1. Sommaire
Résumé
Introduction
Matériels et méthodes
1 – Matériels
a – Types cellulaires
b – Amorces et sondes de RT-PCR quantitative en temps réel
2 – Méthodes
a – Conditions générales de culture
b – Extraction des ARN messagers
c – Comparaison de la sensibilité au NGF des diverses lignées épithéliales de
sein humain
d – Test de l’effet de l’inhibition de contact
e – Effet de substances agissant sur la croissance et/ou l’apoptose
f – RT-PCR quantitative en temps réel
g – Immunoprécipitation et analyse en Western blot
h – Test d’apoptose en Hoescht

2. Résultats
1 – Expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75) dans les lignées
de cancer du sein et sur les cellules normales
a – Expression du gène p75
b – Expression du gène TrkA
c – Expression du gène du NGF
2 – Variation de l’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75)
en fonction de l’inhibition de contact
3 – Variation de l’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75)
en fonction de substances agissant sur la croissance et/ou l’apoptose
Discution et conclusion
Bibliographie
Remerciments

3. Sébastien DUPRAT, DEA biologie santé 1999-2000.
REGULATION DE L’EXPRESSION DU NGF ET DE
SES RECEPTEURS (TRKA ET P75) DANS LES
CELLULES DE CANCER DU SEIN.
RESUME :
Le cancer du sein touche près d’une femme sur dix. La meilleure compréhension de
cette maladie est un des défis prioritaires de la santé publique à l’heure actuelle.
Il a préalablement été prouvé dans le laboratoire que le Nerve growth factor (NGF)
stimule la croissance et la survie des cellules de cancer du sein par l’intermédiaire de deux
récepteurs : TrkA et p75 (Descamps et al. 1998). Dans cette recherche il a également été
démontré que les cellules épithéliales mammaires normales ne sont pas stimulées à proliférer
par ce facteur de croissance. L’objectif de mon travail de DEA est de définir la régulation du
NGF et de ses récepteurs dans les lignées de cancer du sein en culture.
Différentes lignées de cancer du sein ainsi que des cellules épithéliales mammaires
normales ont été cultivées en présence de facteurs modifiant la prolifération et la survie
cellulaire. Les résultats ont alors été analysés en RT-PCR quantitative en temps réel ou en
western blot.

4. INTRODUCTION : préalablement à mon arrivée dans mon
laboratoire d’accueil, cet effet a été
démontré sur les cellules épithéliales
mammaires cancéreuses (Descamps et al.
La recherche en biologie cellulaire
1998). Une particularité est intéressante
sur les cancers hormonaux dépendants
dans ce modèle : le NGF stimule les cellules
repose principalement sur l’étude de la
cancéreuses du sein à proliférer mais reste
prolifération, de la différentiation et de
sans effets mesurables sur les cellules
l’apoptose. Ces phénomènes sont
normales.
conditionnés par l’environnement cellulaire,
Le NGF agit par l’intermédiaire de
notamment par les molécules de
deux récepteurs membranaires : TrkA et
signalisation. On trouve dans cette
p75. Le proto-oncogène TrkA (p140trk) est
catégorie les facteurs de croissance, petits
un récepteur à activité tyrosine kinase, c’est
polypeptides de faible poids cellulaire qui
le récepteur à haute affinité du NGF. P75
agissent par l’intermédiaire de récepteurs
est un récepteur accessoire, de basse
membranaires.
affinité, et sans activité tyrosine kinase. Ce
Le NGF est le premier facteur de
dernier semble pourtant posséder une voie
croissance à avoir été caractérisé. Ce travail
de transduction propre liée aux fonctions
a valu le prix Nobel de médecine en 1986 à
de survie cellulaire.
Rita-Levi Montalcini. C’est l’archétype des
L’étude du rôle du NGF dans le
facteurs de croissance neurotrophique. Il a
cancer du sein en est à ses débuts. Dans le
été très largement étudié pour son rôle
cadre de ce stage de DEA, nous nous
d’induction de la croissance et de la survie
somme intéressé aux mécanismes régulant
des neurones sympathiques. Plus
la sensibilité des cellules épithéliales
récemment, une activité mitogène lui a été
mammaires humaines pour ce facteur de
attribuée sur certaines lignées de cellules
croissance. Notre approche nous a
épithéliales. Dans un travail effectué

5. renseigné sur l’évolution de cette sensibilité au NGF induite par des molécule agissant
sur la croissance et/ou l’apoptose.

6. MATERIEL & METHODES :
proto-oncogène ras
1 - Matériel (dénomination : MCF-7 ras).
Ces dernières se comportent en
permanence comme stimulées
a) Types cellulaires
par des facteurs de croissance,
Un certain nombre de types
même en milieu de sevrage (sans
cellulaires ont été utilisés. Ce sont des
sérum de veau fœtal).
lignées cancéreuses ou des cellules
- Les lignées T47D et SK-Br-3
normales, mais toutes sont d’origine
sont également hormono-
épithéliales mammaires humaines.
dépendantes et peu invasives.
- la lignée MCF-7 est hormono-
Elle sont issues
dépendante. Elle a été établie à
d’adénocarcinomes. SK-Br-3
partir d’effusions pleurales d’un
surexprime le récepteur erb-B2,
adénocarcinome. Cette lignée a
et T47D possède des récepteurs
conservé de nombreuses
à certains stéroïdes.
caractéristiques d’un épithélium
- La lignée BT20 semble être
mammaire (particulièrement
hormono-dépendante, mais ceci
pour la présence des récepteurs
est controversé dans la
à haute affinité des œstrogènes
littérature. Elle est issue de
et progesterone). En plus de la
cellules échapées d’une tumeur
lignée MCF-7 commune, nous
en culture primaire. Elle a la
avons également utilisé des
particularité de ne pas posséder
MCF-7 transfectées par le
de récepteurs aux œstrogènes.

7. - Nous avons également étudié 3 Dr.Pellerin) et mises en culture
lignées de MDA. Elles sont primaire au laboratoire.
toutes trois hormono-
indépendantes. Ce sont les b) Amorces et sondes de RT-
lignées MDA-MB-231 (issues PCR quantitative en temps
d’effusions pleurales
réél.
d’adénocarcinomes, fortement
Les séquences des amorces sens et
invasive. Ces cellules
antisens ainsi que des sondes sont les
n’expriment pas de récepteurs
suivantes :
aux œstrogènes et à la
progestérone), MDA-MB-453
TrkA :
(possédant de nombreux
Sens : CATCGTGAAGAGTGGTCTCCG
récepteurs aux androgènes et Antisens :
GAGAGAGACTCCAGAGCGTTGAA
très invasive. Elle surexprime
Sonde :
également erb-B2) et MDA- AGGAGTGAAATGGAAGGCATCTGGC
MB-468 (possède de nombreux G
récepteurs à l’EGF et
P75 :
surexprime le FGF-2). Sens :
- Enfin, nous avons utilisé des CCTACGGCTACTACCAGGATGAG
Antisens : TGGCCTCGTCGGAATACG
cellules épithéliales mammaires
Sonde :
humaines normales CTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGC
(dénomination : CEMN). Ces
NGF :
cellules sont issues de réduction
Sens :
mammaires non pathologiques Antisens :
(venant du département de Sonde :
chirurgie plastique, CHU Lille,

8. trypsine est inhibée par 5 ml de MEM SVF
2 – méthodes (décrit ci-dessus).
Les cellules en culture sont
régulièrement observées au microscope
a) Conditions générales de
inversé à contraste de phase. Cela permet
culture
de suivre l’évolution de la confluance et de
s’assurer du maintient de la morphologie
En routine, les cellules sont
épithéliale.
maintenues en MEM (Milieu essentiel
Avant un traitement de facteurs de
minimum, avec des sels de Eagle) (Gibco
croissance, les cellules sont sevrées dans du
BRL) supplémenté avec 5% de sérum de
MEM supplémenté comme pour le MEM –
veau fœtal (SVF) (Eurobio ? ? ? ?), 1%
SVF d’acides aminés non essentiels, de L-
d’acides aminés essentiels (Eurobio), 2 mM
glutamine, de pénistreptomycine, de
de glutamine (Eurobio), 5 µl/ml d’insuline
gentamycine, de bicarbonate de sodium, et
(Organon), et des antibiotiques (Penicilline-
d’HEPES. A ceci, nous ajoutons 2 µg/ml
Streptomycine : 100 U/ml et Gentamycine :
de fibronectine et 30 µg/ml de transférine.
50 µl/ml) (Eurobio). Les cellules sont
encemencées dans des flasques de plastique
de 75 cm2 (Falcon) et incubées dans un
b) Extraction des ARN
atmosphère humide, à 37°C en présence de
5% de CO2. Le milieu est changé tous les 2 messagers
jours. Les cellules sont régulièrement
décolées, avant la confluance dans une Les ARN totaux ont été extraits
solution de trypsine (0,1%) – EDTA avec le kit Quiagen selon le protocole
(0,25%) (eurobio), à 37°C pendant 5 à 10 décrit par Quiagen. Ensuite, on évalue la
minutes (en fonction du type cellulaire). La quantité d’ARN en spectrophotométrie à

9. 260 nm de longueur d’onde. On vérifie Ensuite, les cellules sont trypsinisées. La
aussi la pureté du résultat en s’assurant que quantité de cellules comprise dans chaque
le ratio λ260/λ280 est compris entre 1,7 et échantillon est déterminée par comptage
sur lame de Malassez. Ensuite, on
2. Les ARN sont dilués à 10µg /ml puis les
centrifuge 10 minutes à 1200 tour par
solutions mères et dilués sont stockées à –
minutes. Les culots sont conservés à –80°C
80°C.
en attendant d’en extraire les ARN
messagers. Les ARN seront analysés en
c) Comparaison de la
RT-PCR quantitative en temps réel.
sensibilité au NGF des diverses
lignées épithéliales de sein humain
d) Test de l’effet de
Pour évaluer le niveau d’expression
l’inhibition de contact
du NGF et de ses récepteurs, les cellules
ont été ensemencées dans des boites de
Les cellules MCF-7 ont été
petri 100mm (………), à 10000 cellules
ensemencées à 10000 cellules par cm2 dans
2
par cm , puis cultivées dans deux
des boites de Petri de 100mm de diamètre
conditions standard :
puis cultivées en MEM – SVF. Le milieu
- 48 heures en MEM – SVF :
est régulièrement changé. Chaque jours,
condition de sérum.
trois boites sont récoltées par une solution
- 48 heures en MEM – SVF puis
de trypsine, le nombre de cellules est
48 heures en MEM sevrage :
déterminé par un compteur de cellules
condition de sevrage.
automatique. A partir de ces cellules, on
(Remarque : dans cette partie, le milieu MEM de
extrait les ARN messager que l’on analyse
sevrage ne contient pas de rouge de phénol. Ce
n’est pas le cas dans le reste de l’étude.) en RT-PCR quantitative en temps réel.

10. MEM – SVF a été renouvelé
e) Effet de substances agissant 24h puis les cellules ont été
traitées 48h dans du MEM –
sur la croissance et/ou l’apoptose
SVF supplémenté de 1mM de
Les cellules (MCF7 et BT-20) ont NaB ou 10µM de C2.
été ensemencées à 5000 cellules par cm2
dans des boites de petri de 100mm de
diamètre. Les cellules ont été laissées 48h f) RT-PCR quantitative en
en MEM – SVF dans un incubateur (37°C, temps réel.
5% de CO2). A partir de cette étape, il faut
différencier deux cas :
La réaction est faite en une seule
- Pour le test du FGF-2, ainsi que
étape. Le mélange de réaction se compose
le test conjoint du butyrate de
dans chaque tube de : 50ng d’ADN total
sodium (NaB) et du C2 avec le
d’échantillon, MgCl2 : 6mM pour TrkA ;
NGF, les cellules ont été lavées
3mM pour p75 ; 4mM pour NGF, 5 µl de
2 fois avec du PBS stérile (15
tampon TaqMan 10X (500mM KCl, 0,1
minutes puis 2 heures) et mises
mM EDTA, 100 mM tris HCl, pH 8.3, 600
24h en MEM sevrage. Enfin,
nM ROX qui est un dérivé de la rhodamine
elles ont été traitées 48h dans du
utilisé comme référence interne passive
MEM sevrage supplémenté de
pour normaliser la fluorescence), 20 U
1ng/ml de FGF-2, 0.5mM de
d’ADN polymérase AmpliTaq Gold, 300
NaB, 2µM de C2, et/ou 200
µM de dATP, dCTP, dGTP, dUTP, 200
ng/ml de NGF.
nM d’amorces sens et antisens et 200 nM
- Concernant les test avec le C2
de sonde.
ou le butyrate de sodium (NaB)
en présence de sérum, le milieu

11. La transcription inverse se fait Les cellules sont décolées par 200
pendant 30 min à 48°C. On active ensuite µl (pour une boite de pétri 100mm) de
par chauffage l’AmpliTaq Gold 10 min à
tampon de lyse (0.3% SDS, 1% β-
95°C. Puis on effectue 40 cycles dans les
mercaptoéthanol, 0.5% Triton X100). Les
conditions suivantes : 15 sec à 95°C
cellules ainsi récupérées sont laissées 5 min
(dénaturation) puis 90 sec à 60°C
dans la glace, puis les protéines sont
(hybridation + élongation).
dissociées par ultrasons. On centrifuge 3
Les données recueillies sont
min à 10000 tr/min, on dose le surnageant
comparées à une courbe étalon amplifiée
en spectrophotométrie (longueur d’onde :
simultanément aux échantillons à partir
595nm), puis on stocke la solution de
d’une quantité connue des ARN standard
protéines à –20°C.
respectifs. Une courbe d’amplification est
Pour augmenter l’efficacité du
réalisée par informatique (logiciel Abi-
western, on réalise une
Prism 7700) en rapportant l’intensité du
immunoprécipitation au préalable avec les
signal fluorescent au nombre de cycles de
anticorps spécifiques de TrkA, p75 et NGF.
PCR. La courbe étalon est basée sur une
relation linéaire entre le logarithme de la
quantité d’ARN standard de départ et le
h) Test d’apoptose en Hoescht
seuil significatif d’augmentation de la
fluorescence ( = cycle de sortie).
Nous avons réalisé les test
d’apoptose dans des boites de pétri de
35mm de diamètre, dans lesquels sont
g) Immunoprécipitation et
déposées 3 lamelles de microscopie cottées
analyse en Western blot au collagène. Les cellules y sont
encemencées et traitées dans les mêmes
conditions que décrites précédemment.

12. A l’issue du traitement, on aspire le puis montées sur lames microscopiques
millieu, les cellules sont fixées au méthanol avec du glycérol.
à –20°C puis rincées 2 fois au PBS . On On lit les lames en microscopie à
place ensuite les lamelles dans une solution fluorescence. L’observation de la
de Hoescht, 15 min, à température morphologie des noyaux permet de
ambiante et à l’abris de la lumière. Les déterminer la proportion de cellules en
lamelles sont enfin rincées 2 fois au PBS apoptose.
________________________________________________________

13. RESULTATS :
de phénol, nous avons décidé d’utiliser en
Les résultats obtenus se composent sevrage du MEM sans rouge de phénol.
en 3 parties, chacune concernant Ceci nous donne 2 conditions standard
l’expression du NGF et des ses récepteurs : extrêmes de culture : en condition favorable
• dans différents types cellulaires de sein et en condition limitante.
humain. L’objectif a été de collecter les
• et leur évolution en fonction de la informations necessaires au choix d’un
densité cellulaire. modèle expérimental pour la suite du
travail.
• sur des cellules traitées par des facteurs
agissant sur la prolifération ou
l’apoptose. a) Expression du gène p75.
La fig. 1A présente le résultat en
1) Expression du NGF et de ses RT-PCR quantitative du niveau
d’expression des ARN messagers de p75.
récepteurs (TrkA et p75) dans les
Les types cellulaires sont classées de la
lignées de cancer du sein et sur les
façon suivante : d’abord les cellules
cellules normales.
normales, puis les lignées cancéreuses par
ordre décroissant d’hormonodépendance.
Cette étude regroupe toutes les
On observe pour la majorité des
lignées décrites dans « matériel et
types cellulaires une expression de p75
méthodes ». Les cellules ont été cultivées
significativement plus importante sans SVF.
dans des conditions d’étude standard : en
Il y a une exception néanmoins : la lignée
MEM – SVF ou en MEM sevrage. Compte
tenu de l’activité oestrogénique du rouge

14. MCF-7 exprime de façon égale ce gène MDA-MB-231, MDA-MB-453 et MDA-
dans les conditions de sérum et de sevrage. MB-468. Dans le cas des lignées BT-20 et
Ce sont dans les lignées MCF-7, T47-D, TrkA est largement plus exprimé
T47-D et BT-20 que l’expression du gène dans les cultures avec du sérum.
p75 est la plus importante. Elle est par L’expression de TrkA est la plus
contre particulièrement faible dans les faible dans les cellules normales, les MCF-
cellules normales, ainsi que dans les lignées 7, les MDA-MB-231 et les MDA-MB-453.
SKBr3, MDA-MB-453 et MDA-MB-468.
c) Expression du gène du
b) Expression du gène TrkA. NGF.
Les résultats sont présentés dans la Les résultats ne sont pas présentés
fig. 1B. car l’expression est nulle ou suffisamment
On observe dans la plupart des faible pour ne pas être détectable en PCR,
types cellulaires une expression équivalente même après 40 cycles, et ce, dans chacune
de TrkA dans les conditions de sérum et de des conditions précédentes et pour chaque
sevrage. Cela concerne les cellules type cellulaire testé.
normales, ainsi que les MCF-7, SKBr3,

15. Fig. 1A :
Fig. 1B :

16. représente le début de la phase plateau avec
2) Variation de l’expression du 270000 cellules.
Ce travail présente l’expression des
NGF et de ses récepteurs (TrkA et
ARN messagers des étudiés.
p75) en fonction de l’inhibition de
contact.
Le résultat de cette étude est
présenté dans la fig. 2A pour p75 et fig.
2B pour TrkA. Comme dans l’étude
Cette étude a été réalisée sur la
précédente, l’expression du NGF a été testé
lignée cancéreuse MCF-7.
et il n’est pas exprimé de façon mesurable.
L’encemencement s’est fait à 50000
On observe une expression
cellules par boites. Le jour 1 correspond à
relativement forte des 2 récepteurs du NGF
la phase « lag » avec 71600 cellules par
lors de la phase d’adhérence. Par la suite,
boites. Les jours 2 et 3 composent la phase
cette expression diminue progressivement
« log » avec respectivement 104000 et
jusqu’à la phase de plateau.
181000 cellules par boites. Enfin, le jour 4

17. Fig. 2A :
Fig. 2B :

18. 3) Variation de l’expression du MEM – SVF, ou après un traitement par le
FGF-2 en condition de sevrage. Suite aux
NGF et de ses récepteurs (TrkA et
résultats de cette étude qui montre une
p75) en fonction de substances
réponse parfaitement identique dans les 2
agissant sur la croissance et/ou
lignées, nous avons continué le travail sur
l’apoptose.
la seule lignée MCF-7.
Nous avons ensuite étudié en détail
l’effet conjoint du NaB ou du C2 avec le
Cette étude a été commencé sur NGF.
deux lignées cellulaires (MCF-7 et BT-20) Cette 3ème partie comprend des tests
choisies comme modèle d’étude au vue des d’apoptose en Hoescht, des tests de RT-
résultats précédents. Nous avons défini PCR quantitative sur les gènes TrkA et p75
l’expression de TrkA et p75 (NGF n’étant qui sont confirmés par Western blot.
pas exprimé, comme précédemment) après
un traitement par le C2 ou le NaB en milieu

20. DISCUSSION ET CONCLUSION:
Les résultats de cette étude montrent comment évolue la sensibilité des cellules
épithéliales mammaires humaines pour le NGF.
Il a fallu tout d’abord choisir le modèle expérimental de l’étude. Nous avons pour cela
comparé le niveau d’expression du NGF et de ses récepteurs (TrkA et p75) dans les différentes
cellules usuelles d’étude du cancer du sein. Le profil obtenu, tant pour p75 que pour TrkA, a
montré des divergences de comportement entre les différents types cellulaires. Nous avons
donc choisi deux lignées : MCF7 qui est typiquement la lignée prototype des études sur le
cancer du sein ; et BT-20 dont le comportement semble (au vu de cette étude préalable)
différent de MCF7 et qui a l’avantage d’avoir un niveau d’expression assez élevé pour les
gènes de notre étude. Par la suite, en constatant que la réponse de ces deux lignées aux
traitements, aussi bien sur la plan de la croissance que de l’expression des gènes, était
identique, nous avons fini l’étude sur la seule lignée MCF-7.
Tout d’abord, les cellules épithéliales mammaires humaines (aussi bien les cellules
normales que les cellules cancéreuses) ne produisent pas le NGF. L’hypothèse de la voie de
régulation autocrine s’avère donc non fondée.
Nous avons largement observé l’expression des deux récepteurs du NGF (TrkA et p75)
en conditions routinière ainsi que son évolution suite à un traitement par des molécules
agissant sur la prolifération ou/et sur l’apoptose. Grâce à la technique de RT-PCR quantitative,
nous n’avons pas constaté de différence d’expression des récepteurs TrkA et p75 suite à un
traitement de 48h avec du FGF-2 ou du C2. Nous avons par contre observé une expression de
p75 de l’ordre de trois fois celle du contrôle en cas de traitement 48h avec du NaB. Avec ce

21. même traitement, TrkA ……… Ceci a pu être vérifié dans deux lignées différentes (MCF-7 et
BT-20), avec un profil de réponse au traitement parfaitement identique.

22. BIBLIOGRAPHIE :
Descamps et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 : 16659-62.

23. REMERCIMENTS :
Je remercie chaleureusement le Professeur H. Hondermarck et le Docteur J.P. Peyrat pour
m’avoir laissé beaucoup de liberté dans l’organisation de mon travail tout en me faisant bénéficier d’un
encadrement régulier et de qualité.
Un grand merci au Professeur B. Boilly pour l’interret constant qu’il a porté à mon travail et
pour m’avoir généreusement fait profiter de son expérience.
Je remercie tout particulièrement Simon Descamps pour sa patience et sa disponibilité à mon
égard.
Merci aux Docteurs X. Dong-Lebouhris et Y. El Yazidi pour leur bonne humeur et leur
gentillesse.
Je me dois aussi de ne pas oublier tous ceux sans qui mon travail n’aurait pas pu être aussi
enrichissant : Pr Victor Nurcombe, Dr Patrice Richard, Dr. Louis Hornez, Dr. Françoise Révillon,
Valérie C., Valérie P., Anne-Sophie, Rachel, Sylviane, Isabelle, Marie-Michelle, Laurent, Robert-Alain,
David V., David L., Johan, Alain, Arnaud,…
Une pensée émue enfin, avec l’espoir sincère d’une rapide guérison, pour Anthony, je te
souhaite tous mes vœux pour une longue carrière dans la recherche quand ta maladie sera passée.