Prof. DR. H. Harrizul Rivai. M.S.
Guru Besar Kimia Farmasi
Fakultas Farmasi
Universitas Andalas

Pedoman yang ada
 Pedoman Industri dari FDA: Validasi Metode
Bioanalitik, September 2013
 Pedoman EMA tentang Validasi Metode Bioanalitik,
Februari 2012
23/03/2020 Harrizul Rivai 2

Kepatuhan pada GCP / GLP
 Studi klinis harus dilakukan dalam kondisi yang sesuai
dengan prinsip Good Clinical Practice (GCP), dan untuk
metode analisis dan prosedur penanganan data sampel
sesuai dengan prinsip Good Lab Practice (GLP).
 GCP / GLP diperlukan untuk memastikan Kualitas dan
Kredibilitas
 Kredibilitas sangat penting karena persetujuan produk
berdasarkan hanya 1 atau beberapa studi
 Validasi metode bioanalitik meliputi:
 pengembangan metode
 validasi pra-studi
 validasi dalam studi
23/03/2020 Harrizul Rivai 3

Standar pembanding
 Analisis obat dan metabolitnya dalam matriks biologis
dilakukan dengan menggunakan sampel yang dibubuhi
dengan standar kalibrasi (referensi) dan menggunakan
sampel kontrol kualitas (QC).
 Kemurnian standar pembanding yang digunakan untuk
menyiapkan sampel yang dibubuhi dengan standar dapat
mempengaruhi data penelitian.
 Oleh karena itu, standar pembanding yang otentik dengan
identitas dan kemurnian yang diketahui harus digunakan
untuk menyiapkan larutan dengan konsentrasi yang
diketahui
23/03/2020 Harrizul Rivai 4

Standar pembanding
 Nomor sumber dan jumlah, tanggal kedaluwarsa,
sertifikat analisis bila tersedia, dan / atau bukti
identitas dan kemurnian eksternal atau eksternal harus
dilengkapi untuk setiap standar pembanding.
 Jika memungkinkan, standar pembanding harus
identik dengan analit
 Bila hal ini tidak mungkin, bentuk kimia yang telah
stabil (basis basa atau asam, garam atau ester) dengan
kemurnian yang diketahui dapat digunakan
23/03/2020 Harrizul Rivai 5

Standar pembanding
 Tiga jenis standar pembanding yang lazim digunakan:
(1) standar pembanding bersertifikasi (misalnya, standar
perbandingan USP, BPFI);
(2) standar pembanding yang tersedia secara komersial yang
diperoleh dari sumber komersial terkemuka;
(3) bahan lain dengan kemurnian yang terdokumentasi yang
disintesis oleh laboratorium analitik atau lembaga
nonkomersial lainnya
23/03/2020 Harrizul Rivai 6

PENGEMBANGAN METODE
 Pengembangan metode memuat tentang penjelasan
rinci dan spesifik tentang metode bioanalitik yang
harus tertulis
 Penjelasan ini bisa berupa protokol, rencana studi,
laporan, dan/atau standard operational procedure
(SOP)
 Sesuatu metode yang dikembangkan itu dianggap sah
(valid) apabila metode itu telah divalidasi
23/03/2020 Harrizul Rivai 7

VALIDASI METODE
23/03/2020 Harrizul Rivai 8
 Validasi metode adalah prosedur yang membuktikan
bahwa metode dapat diandalkan dan dapat direproduksi
untuk tujuan penggunaan tertentu.
 Jenis validasi metode:
1. Validasi penuh: validasi untuk pertama kali, obat baru, atau
penambahan metabolit
2. Validasi sebagian: validasi terhadap modifikasi metode yang
telah divalidasi
3. Validation silang: validasi untuk perbandingan antar metode

VALIDASI PENDAHULUAN
23/03/2020 Harrizul Rivai 9
Parameter fundamental untuk validasi
• Selektif
• Sensitif
• Tepat
• Teliti
• Stabil
Metode yang
digunakan untuk
penentuan obat
dan/atau
metabolit harus:

Selektivitas
Selektivitas adalah kemampuan metode analitik untuk
membedakan dan mengukur analit dengan adanya
komponen lain dalam sampel
Untuk selektivitas, analisis sampel blanko dari matriks
biologis yang tepat (plasma, urin, atau matriks lainnya)
harus diperoleh dari setidaknya enam sumber
Setiap sampel blanko harus diuji untuk interferensi, dan
selektivitas harus dipastikan di batas bawah kuantifikasi
(LLOQ)
23/03/2020 Harrizul Rivai 10

Selektivitas …
Substansi yang berpotensi mengganggu dalam matriks biologis meliputi:
komponen matriks endogen,
metabolit,
produk dekomposisi,
pengobatan bersamaan dan
xenobiotik eksogen lainnya.
23/03/2020 Harrizul Rivai 11

Pencilan
 Data validasi metode yang dilaporkan dan penentuan
akurasi dan presisi harus mencakup semua pencilan
 Namun, perhitungan akurasi dan presisi tidak
termasuk nilai-nilai yang secara statistik ditentukan
sebagai pencilan juga dapat dilaporkan
23/03/2020 Harrizul Rivai 12

Ketepatan (akurasi)
 Keakuratan metode analitis menggambarkan
kedekatan hasil uji rata-rata yang diperoleh dengan
metode untuk nilai sebenarnya (konsentrasi) dari
analit
 Akurasi ditentukan dengan mereplikasi analisis sampel
yang mengandung jumlah analit (sampel-sampel) yang
diketahui
 Akurasi harus diukur menggunakan minimal lima
determinasi per konsentrasi
23/03/2020 Harrizul Rivai 13

Ketepatan …
 Disarankan minimal tiga konsentrasi dalam kisaran
konsentrasi yang diharapkan
 Nilai rata-rata harus berada dalam 15% dari nilai aktual
kecuali di LLOQ, di mana nilai itu tidak boleh
menyimpang lebih dari 20%
 Penyimpangan rata-rata dari nilai sebenarnya berfungsi
sebagai ukuran akurasi
23/03/2020 Harrizul Rivai 14

Presisi (ketelitian)
 Ketelitian metode analitik menggambarkan kedekatan
ukuran individu analit ketika prosedur tersebut
diterapkan berulang kali pada banyak alikuot dari satu
volume homogen tunggal matriks biologis
 Presisi harus diukur menggunakan minimum lima
penentuan per konsentrasi
 Disarankan minimal tiga konsentrasi dalam kisaran
konsentrasi yang diharapkan
23/03/2020 Harrizul Rivai 15

Presisi (ketelitian) …
 Ketelitian yang ditentukan pada setiap tingkat
konsentrasi tidak boleh melebihi 15% dari koefisien
variasi (CV) kecuali untuk LLOQ, di mana ia tidak
boleh melebihi 20% dari CV.
 Presisi kemudian dibagi lagi ke dalam run, presisi
intra-batch atau pengulangan, yang menilai presisi
selama menjalankan analitis tunggal, dan antara-run,
presisi atau pengulangan antar-batch, yang mengukur
presisi dengan waktu, dan mungkin melibatkan analis,
peralatan yang berbeda, reagen, dan laboratorium.
23/03/2020 Harrizul Rivai 16

Presisi: intra-hari dan antar-hari
23/03/2020 Harrizul Rivai 17

 Tanggal 6/2/2020
23/03/2020 Harrizul Rivai 18

Perolehan kembali
 Perolehan kembali analit dalam pengujian adalah
respons detektor yang diperoleh dari jumlah analit
yang ditambahkan dan diekstraksi dari matriks
biologis, dibandingkan dengan respons detektor yang
diperoleh untuk konsentrasi sebenarnya dari standar
otentik murni
 Perolehan kembali berkaitan dengan efisiensi ekstraksi
metode analitik dalam batas variabilitas
23/03/2020 Harrizul Rivai 19

Perolehan kembali …
 Perolehan kembali analit tidak harus 100%, tetapi
tingkat perolehan kembali analit dan standar internal
harus konsisten, tepat, dan dapat diproduksi ulang
 Eksperimen perolehan kembali harus dilakukan
dengan membandingkan hasil analitis untuk sampel
yang diekstraksi pada tiga konsentrasi (rendah, sedang,
dan tinggi) dengan standar yang tidak diekstraksi yang
mewakili perolehan kembali 100%.
23/03/2020 Harrizul Rivai 20

Kurva Kalibrasi (Kurva Standar)
 Kurva kalibrasi (standar) adalah
hubungan antara respons
instrumen dan konsentrasi analit
yang diketahui
 Kurva kalibrasi harus dihasilkan
untuk setiap analit dalam sampel
 Sejumlah standar yang memadai
harus digunakan untuk
mendefinisikan secara memadai
hubungan antara konsentrasi dan
respons.
 Kurva kalibrasi harus disiapkan
dalam matriks biologis yang sama
dengan sampel dalam penelitian
yang dimaksudkan dengan
penambahan matriks dengan
konsentrasi analit yang diketahui.
23/03/2020 Harrizul Rivai 21

Kurva Kalibrasi (Kurva Standar) …
 Jumlah standar yang digunakan dalam membuat kurva
kalibrasi akan menjadi fungsi dari rentang nilai
analitik yang diantisipasi dan sifat hubungan analit /
respons
 Konsentrasi standar harus dipilih berdasarkan rentang
konsentrasi yang diharapkan dalam studi tertentu
 Kurva kalibrasi harus terdiri dari sampel kosong
(sampel matriks diproses tanpa standar internal),
sampel nol (sampel matriks diproses dengan standar
internal), dan enam hingga delapan sampel tidak nol
mencakup rentang yang diharapkan, termasuk LLOQ.
23/03/2020 Harrizul Rivai 22

Batas Kuantifikasi yang Lebih
Rendah (LLOQ)
 Standar terendah pada kurva kalibrasi harus diterima
sebagai batas kuantifikasi jika kondisi berikut
dipenuhi:
1. Respons analit di LLOQ harus setidaknya 5 kali respons
dibandingkan dengan respons kosong.
2. Puncak analit (respons) harus dapat diidentifikasi,
diskrit, dan dapat direproduksi dengan presisi 20% dan
akurasi 80-120%.
23/03/2020 Harrizul Rivai 23

Kurva Kalibrasi/Kurva Standar/
Respons-Konsentrasi
 Model paling sederhana yang secara memadai
menggambarkan hubungan konsentrasi-respons harus
digunakan
 Pemilihan pembobotan dan penggunaan persamaan
regresi kompleks harus dibenarkan
 Kondisi berikut harus dipenuhi dalam
mengembangkan kurva kalibrasi:
1. Penyimpangan 20% dari LLOQ dari konsentrasi nominal
2. 15% deviasi standar selain LLOQ dari konsentrasi
nominal
23/03/2020 Harrizul Rivai 24

Kurva Kalibrasi/Kurva Standar/
Respons-Konsentrasi ...
 Setidaknya empat dari enam standar tidak nol harus
memenuhi kriteria di atas, termasuk LLOQ dan
standar kalibrasi pada konsentrasi tertinggi (ULLQ)
 Tidak termasuk standar tidak boleh mengubah model
yang digunakan
23/03/2020 Harrizul Rivai 25

Efek matriks
 Dalam kasus prosedur berbasis LC-MS-MS, langkah-
langkah yang tepat harus diambil untuk memastikan
kurangnya efek matriks selama penerapan metode,
terutama jika sifat matriks berubah dari matriks yang
digunakan selama validasi metode.
 Bila memungkinkan, matriks biologis yang sama
dengan matriks dalam sampel yang dimaksudkan
harus digunakan untuk tujuan validasi
 Untuk jaringan dengan ketersediaan terbatas, seperti
sumsum tulang, matriks proksi yang sesuai secara
fisiologis dapat diganti
23/03/2020 Harrizul Rivai 26

Pengenceran sampel
 Kemampuan untuk mengencerkan sampel yang
semula di atas batas atas kurva standar harus
ditunjukkan oleh parameter akurasi dan presisi dalam
validasi
23/03/2020 Harrizul Rivai 27

Stabilitas
 Stabilitas obat dalam cairan biologis adalah fungsi dari
kondisi penyimpanan, sifat kimia obat, matriks, dan
sistem wadah.
 Stabilitas analit dalam matriks dan sistem wadah
tertentu hanya relevan dengan sistem matriks dan
wadah tersebut dan tidak boleh diekstrapolasi ke
matriks lain dan sistem wadah lain.
 Stabilitas analit harus ditetapkan sebelum analisis
sampel.
23/03/2020 Harrizul Rivai 28

Stabilitas …
 Prosedur stabilitas harus mengevaluasi stabilitas analit
selama pengumpulan dan penanganan sampel, setelah
penyimpanan jangka panjang (beku pada suhu
penyimpanan yang dimaksudkan) dan penyimpanan
jangka pendek (suhu kamar), dan setelah melalui siklus
pembekuan dan pencairan dan proses analitis.
 Kondisi yang digunakan dalam percobaan stabilitas
harus mencerminkan situasi yang mungkin dihadapi
selama penanganan dan analisis sampel actual.
23/03/2020 Harrizul Rivai 29

Stabilitas …
 Prosedur juga harus mencakup evaluasi stabilitas analit
dalam larutan stok.
 Semua penentuan stabilitas harus menggunakan satu
set sampel yang disiapkan dari larutan stok analit yang
baru dibuat dalam matriks biologis yang sesuai bebas-
analit, bebas-interferensi
 Larutan stok analit untuk evaluasi stabilitas harus
disiapkan dalam pelarut yang sesuai pada konsentrasi
yang diketahui
23/03/2020 Harrizul Rivai 30

1. Stabilitas Pembekuan dan
Pencairan
 Stabilitas analit harus ditentukan setelah tiga siklus pembekuan dan
pencairan
 Setidaknya tiga alikuot pada masing-masing konsentrasi rendah dan
tinggi harus disimpan pada suhu penyimpanan yang dimaksudkan
selama 24 jam dan dicairkan tanpa bantuan pada suhu kamar.
 Ketika sepenuhnya dicairkan, sampel harus dibekukan kembali
selama 12 hingga 24 jam dalam kondisi yang sama
 Siklus beku-cair harus diulang dua kali lagi, kemudian dianalisis pada
siklus ketiga
 Jika analit tidak stabil pada suhu penyimpanan yang dimaksudkan,
sampel stabilitas harus dibekukan pada -70ºC selama tiga siklus
pembekuan dan pencairan
23/03/2020 Harrizul Rivai 31

2. Stabilitas Suhu Jangka Pendek
 Tiga alikuot dari masing-masing konsentrasi rendah
dan tinggi harus dicairkan pada suhu kamar dan
disimpan pada suhu ini dari 4 hingga 24 jam
(berdasarkan pada durasi yang diharapkan bahwa
sampel akan dipertahankan pada suhu kamar dalam
studi yang dimaksudkan) dan dianalisis
23/03/2020 Harrizul Rivai 32

3. Stabilitas Jangka Panjang
 Waktu penyimpanan dalam evaluasi stabilitas jangka
panjang harus melebihi waktu antara tanggal
pengumpulan sampel pertama dan tanggal analisis
sampel terakhir
 Stabilitas jangka panjang harus ditentukan dengan
menyimpan setidaknya tiga alikuot dari masing-masing
konsentrasi rendah dan tinggi dalam kondisi yang sama
dengan sampel penelitian.
23/03/2020 Harrizul Rivai 33

3. Stabilitas Jangka Panjang …
 Volume sampel harus cukup untuk analisis pada tiga
kesempatan terpisah
 Konsentrasi semua sampel stabilitas harus
dibandingkan dengan rata-rata nilai yang dihitung
kembali untuk standar pada konsentrasi yang sesuai
sejak hari pertama pengujian stabilitas jangka panjang.
23/03/2020 Harrizul Rivai 34

4. Stabilitas Larutan Induk (Stok)
 Stabilitas larutan stok obat dan standar internal harus
dievaluasi pada suhu kamar selama setidaknya 6 jam
 Jika larutan stok didinginkan atau dibekukan untuk
periode yang relevan, stabilitasnya harus
didokumentasikan
 Setelah penyelesaian waktu penyimpanan yang
diinginkan, stabilitasnya harus diuji dengan
membandingkan respons instrumen dengan larutan
yang baru disiapkan
23/03/2020 Harrizul Rivai 35

5. Stabilitas Pasca Persiapan
 Stabilitas sampel yang diproses, termasuk waktu
tinggal di autosampler, harus ditentukan
 Stabilitas obat dan standar internal harus dinilai selama
jangka waktu yang diantisipasi untuk ukuran batch
dalam sampel validasi dengan menentukan konsentrasi
berdasarkan standar kalibrasi asli.
23/03/2020 Harrizul Rivai 36

APLIKASI UNTUK ANALISIS OBAT
RUTIN
 Pengujian semua sampel analit dalam matriks biologis
harus diselesaikan dalam periode waktu ketersediaan
data stabilitas
 Sampel dapat dianalisis dengan penentuan tunggal
tanpa duplikat atau analisis replikasi jika metode
pengujian memiliki variabilitas yang dapat diterima
 Apabila presisi dan akurasi tinggi mungkin sulit
dicapai, analisis rangkap dua atau bahkan rangkap tiga
dapat dilakukan untuk estimasi analisis yang lebih
baik.
23/03/2020 Harrizul Rivai 37

Kurva kalibrasi
23/03/2020 Harrizul Rivai 38
 Kurva kalibrasi harus dihasilkan
untuk setiap analit untuk
menguji sampel dalam setiap
analitik dan harus digunakan
untuk menghitung konsentrasi
analit dalam sampel yang tidak
diketahui dalam analitik.
 Proses analitik dapat terdiri dari
sampel QC, standar kalibrasi,
dan (1) semua sampel yang
diproses untuk dianalisis
sebagai satu batch atau (2)
batch yang terdiri dari sampel
yang diproses tidak diketahui
dari satu atau lebih sukarelawan
dalam sebuah penelitian.
QC QCQC QC QCQC

Kurva kalibrasi …
23/03/2020 Harrizul Rivai 39
 Sampel Standar & QC dapat disiapkan dari larutan spiking
stock yang sama, jika stabilitas dan akurasi diverifikasi
 Satu sumber matriks dapat digunakan, jika selektivitas
diverifikasi
 Sampel kurva standar, blanko, QC, dan sampel studi dapat
diatur sesuai dengan yang dipertimbangkan dalam
pelaksanaan.
 Penempatan sampel standar dan QC dalam suatu proses
analitik harus dirancang untuk mendeteksi pergeseran
pengujian selama menjalankan proses analitik.
QC QCQC QC QCQC

Calibration curve
 The calibration (standard) curve should cover the
expected unknown sample concentration range in
addition to a calibrator sample at LLOQ
 Estimation of concentration in unknown samples by
extrapolation of standard curves below LLOQ or above
the highest standard is not recommended
 Instead, the standard curve should be redefined or
samples with higher concentration should be diluted
and reassayed
23/03/2020 Harrizul Rivai 40

Calibration curve
 A matrix-based standard curve should consist of a
minimum of six standard points, excluding blanks
(either single or replicate), covering the entire range.
 The same curve fitting, weighting, and goodness of fit
determined during pre-study validation should be used
for the standard curve within the study
 Changes in the response function relationship between
pre-study validation and routine run validation indicate
potential problems
23/03/2020 Harrizul Rivai 41

Acceptance criteria for calibration
curves
 A matrix-based standard curve should consist of a
minimum of six standard points, excluding blanks
(either single or replicate), covering the entire range
 The same curve fitting, weighting, and goodness of fit
23/03/2020 Harrizul Rivai 42

Acceptance range for calibration
standards
 Matrix-based standard calibration samples: 75%, or a
minimum of six standards, when back-calculated
(including ULOQ) should fall within ±15%, except for
LLOQ, when it should be ±20% of the nominal value
 Values falling outside these limits can be discarded,
provided they do not change the established model
 Acceptance criteria for accuracy and precision should
be provided for both the intra-day and intra-run
experiment
 Acceptance criteria of pre-study validation (15%)
23/03/2020 Harrizul Rivai 43

Quality Controls to monitor
 It is preferable to analyze all study samples from a
subject in a single run
 Once the analytical method has been validated for
routine use, its accuracy and precision should be
monitored regularly to ensure that the method
continues to perform satisfactorily
 To achieve this objective, a number of QC samples
prepared separately should be analyzed with processed
test samples at intervals based on the total number of
samples
23/03/2020 Harrizul Rivai 44

Quality controls (QC)
 The QC samples in duplicate at three concentrations
(one near the LLOQ (i.e., 3 x LLOQ), one in midrange,
and one close to the high end of the range) should be
incorporated in each assay run
 The number of QC samples (in multiples of three) will
depend on the total number of samples in the run
 The results of the QC samples provide the basis of
accepting or rejecting the run
23/03/2020 Harrizul Rivai 45

Acceptance criteria for QCs
 At least 67% (four of every six) QC samples should be within 15% of
their respective nominal value
 Two of the six (33%) QC samples may be outside the 15% of their
respective nominal value, but not both at the same concentration
 The minimum number of samples (in multiples of three) should be at
least 5% of the number of unknown samples or six total QCs,
whichever is greater.
 The data from rejected runs need not be documented, but the fact
that a run was rejected and the reason for failure should be recorded
23/03/2020 Harrizul Rivai 46

Re-analysis of samples or repeat
analyses
 The rationale and the reporting should be clearly documented
 Documentation should include
 the initial and repeat analysis results
 the reported result
 assay run identification
 the reason for the repeat analysis
 the requestor of the repeat analysis, and
 the manager authorizing reanalysis.
 Repeat analysis of a clinical or preclinical sample should be
performed only under a predefined SOP.
23/03/2020 Harrizul Rivai 47

Repeat analysis
 SOP or guideline for repeat analysis, reasons
for repeating and acceptance criteria
 Reasons for repeat analyses could include:
 Repeat analysis of clinical or preclinical samples
for regulatory purposes,
 inconsistent replicate analysis,
 samples outside of the assay range,
 sample processing errors,
 equipment failure,
 poor chromatography, and
 Inconsistent pharmacokinetic data
 Reassays should be done in triplicate if
sample volume allows
23/03/2020 Harrizul Rivai 48

Sample Data Reintegration
 An SOP or guideline for sample data reintegration
should be established
 This SOP or guideline should explain the reasons for
reintegration and how the reintegration is to be
performed
 The rationale for the reintegration should be clearly
described and documented
 Original and reintegration data should be reported
23/03/2020 Harrizul Rivai 49

DOCUMENTATION
 Documentation of successful completion of validation
studies should be provided in the assay validation
report
 General and specific SOPs and good record keeping are
an essential part of a validated analytical method
 The data generated for bioanalytical method
establishment and the QCs should be documented and
available for data audit and inspection
23/03/2020 Harrizul Rivai 50

Documentation to submit
 Documentation for submission to the Agency should
include:
 (1) summary information,
 (2) method development and establishment,
 (3) bioanalytical reports of the application of any methods
to routine sample analysis, and
 (4) other information applicable to method development
and establishment and/or to routine sample analysis.
23/03/2020 Harrizul Rivai 51

Thank you very much for your
attention!
23/03/2020 Harrizul Rivai 52