Aula samonella

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Aula samonella

  1. 1. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos Professora Samira Mantilla
  2. 2. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos 1 CARACTERÍSTICAS E TAXONOMIA DO MICRORGANISMO  TAXONOMIA  Enterobacteriaceae  Mais de 2463 sorotipos  Algumas mudanças ocorreram na taxonomia da Salmonella.  Todas as salmonelas foram agrupadas em duas espécies:  S. enterica e S. bongori. E os sorovares (subdivisão das espécies baseadas nas diferenças antigênicas) foram divididos em subespécies, muitas classificadas como S. enterica.  Então, a forma existente há muito tempo de tratar sorovares de Salmonella como espécies não é mais válida. Ex: S. typhimurium deve ser referenciada como S. enterica sorovar Typhimurium ou somente S. Typhymurium.
  3. 3. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  CARACTERÍSTICAS  BGN – maioria é móvel (flagelos peritríquios),  não produtores de esporos  Anaeróbios facultativos  Produzem gás a partir da glicose (menos S. Typhi)  antígenos:  somáticos = Otermoestáveispolissacarídeos–membrana  flagelares = H termolábeisproteínas dos flagelos  capsulares = K termoestáveispolissacarídeos-cápsulas
  4. 4. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Temperatura ideal: 35-37°C (mínima 5 e máxima 47°C)  pH ótimo pra multiplicação: 7,0  Não resiste a pH <4,0 e > que 9,0  Não toleram concentrações de sal superiores a 9%  O nitrito é inibitório
  5. 5. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Epidemiologicamente, as salmoinelas podem ser distribuídas em três grupos:  1- As que infectam somente os homens: S. Typhi, S. Paratyphi.  2- Sorovares adaptados ao hospedeiro (alguns dos quais são patógenos humanos e costumam ser adquiridos por meio de alimentos): S. Gallinarum (frango), S. Dublin (gado), S. Abortus-equi (equino), S. Abortus-ovis (ovino) e S. Choleraesuis (suíno)  3- Sorovares não adaptados (sem preferência por hospedeiro)- são patogênicos aos homens e animais, incluindo muitos sorovares causadores de infecções alimentares.
  6. 6. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  2 DISTRIBUIÇÃO AMBIENTAL  Amplamente distribuídas na natureza, sendo o trato intestinal do homem e de animas os principal reservatório natural.  Entre os animas, as aves são as mais importantes (aves podem se portadores assintomáticos=eliminação de Salmonella nas fezes.  Alimentos envolvidos: Carnes  resfriadas – congeladas – pH= 4,5-9,0 – temperatura até 41-45ºC; ovos, leite cru.  Água do mar (3% NaCl): pescado
  7. 7. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos   Causas da salmonelose humana  consumo alimentos contaminados – métodos de processamento tecnológico -  Transmissão direta (animal – animal; humano- humano) – fontes residuais (água – esgoto); alimentos processados  Salmonelose impacto: sócio-econômico – alimentar – saúde coletiva
  8. 8. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  3 CARACTERÍSTICA DA DOENÇA  As doenças causadas por salmonelas são divididas em:  Febre tifóide (S. Typhi)  Febres entéricas (S. Paratyphi)  Enterocolites – demais salmonelas
  9. 9. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Febre tifóide  Só acomete o homem (água e alimentos contaminados com material fecal humano).  Sintomas muito graves: septicemia, febre alta, diarréia , vômito  Se multiplicam dentro de células fagocitárias  Duram 1-8 semanas  Antibióticos: cloranfenicol e ampicilina
  10. 10. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Febre entérica  Semelhante a tifóide, mas os sintomas são mais brandos.  No máximo 3 semanas  Antibióticos –mesmo da outra
  11. 11. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos
  12. 12. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Enterocolites (salmoneloses)  A infecção alimentar é causada pela ingestão de alimentos que contenham números significativos de sorovares não hospedeiro- específicos do gênero Salmonella.  A S. Choleraesuis foi descrita como a que apresenta a maior taxa de mortalidade (21%). S. Dublin e S. Enteretidis também são as mais patogênicas para o homem.  Diarréia, vômito, febre, dores abdominais  PI:12-36 h, dura 4 dias – geralmente não necessitam de antibióticos  Muitos pacientes tornam-se portadores após a cura da doença!!!!  Em crianças e imunodeprimidos: pode ser grave: atingir outros orgãos
  13. 13. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Mecanismos de patogenicidade:  Começa na mucosa do intestino delgado e cólon  Salmonelas atravessam a camada epitelial intestinal, alcançam a lâmina própria (camada na qual as células epiteliais estão ancoradas) onde proliferam  Causam uma mudança na aparência da superfície da célula hospedeira, resultando na internalização da bactéria em uma vesícula – este efeito é denominado arrepio.  São fagocitadas resultando em resposta inflamatória.  Ao contrário das outras doenças (febre entérica e tifóide), neste caso, as salmonelas ficam somente nesta lâmina, não indo para corrente circulatória.
  14. 14. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Uma vez dentro das células de defesa, as salmonelas permanecem em vacúolos ligados à membrana durante todo o seu estágio intracelular.  Após a multiplicação, as células se rompem e o patógeno é disseminado.
  15. 15. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Endotoxina (LPS) – seu papel como agentes causadores de diarréia é questionado  Todos os sorovares de S. enterica apresentam ilhas de patpgenicidade (SPI)-regiões do DNA bacteriano que possuem um número de genes de virulência.  Enterotoxina: acredita-se que esta é responsável pelo processo diarréico  Adesinas:fímbrias  Citotoxina: inibidora da síntese protéica  Proteína SpiC –previne a fusão das vesículas com os lisossomos (capacidade de x dentro dos fagócitos)
  16. 16. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  4 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO  4.1 ENRIQUECIMENTO NÃO SELETIVO OU PRÉ-ENRIQUECIMENTO  Meio  Caldo nutritivo não seletivo  Água Peptonada Tamponada (APT)  Incubação 35-37°C/24h
  17. 17. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  4.2 ENRIQUECIMENTO SELETIVO  Meio  Caldo nutritivo seletivo Meios :  Caldo Rappaport e Caldo Selenito Cistina  Caldo Tetrationato –tb pode ser usado  Incubação: banho-maria 41°C ± 0,5/24h (ou 35-37°/24h)
  18. 18. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  4.3 PLAQUEAMENTO SELETIVO  Classificação dos meios: baixa, média e alta seletividade  Baixa seletividade  Ágar Mac Conkey – Ágar Eosina Azul de Metileno  Média seletividade Ágar Salmonella – Shigella – Ágar Hektoen  Alta seletividade –Ágar XLD (xilose lisina desoxicolato)– Ágar BPLS (verde brilhante- vermelho de fenol-lactose-sacarose)  Incubação 35-37°C/24h
  19. 19. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Ágar Hektoen: colônias verdes ou pretas (H2S)
  20. 20. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Ágar XLD: colônias vermelhas, da cor do meio ou pretas (H2S)
  21. 21. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  4.4 TRIAGEM  Selecionar duas colônias características de cada placa  Meios:  Ágar “Triple Sugar Iron” (TSI) –indicador: vermelho de fenol  Ágar “Lisine Iron” (LIA) – indicador púrpura de bromocresol
  22. 22. TSI Se a bactéria fermentar apenas a glicose (presente em baixa concentração –0,1g), a quantidade de ácido produzida será suficiente somente para provocar a viragem no fundo do tubo. Mas se a bact utilizar tb lactose e/ou sacarose, produzirá muito ácido , virando todo o meio para amarelo.
  23. 23. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Leitura:  TSI:  Base amarela com ou sem produção de gás; produção de sulfeto de hidrogênio: muitos aa contém enxofre e a salmonela pode usá-lo produzindo H2S. O ágar TSI contêm sal de ferro. A reação do sal de ferro com o H2S produz sulfeto ferroso que é um sal preto; bisel rosa ou inalterado Não inoculado Típico de Salmonella
  24. 24. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original).  A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)
  25. 25. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Leitura LIA:  Não muda de cor +  Observa-se produção de sulfeto  Descarboxila a lisina – meio alcalino
  26. 26. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original).  A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)
  27. 27. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  4.5 SERIAÇÃO BIOQUÍMICA  Uréia (-) –Caldo uréia  Meio SIM(sulfeto, indol, motilidade) (+) (-) (+)  Caldo uréia e meio SIM:Incubação 35- 37°C/24h  Oxidase (-) palito esterilizado – tiras. Leitura em 10-20 segundos.
  28. 28. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Leitura:  Caldo uréia –permanece da mesma cor (uréia negativo) não produz a enzima urease  SIM- produção de sulfeto, motilidade e indol negativo  Teste do indol: verifica se a bactéria é capaz de desaminar o aa triptofano – libera indol que é detectado pelo reativo de Kovacs. A reação do indol com o reativo de Kovacs gera uma coloração avermelhada.  Oxidase: verifica a presença da enzima citocromo c oxidase (transfere elétrons na cadeia). O reativo, ao receber os elétrons, na cadeia respiratória de oxida e muda de cor =azul
  29. 29. SIM
  30. 30. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos Comportamentos atípicos:  Fermentação da lactose: TSI todo amarelo  Fermentação sacarose: TSI com o bisel amarelo  Não produção de sulfeto (14% não produz sulfeto)  Não descarboxilação da lisina (meio ácido). 4 a 5% são lisina negativo  Produção do indol (anel vermelho no meio SIM). 1% são indol +  Não motilidade: algumas são imóveis
  31. 31. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  4.6 SOROLOGIA  Triple Sugar Iron  Ágar Nutriente  Suspensão Bacteriana  Soro Polivalente  Aglutinação
  32. 32. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  Resultado  Positivo para Salmonella spp. quando as culturas apresentarem reações típicas nas provas bioquímicas E reação sorológica + (antisoro polivalente O)  Resultado: Presença ou ausência em 25g
  33. 33. Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos  5 MEDIDAS PREVENTIVAS  Calor  Exclusão competitiva: impede que a Salmonella colonize o TGI das aves no início de suas vidas: culturas microbianas mistas contendo bactérias inócuas que ocuparão os sítios de ligação das salmonelas –reduz a presença deste patógeno na granja

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