrico intrínseco ao aparelho. Variações no potencial dipolar membranar A sonda di-8-ANEPPS foi incubada overnight e em agitação com LUV numa proporção molar de 1/50 (2 mol% de sonda relativamente à concentração de lípido), de modo a assegurar incorporação eficiente. Os ensaios foram realizados com concentrações finais de 200µM para as LUV, 4µM para a sonda di-8-ANEPPS, e 10µM para F63, F63- MPR e F63-CRAC. Após adição do respectivo sdAb a amostra foi incubada durante 10min, antes de serem analisadas. As variações no potencial dipolar membranar, resultantes da interacção das moléculas com a membrana, foram monitorizadas pelos desvios no espetro de excitação da sonda. Estes espetros foram recolhidos entre 380 e 580nm fixando um λemi de 670nm, posteriormente corrigidos para o background e subtraídos ao espetro controlo da sonda e lípido sozinhos (considerando as mesmas concentrações finais relativas).
  28. 28. 29 Resultados e Discussão Interacção dos Single Domain Antybody com modelos miméticos Figura 7 - Interacção dos sdAb com modelos membranares. Partição de 13µM de F63(●), F63-MPR(■) e F63-CRAC(▲) seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano, durante a titulação de pequenos volumes de POPC (A) e POPC:Chol (2:1) (B) LUV. As curvas representam o melhor ajuste dos dados experimentais à equação (1). Quadro 1 - Coeficientes de Partição aparentes da interacção dos sdAb com modelos membranares Kp app x 10-3 (± SD) F63 F63-MPR F63-CRAC POPC 0.36 (± 0.2) 0.74 (± 0.1) 0.76 (± 0.2) POPC:Chol (2:1) 1.66 (± 0.6) 2.58 (± 0.5) 2.47 (±0.3) A B
  29. 29. 30 Figura 8 – Variações no potencial dipolar membranar. Espetros de excitação diferenciais da sonda di-8- ANEPPS (4µM) inserida em 3mM de POPC (A) e POPC:Chol (2:1) (B) LUV após interacção com 10µM de F63 (−), F63-MPR (−) e F63-CRAC (−). Cada espetro foi normalizado pela sua área total individual. A partir da fluorescência intrínseca do triptofano, resíduo esse que se encontra presente nas sequências dos anticorpos, podemos verificar que ocorre interacção de todos os anticorpos com os modelos membranares independentemente da constituição da membrana lipídica ou da utilização de motivos MPR e CRAC. Podemos observar diminuição do rendimento quântico do triptofano, o que aponta para a ausência do seu efeito directo quando inserido na membrana, podendo estar a ocorrer um fenómeno de quenching intramolecular por um resíduo próximo na estrutura tridimensional da proteína, que é potenciado por modificações conformacionais resultantes da interacção com os lipossomas. Através do ajuste da equação (1), foi possível retirar os valores de Kp, que devem ser tomados como aparentes, uma vez que a interacção dos anticorpos não envolve directamente os resíduos de triptofano. Um aumento da interacção é verificado pelo aumento destes valores para membranas com colesterol, que resultam da afinidade intrínseca dos anticorpos para membranas virais. Ocorreu maior interacção para os motivos MPR e CRAC em membranas com colesterol do que para o F63, no entanto, o efeito não foi significativo sobre a dinâmica de partição/interacção. Pela sonda ANEPPS observa-se igualmente interacção dos vários anticorpos com ambos os modelos membranares. Observa-se alteração do potencial dipolar das membranas a partir da sonda ANEPPS, porém não é possível inferir directamente que haja partição, devido á baixa magnitude do sinal. Este tipo de ensaios foi realizado meramente para confirmar a interacção do ponto de vista do lípido, observada quando seguimos a fluorescência intrínseca do triptofano, nos ensaios prévios. Entre anticorpos verificou-se um ligeiro aumento da intensidade para os motivos MPR e CRAC, enquanto o sinal extremamente baixo do F63 poderá ser explicado por precipitação do anticorpo na amostra, que perde a estabilidade com o tempo e leva á diminuição da concentração em solução e consequentemente á diminuição do sinal obtido pela sonda. A B
  30. 30. 31 Em membranas com colesterol podemos observar um ligeiro aumento do sinal para anticorpos que possuem motivos estruturais. Uma vez que no ensaio prévio, o F63 interage com membranas com colesterol, não é possível atribuir este comportamento directamente á presença dos motivos estruturais mas não podemos excluir essa possibilidade. De forma a confirmar estes resultados, dever-se-ia proceder a uma melhor purificação dos anticorpos e repetir os ensaios anteriores. No entanto, a produção destes anticorpos é feita por um grupo exterior a este instituto, que não enviou a tempo um novo stock de anticorpos que permite-se realizar replicados. Interacção do péptido Sifuvirtide com membranas catiónicas Figura 9 - Interacção do péptido Sifuvirtide com LUV. Partição de 15µM de Sifuvirtide seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano durante a titulação de pequenos volumes de misturas lipossomais de POPC (A) e DPPC (B) com percentagens crescentes de EPOPC E EDPPC (0, 20, 25, 33 e 50%), respectivamente. As curvas representam o melhor ajuste dos dados experimentais à equação (1). A B
  31. 31. 32 Quadro 2 - Coeficientes de partição da interacção do Sifuvirtide com misturas lipossomais catiónicas. O Sifuvirtide adsorve na superfície de membranas de fase DPPC gel, mas não interagem de forma significativa com membranas constituídas por POPC fluido, não sendo observada nenhuma mudança significativa na intensidade de fluorescência. O POPC serviu como controlo negativo nesta experiência inicial, uma vez que não existe qualquer interacção do péptido com este lípido. No entanto, para bicamadas em fase DPPC gel, foi observado um aumento significativo da intensidade de fluorescência, devido á preferência do Sifuvirtide por membranas rígidas. No gráfico B, a presença e aumento da concentração de lípido catiónico num lípido para o qual o Sifuvirtide não apresentava qualquer afinidade (Kp≈0) torna-se suficiente para que ocorra partição. A adição de lípido catiónico aos ensaios permitiu a observação de maior interacção do Sifuvirtide para com as membranas, devido às interacções electrostáticas entre as membranas e a carga negativo do péptido. Com o aumento da percentagem de lípido catiónico verificou-se o aumento da partição, no entanto, também é possível observar picos de saturação que fogem ao ajuste da recta (linhas a tracejado e sua inexistência), possivelmente provocados pela agregação das vesiculas em torno do péptido, quando a concentração lipídica face á concentração do péptido é muito elevada. A agregação das Kp x 10-3 (± SD) POPC * POPC:EPOPC (4:1) 0.02 (± **) POPC:EPOPC (3:1) 0.14 (± **) POPC:EPOPC (2:1) 0.14 (± 0.03) POPC:EPOPC (1:1) 2.12 (± 0.4) DPPC * DPPC:EDPPC (4:1) 0.03 (± **) DPPC:EDPPC (3:1) 0.19 (± **) DPPC:EDPPC (2:1) 0.59 (±0.07) DPPC:EDPPC (1:1) * * Não foi possível ajustar a equação (1) ** Número de replicados insuficiente.
  32. 32. 33 vesiculas induz um aumento da hidrofobicidade do meio que leva a um aumento da estabilização do péptido, ocorrendo um máximo de rendimento quântico. Com a adição de lípido, ocorre um aumento de carga positiva que provoca uma diminuição da estabilização dos agregados por repelência entre as cargas, expondo o péptido a regiões menos hidrofóbicas, observando-se a diminuição do rendimento quântico do péptido. Embora o péptido particione significativamente melhor para membranas de DPPC, observou-se maior agregação para razões péptido/lípido superiores, desta forma, a adição de lípido catiónico às membranas de POPC, parece ser mais adequada para efeitos de fusão/transfecção pela ausência de fenómenos de agregação e pela eficiência intrínseca que lípidos em fase fluida possuem para processos de fusão, o que poderá adequar este modelo para o delivery do Sifuvirtide directamente ao vírus. Apesar de membranas fluidas aumentarem a eficiência, isto não é um factor essencial para que haja fusão, uma vez que a rigidez, não é impeditiva para que ocorra fusão, apenas existe mais tensão na transição da curvatura membranar de positiva para negativa. Interacção do péptido Enfuvirtide com membranas catiónicas Figura 10 - Interacção do péptido Enfuvirtide com LUV. Partição de 10µM de Enfuvirtide seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano durante a titulação de pequenos volumes de misturas lipossomais de POPC (A) e DPPC (B) com percentagens crescentes de EPOPC E EDPPC (0, 20, 25, 33 e 50%), respectivamente. As curvas representam o melhor ajuste dos dados experimentais à equação (1). A B
  33. 33. 34 Quadro 2 - Coeficientes de partição da interacção do Sifuvirtide com misturas lipossomais catiónicas. Na presença de LUV de POPC e DPPC, a intensidade de fluorescência do Enfuvirtide aumenta, o que significa que os resíduos de Triptofano estão a ser incorporados progressivamente nas membranas, devido ao ambiente hidrófobo. O Enfuvirtide prefere membranas fluidas (POPC) a membranas rígidas (DPPC),embora não seja significativo uma vez que a extensão da partição é semelhante para ambos os lípidos, variando apenas o perfil. Observam-se fenómenos de agregação para ambos os lípidos, sendo esse fenómeno menor para membranas fluidas. Este fenómeno, tal como referido para o Sifuvirtide, corresponde a um máximo de rendimento quântico, devido á estabilização da carga do péptido pelas cargas positivas dos lípidos catiónicos. Com a adição de lípido catiónico verificou-se um aumento da extensão da partição para POPC e DPPC, o que já era expectável uma vez que essa interacção já ocorria sem a sua presença. Observou-se ainda que para a mesma proporção de lípido catiónico as membranas de POPC possuem uma extensão da partição mais elevada que em membranas de DPPC. Kp x 10-3 (± SD) POPC 1.25 (± 0.2) POPC:EPOPC (4:1) 10.5 (± **) POPC:EPOPC (3:1) 22.7 (± **) POPC:EPOPC (2:1) * POPC:EPOPC (1:1) * DPPC 0.23 (± 0.08) DPPC:EDPPC (4:1) * DPPC:EDPPC (3:1) * DPPC:EDPPC (2:1) * DPPC:EDPPC (1:1) * * Não foi possível ajustar a equação (1) ** Número de replicados insuficiente.
  34. 34. 35 Para fins de vectorização de Sifuvirtide e Enfuvirtide deverá sempre ter-se em conta uma razão péptido/lipído catiónico, que equilibre a partição do péptido com a agregação lipossomal (longe dos picos de rendimento quântico). Isto possibilitará maximizar a partição de péptido para a superfície dos lipossomas minimizando a agregação mediada pela carga do próprio péptido. Desta forma, devemos minimizar os agregados lipossomais para obter uma boa distribuição no organismo. Quadro 2 - Resumo dos coeficientes de partição obtidos nos ensaios com os péptidos Sifuvirtide e Enfuvirtide. Kp x 10-3 (± SD) Sifuvirtide Enfuvirtide POPC * 1.25 (± 0.2) POPC:EPOPC (4:1) 0.02 (± **) 10.5 (± **) POPC:EPOPC (3:1) 0.14 (± **) 22.7 (± **) POPC:EPOPC (2:1) 0.14 (± 0.03) * POPC:EPOPC (1:1) 2.12 (± 0.4) * DPPC * 0.23 (± 0.08) DPPC:EDPPC (4:1) 0.03 (± **) * DPPC:EDPPC (3:1) 0.19 (± **) * DPPC:EDPPC (2:1) 0.59 (±0.07) * DPPC:EDPPC (1:1) * * * Não foi possível ajustar a equação (1) ** Número de replicados insuficiente.
  35. 35. 36 Efeito do LJ001 sobre a rigidez membranar Figura 11 – Efeito da molécula de LJ001 na rigidez de membranas lipídicas. Variação da anisotropia de fluorescência da sonda DPH (20µM), inserida em 3mM de POPC (●) e DPPC (▲) LUV, após titulação com LJ001. Os dois lípidos utilizados demonstraram que as sondas são capazes de detectar a transição correcta de fase da membrana. A utilização da sonda florescente DPH permite verificar alterações na anisotropia de fluorescência provocadas pela LJ001 bem como um aumento da anisotropia para membranas fluidas, resultante da diminuição das oscilações da sonda emissora provocada pela rigidificação. O LJ001 tem ainda capacidade de levar á rigidificação de membranas que já são rígidas á temperatura de ensaio (25º), evidenciado pelo aumento da anisotropia da sonda DPH. Acredita-se que o modo de acção esteja relacionado com a presença de cadeias insaturadas dos ácidos gordos nos quais actuam espécies reactivas de oxigénio, que são produzidas na presença de LJ001. A presença de cadeias insaturadas proporciona uma melhor actuação do LJ001 resultando numa anisotropia maior para as membranas de POPC do que para membranas em fase de gel. A rigidificação de membranas de DPPC também ocorre no entanto a anisotropia é menor, uma vez que as cadeias de ácidos gordos (palmitoil) são saturadas, podendo outros pontos de oxidação ser o fosfato ou as ligações éster entre o glicerol e o ácido gordo. A própria inserção da molécula poderá ser responsável pela variação observada, num potencial efeito de cunha.
  36. 36. 37 Combinação do Sifuvirtide e LJ001 nas mesmas membranas lipossomas Figura 12 – Presença de Sifuvirtide e LJ001 nas mesmas vesículas lipossomais. Partição de 15µM de Sifuvirtide seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano em POPC (A) e DPPC (B) LUV, pré-incubadas (●) ou não (○) com LJ001 ([LJ001]/[L] é constante). Espetros de emissão da molécula LJ001 (33µM) em tampão de amostra e em POPC (C) e DPPC (D) LUV, no final do ensaio de partição. Uma vez que o Sifuvirtide possui afinidade intrínseca para membranas em fase de gel (rígidas) colocou-se a hipótese da actividade da molécula de LJ001 potenciar a partição do péptido. Para testar esta hipótese realizaram-se ensaios em que o lípido foi pré-incubado com a molécula de LJ001 e posteriormente titulado com o Sifuvirtide. O efeito esperado seria o aumento da partição do Sifuvirtide devido ao efeito de rigidificação causado pelo LJ001 que aumentaria a afinidade já existente do Sifuvirtide para o DPPC, no entanto, tal não foi verificado para as condições testadas e o rendimento quântico do triptofano seguido no péptido diminuiu ao longo da titulação com lípido e LJ001. Verificou-se que a partição para membranas fluidas diminuiu ao contrário do que se verificou no ensaio anterior. Isto é explicado pela afinidade do Sifuvirtide para membranas A B C D
  37. 37. 38 rígidas e por este não particionar para membranas fluidas, ainda que a presença de LJ001 posso rigidificar este tipo de membranas, a sua partição é sempre mais baixa do que para membranas que já possuíam essa característica. As razões lípido/LJ001 foram constantes durante as suas adições ao logo do ensaio. De forma a verificar o possível aumento da partição serão realizados novos ensaios alterando as condições do ensaio, no entanto, tais resultados, não serão incluídos neste relatório. A diminuição do rendimento quântico observado pode ser consequência de fenómenos de transferência de energia em que a emissão do Sifuvirtide excita parcialmente a molécula de LJ001 inserida no lípido.
  38. 38. 39 Combinação do Enfuvirtide e LJ001 nas mesmas membranas lipossomas Figura 13 – Presença de Enfuvirtide e LJ001 nas mesmas vesículas lipossomais. Partição de 10µM de Enfuvirtide seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano em POPC (A) e DPPC (B) LUV, pré- incubadas (●) ou não (○) com LJ001 ([LJ001]/[L] é constante). Espetros de emissão da molécula LJ001 (33µM) em tampão de amostra e em POPC (C) e DPPC (D) LUV, no final do ensaio de partição. Quadro 2 – Coeficientes de partição dos péptidos Sifuvirtide e Enfuvirtide para LUV na presença e ausência de LJ001 Kp x 10-3 (± SD) POPC DPPC - LJ001 +LJ001 - LJ001 +LJ001 Sifuvirtide * * * * Enfuvirtide 1.25 (± 0.2) 1.62 (± **) 0.23 (± 0.08) 0.17 (± **) * Não foi possível ajustar a equação (1) ** Número de replicados insuficiente. C D A B
  39. 39. 40 Este ensaio foi realizado de forma a verificar a presença do péptido e do LJ001 em ambas as membranas lipídicas, sendo confirmado pelos resultados da partição. Uma vez que o Enfuvirtide não apresenta grande afinidade para membranas rígidas, a presença de LJ001 não será um factor relevante para que ocorra aumento da partição. O facto de observar-se uma diminuição do rendimento quântico na presença do LJ001, embora se verifique partição, pode não implica que não esteja a ocorrer adsorção do Enfuvirtide às membranas. A presença do LJ001 nas membranas pode levar a uma competição por parte do Enfuvirtide, no entanto, podemos verificar que a inserção do péptido não alterou a presença do LJ001 na membrana durante todo o ensaio.
  40. 40. 41 Conclusão O vírus HIV possui uma grande capacidade de mutação, é altamente transmissível e de difícil erradicação, e por essa razão tem sido alvo de diversas estratégias terapêuticas. Entre as estratégias terapêuticas utilizadas estão os inibidores de fusão e os anticorpos, embora existam outros fármacos que actuam em diferentes fases do ciclo de vida do vírus. Neste trabalho foram realizados trabalhos com inibidores de fusão peptídicos e single domain Antibodies (anticorpos). A actuação destas moléculas inibe a fusão das membranas que por sua vez impede a entrada do vírus para as células e a integração do genoma viral no genoma do hospedeiro, assim como os estados de latência que impedem a erradicação total. De entre os fármacos utilizados na terapêutica da SIDA, na classe dos inibidores de fusão apenas o Enfuvirtide é comercializado para o tratamento. No entanto, têm sido desenvolvidos novas classes de fármacos anti-virais que têm apresentado resultados pré- clínicos promissores. O objectivo deste trabalho consistiu na procura de um sistema de delivery de fármacos a partir da utilização de lipossomas. Através da exploração de diferentes tipos de lípidos, constituintes das membranas do lipossoma, e de diferentes inibidores de fusão procurou-se a melhor interacção/estabilização do fármaco com o veículo de transporte. Os single domain Antibodys podem vir a ser agentes terapêuticos promissores. Inibem HIV-1 pela sua ligação á proteína gp41, nomeadamente à região HR1, bloqueando as alterações conformacionais da gp 41 que ocorrem durante o processo de fusão. Este tipo de anticorpos possui como grande vantagem, o seu tamanho reduzido, que permite chegar a locais do vírus de difícil acesso sem a utilização de um sistema de transporte lipossomal. Entre os principais resultados podemos verificar que o F63 sdAbs interage com ambas as membranas de POPC e POPC:Chol tal como se conclui pela figura 7. Ao interagir com o lípido os 3 anticorpos estarão a sofrer alterações na sua estrutura terciária que modificam o micro-ambiente dos triptofanos levando assim à diminuição do rendimento quântico observado a concentrações elevadas de lípido. A interacção das construções F63-MPR e F63-CRAC não está directamente relacionada com a presença dos motivos estruturais MPR e CRAC, ambos com afinidade para colesterol, mas esta hipótese não pode ser totalmente excluída com base nos resultados apresentados. Conclui-se que a presença de lípidos catiónicos nos ensaios aumenta a partição dos péptidos Sifuvirtide e Enfuvirtide para formulações lipossomais em fase fluida e gel, no entanto, verificam-se fenómenos de agregação vesicular mediadas por estabilização de cargas em solução. Para efeitos de delivery este parâmetro e o seu valor crítico devem ser
  41. 41. 42 tidos em conta, uma vez que a agregação diminuirá a biodisponibilidade e a acção pretendida para este sistema. A vectorização do Enfuvirtide por adsorção a formulações catiónicas parece ser comprometida pela elevada agregação observada, não sendo por isso uma boa opção para sistemas de drug delivery. Para o caso do Sifuvirtide misturas de POPC:EPOPC apresentam resultados promissores, uma vez que a agregação é mínima para percentagens de lípido catiónico elevadas. Há ainda o benefício da eficiência de fusão das vesículas ser superior com formulações de lípido em fase fluida. O LJ001 é uma molécula com capacidade de oxidar cadeias insaturadas dos ácidos gordos presentes nos lípidos. O LJ001 actua sobre membranas fluidas induzindo rigidificação, estando o modo de acção relacionado com a formação de espécies reactivas de oxigénio. No entanto, o efeito de cunha mediado pela inserção da molécula na membrana também deve ser considerado. Podemos ainda concluir que ocorre rigidificação de membranas que já possuem essa característica (DPPC) embora o seu efeito não seja tão significativo como para membranas fluidas. Nos ensaios elaborados com LJ001 adicionado ao lípido verificou-se que ambos os péptidos co-particionaram para as mesmas vesiculas lipossomais, porém não foi possível explicar se a diminuição do rendimento quântico observada nestes ensaios foi resultado da diminuição de péptido adsorvido ou de fenómenos de transferência de energia do triptofano para o LJ001. Novos ensaios serão elaborados para optimização das condições do ensaio de forma a comprovar se a presença de LJ001 nos lipossomas com acção de rigidificação poderá aumentar ainda mais a afinidade já existente do Sifuvirtide para membranas rígidas.
  42. 42. 43 Referências Bibliográficas [1] Turner, B.G., and Summers, M.F. (1999). Structural biology of HIV. Journal of Molecular Biology 285, 1–32. [2] Coiras, M., Huertas, M.R.L., Olmeda, M. P. and Alcamí, J. (2009).Understanding HIV‑ 1 latency provides clues for the eradication of long‑term reservoirs. Nature Reviews Microbiology 7, 798-812 [3] Arthur, L. O., J. W. Bess,Jr., et al. (1992). "Cellular proteins bound to immunodeficiency viruses: implications for pathogenesis and vaccines." Science 258(5090): 1935-8. [4] Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J.D., Grisé, H., Ofek, G.A., Taylor, K.A., and Roux, K.H. (2006). Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. Nature 441, 847–852. [5] Engelman, A., and Cherepanov, P. (2012). The structural biology of HIV-1: mechanistic and therapeutic insights. Nature Reviews Microbiology 10, 279–290. [6] Matthews, T., Salgo, M., Greenberg, M., Chung, J., DeMasi, R., and Bolognesi, D. (2004). Enfuvirtide: the first therapy to inhibit the entry of HIV-1 into host CD4 lymphocytes. Nature Reviews Drug Discovery 3, 215–225. [7] McCune, J.M., Rabin, L.B., Feinberg, M.B., Lieberman, M., Kosek, J.C., & Reyes, G.R. (1988). Endoproteolytic cleavage of gp160 is required for the activation of human immunodeficiency virus. Cell, 53, 55-67. [8] Klasse, P.J. (2012). The molecular basis of HIV entry. Cellular Microbiology 14, 1183– 1192. [9] Blumenthal, R., Durell, S., and Viard, M. (2012). HIV Entry and Envelope Glycoprotein-mediated Fusion. J. Biol. Chem. 287, 40841–40849. [10] Doms, R.W., and Moore, J.P. (2000). HIV-1 Membrane Fusion Targets of Opportunity. J Cell Biol 151, F9–F14. [11] Jacobs, A., Garg, H., Viard, M., Raviv, Y., Puri, A., and Blumenthal, R. (2008). HIV-1 Envelope Glycoprotein-mediated Fusion and Pathogenesis: Implications for Therapy and Vaccine Development. Vaccine 26, 3026–3035.
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  47. 47. 48 Anexos Sequência dos anticorpos sdAb F63 (18,6kDa) E L V L T Q T P S S V P A A V G G T V T I N C S G G G S D S T D Y C K G Y A N Y S G G G S W Y Q Q K P G Q R P K L L I Y G A S D L A S G V S S R F K G S G S G T Q F T L T I S G V Q C A D A A T Y Y C S G G G S S T Y A Y A Y S S G A Y S G G G S F A F G G G T E L E I L S S G G G T S G Q A G Q H H H H H H G A Y P Y D V P D Y A sdAb F63-MPR (18,9kDa) E L V L T Q T P S S V P A A V G G T V T I N C S G G G S D S T D Y C K G Y A N Y S G G G S W Y Q Q K P G Q R P K L L I Y G A S D L A S G V S S R F K G S G S G T Q F T L T I S G V Q C A D A A T Y Y C S G G G S S T Y A Y A Y S S G A Y S G G G S F A F G G G T E L E I L S G G L W Y I K G G G Q A G Q H H H H H H G A Y P Y D V P D Y A sdAb F63-CRAC (19,2kDa) E L V L T Q T P S S V P A A V G G T V T I N C S G G G S D S T D Y C K G Y A N Y S G G G S W Y Q Q K P G Q R P K L L I Y G A S D L A S G V S S R F K G S G S G T Q F T L T I S G V Q C A D A A T Y Y C S G G G S S T Y A Y A Y S S G A Y S G G G S F A F G G G T E L E I L S G G V L N Y Y V W R G G G Q A G Q H H H H H H G A Y P Y D V P D Y A Sequência do Enfuvirtide C – Y T S L I H S L I E E S Q N Q Q E K N E Q E L L E L D K W A S L W N W I – NH Sequência do Sifuvirtide C – S W E T W E R E I E N Y T R Q I Y R I L E E S Q E Q Q D R N E R D L L E – NH
  48. 48. 49 Tabela A1- Protocolo de adições para titulação de LUV # [L] /mM Vcuvette /μL V cumulativo /μL Vadicionar /μL CDiluição 0 0 500.00 0 0 1.00 1 0.1 503.36 3.36 3.36 1.01 2 0.2 506.76 6.76 3.40 1.01 3 0.3 510.20 10.20 3.45 1.02 4 0.4 513.70 13.70 3.49 1.03 5 0.6 520.83 20.83 7.13 1.04 6 1 535.71 35.71 14.9 1.07 7 1.5 555.56 55.56 19.8 1.11 8 2 576.92 76.92 21.4 1.15 9 3 625.00 125.00 48.1 1.25 10 4 681.82 181.82 56.8 1.36 11 5 750.00 250.00 68.2 1.50 Tabela A2- Protocolo de adições para titulação de LJ001 # [LJ001] /mM Vcuvette /μL V cumulativo /μL Vadicionar /μL CDiluição 0 0 500.0 0 0 1.0000 1 0.02 501.0 1.0 1.0 1.0020 2 0.04 502.0 2.0 1.0 1.0040 3 0.06 503.0 3.0 1.0 1.0060 4 0.08 504.0 4.0 1.0 1.0080 5 0.10 505.0 5.0 1.0 1.0101 6 0.12 506.0 6.0 1.0 1.0120 7 0.14 507.1 7.0 1.0 1.0141
  49. 49. 50 Figura A1- Mecanismo de ligação do vírus à membrana plasmática de uma célula. Figura A2 – Representação das regiões Fab e Fc após clivagem por acção de uma protéase.
  50. 50. 51 Figura A3 – Esquema da estrutura da proteína gp41 do vírus HIV-1 e a sequência de aminoácidos do Enfuvirtide localizada dentro da região HR2 Figura A4 – Estrutura molecular do péptido Enfuvirtide ( T-20)
  51. 51. 52 Figura A5 - Esquema representativo das várias utilizações dos lipossomas e inter-relação entre os diversos parâmetros que os caracterizam. Adaptado de referência X

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