O slideshow foi denunciado.
Seu SlideShare está sendo baixado. ×

Nghiên cứu vi nhân giống cây cao su bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (CAO ĐẲNG)
NIÊN KHÓA 2011 – 2014
BƯỚC ĐẦU N...
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này trước tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Phan
Văn Thuần đã tận tình giúp đỡ, hướng d...
NHẬN XÉT
Của giáo viên hướng dẫn
............................................................................................
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio
Anúncio

Confira estes a seguir

1 de 54 Anúncio

Nghiên cứu vi nhân giống cây cao su bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Nghiên cứu vi nhân giống cây cao su bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Nghiên cứu vi nhân giống cây cao su bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Anúncio
Anúncio

Mais Conteúdo rRelacionado

Mais de Luận Văn Tri Thức (20)

Mais recentes (20)

Anúncio

Nghiên cứu vi nhân giống cây cao su bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

  1. 1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (CAO ĐẲNG) NIÊN KHÓA 2011 – 2014 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG Chuyên Ngành: SƯ PHẠM SINH HỌC VIẾT THUÊ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LUANVANTRITHUC.COM ZALO: 0936.885.877 TẢI TÀI LIỆU NHANH QUA ZALO Giáo viên hướng dẫn : ThS. PHAN VĂN THUẦN Sinh viên thực hiện MSSV Lớp : HUỲNH NGỌC ANH : 111C840002 : C11SH02 Bình Dương, Tháng 05 Năm 2014
  2. 2. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này trước tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Phan Văn Thuần đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo ThS. Nguyễn Thanh Thuận và bạn Nguyễn Thị Xuân Thùy đã đồng hành và giúp đỡ em. Em xin cảm ơn Trường Đại học Thủ Dầu Một, khoa Khoa học Tự nhiên, bộ môn Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi để khóa luận này được hoàn thành. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Khoa học Tự nhiên, gia đình và các bạn sinh viên lớp C11SH02 đã động viên và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận này. Sinh viên thực hiện Huỳnh Ngọc Anh
  3. 3. NHẬN XÉT Của giáo viên hướng dẫn .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... Bình Dương, Ngày tháng năm 2014
  4. 4. NHẬN XÉT Của giáo viên phản biện .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... Bình Dương, Ngày tháng năm 2014
  5. 5. MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................................. iv DANH MỤC CÁC HÌNH..................................................................................................................v DANH MỤC BIỂU ĐỒ.................................................................................................................... vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.........................................................vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài.............................................................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài..................................................................................................................................2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...........................................................................................2 4. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................................................3 5. Bố cục của đề tài .............................................................................................................................3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................................5 1.1. LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ .......................................................5 1.2. NHỮNG ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG INVITRO............ 10 1.2.1. Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro ................................................................... 10 1.2.2. Hạn chế của nhân giống vô tính in vitro..................................................................... 11 1.3. ỨNG DỤNG CỦA NHÂN GIỐNG INVTRO Ở MỘT SỐ CÂY CÔNG NGHIỆP.................................................................................................................................. 12 1.4. VÀI NÉT VỀ CÂY CAO SU ............................................................................................. 15 1.4.1. Đặc điểm chung của họ Cao su ...................................................................................... 15 1.4.2. Đặc điểm riêng của cây Cao su ...................................................................................... 17 1.4.2.1. Tên khoa học.................................................................................................................... 17 1.4.2.2. Đặc tính thực vật............................................................................................................ 17 1.4.2.3. Thành phần hóa học...................................................................................................... 19 i
  6. 6. 1.4.3. Giá trị kinh tế của cây Cao su ......................................................................................... 20 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 22 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 22 2.1.1. Trang thiết bị và dụng cụ.................................................................................................... 22 2.1.2. Vật liệu ....................................................................................................................................... 22 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 22 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu..................................................................................... 22 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.................................................. 23 2.2.2.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy.............................................................................. 23 2.2.2.2. Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu................................................................ 25 2.2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro........................... 26 2.2.3. Phương pháp xử lý thống kê số liệu .............................................................................. 28 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................ 29 3.1. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ MỘT SỐ MẪU CÂY CAO SU................................................................................................................. 29 3.2. THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ CÀNH CỦA CÂY CAO SU.......................................................................................................... 31 3.3. THÍ NGHIỆM 3: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI TỪ CÁC MẪU VẬT VÔ TRÙNG CỦA CÂY CAO SU................................................ 34 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................... 39 ii
  7. 7. 1. KẾT LUẬN .................................................................................................................................... 39 2. KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................................................... 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................... 40 iii
  8. 8. DANH MỤC CÁC BẢNG TT TÊN CÁC BẢNG TRANG 1. Bảng 2.1. Thành phần môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962).................................................................................................................24 2. Bảng 3.1. Tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel).................................................29 3. Bảng 3.2. Tỉ lệ (%) mẫu được vô trùng với chất khử trùng HgCl2 0,1% ở thời gian khác nhau............................................................................32 4. Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi từ các mẫu ở các môi trường nuôi cấy..................................................................................................................................34 iv
  9. 9. DANH MỤC CÁC HÌNH TT TÊN CÁC HÌNH TRANG 1. Hình 3.1. Mẫu in vitro từ hạt cây cao su ...................................................................31 2. Hình 3.2. Mẫu chồi đỉnh và chồi nách vô trùng khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% 33 3. Hình 3.3. Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS 36 4. Hình 3.4. Sự thích ứng của mẫu với môi trường MS bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA 37 5. Hình 3.5. Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BAP 5mg/L + IBA 5mg/L 38 v
  10. 10. DANH MỤC BIỂU ĐỒ TT TÊN BIỂU ĐỒ TRANG 1. Biểu đồ 3.1. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel) ......... 30 vi
  11. 11. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisis acid BA : N6 -Benzyl adenine BAP : Benzyl amino purine cs : cộng sự DNA : Deoxyribonucleotid acid IBA : Indole-3-butyric acid MS : Murashige và Skoog (1962) NAA :  - naphthaleneacetic acid IAA :  -indolacetic acid 2,4-D : 2,4-D dichlorophenoxy acetic acid TDZ : Thidiazuron vii
  12. 12. MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy in vitro như: Nuôi cấy phôi, cơ quan, tế bào và protoplast. Việc ra đời của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mở ra một hướng mới cho nghiên cứu thực vật, nó nhanh chóng dành được một vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất và cải thiện giống cây trồng [24]. Kỹ thuật nhân giống in vitro không chỉ ứng dụng để nhân giống và phục tráng cây trồng mà nó còn đem lại hiệu quả kinh tế cao trong việc nhân nhanh và tạo ra một số lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh, đặc biệt là còn giữ được tính trạng quý của bố mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng như vật liệu vô trùng cho các thí nghiệm [16]. Cho đến nay, có nhiều đối tượng cây công nghiệp đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào và thu được nhiều kết quả đáng kể như: Cây cà phê, cây tiêu, cây chè… Cây Cao su (Hevea brasiliensis), là một loài cây thân gỗ thuộc về họ Đại kích (Euphorbiaceae) và là thành viên có tầm quan trọng kinh tế lớn nhất trong chi Hevea. Nó có tầm quan trọng kinh tế lớn là do chất lỏng chiết ra tựa như nhựa cây của nó (gọi là nhựa mủ-latex) có thể được thu thập lại như là nguồn chủ lực trong sản xuất cao su tự nhiên [34]. Cây Cao su là loài cây thân gỗ, có thể cao tới trên 30 m. Nhựa hay mủ màu trắng có trong các mạch ở vỏ cây. Cây đạt độ tuổi 5-6 năm thì người ta bắt đầu thu hoạch mủ. Cho năng suất cao nhất trong độ tuổi từ 11 đến 25, sẽ ngừng sản sinh mủ khi đạt độ tuổi 26-32 năm. Ngoài ra, gỗ cao su còn được dùng sản xuất đồ gỗ, được xem là loại gỗ thân thiện với môi trường vì chỉ được khai thác khi cây kết thúc chu trình sinh mủ [36]. 1
  13. 13. Cây Cao su không những mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân tỉnh Bình Dương mà còn là một lợi thế xuất khẩu của Việt Nam. Nhưng mặc khác chất lượng giống cây Cao su ở Việt Nam còn chưa cao và chưa phù hợp với điều kiện khí hậu ở nước ta, bên cạnh đó sâu bệnh phá hoại, các phương pháp nhân giống chủ yếu là truyền thống làm cho mầm bệnh cây Cao su truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác, chất lượng cây con không đồng đều… Xuất phát từ tiềm năng to lớn và những hạn chế gặp phải, chúng tôi đề xuất đề tài: “Bước đầu nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su (Hevea brasiliensis ) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại tỉnh Bình Dương.” 2. Mục tiêu đề tài Thăm dò điều kiện khử trùng và môi trường thích hợp để tạo cụm chồi cây Cao su (Hevea brasiliensis) trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng và nguồn mẫu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây Cao su (Hevea brasiliensis) thuộc: Họ: Euphorbiaceae Bộ: Euphorbiales Lớp: Dicotyledonae Ngành: Angiospermatophyta [20]. Nguồn mẫu nghiên cứu được lấy từ các hộ nông dân trồng cây Cao su tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương. 3.2. Phạm vi nghiên cứu Bước đầu nghiên cứu điều kiện khử trùng và khả năng tạo cụm chồi của cây Cao su. 2
  14. 14. Khóa luận được tiến hành trong thời gian từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014 tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, trường Đại học Thủ Dầu Một. 4. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 0,1%, dung dịch javel với các thời gian khác nhau lên chồi đỉnh, chồi nách, hạt của cây Cao su. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau lên khả năng tạo cụm chồi in vitro của mẫu. 5. Bố cục của khóa luận Bố cục của khóa luận gồm các phần sau: - Mở đầu (4 trang) Phần này gồm các nội dung: Lý do chọn đề tài, mục tiêu đề tài, đối tượng phạm vi nghiên cứu, nội dung nghiên cứu và bố cục của khóa luận. - Chương 1. Tổng quan tài liệu (17 trang) Trong chương này, chúng tôi trình bày các cơ sở lý thuyết và tình hình nghiên cứu liên quan đến nội dung khóa luận. Gồm các nội dung: Lược sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật, những ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro, ứng dụng của nhân giống in vitro ở một số cây công nghiệp và vài nét về cây cao su. - Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (7 trang) Chúng tôi trình bày về vật liệu và phương pháp nghiên cứu bao gồm: Trang thiết bị, dụng cụ và vật liệu nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu tài liệu, phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, phương pháp xử lý thống kê số liệu. - Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận (10 trang) Trong chương này, các kết quả nghiên cứu được trình bày và thảo luận. Chúng tôi trình bày các nội dung sau: 3
  15. 15. + Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng khử trùng từ một số mẫu cây Cao su và thảo luận. + Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng khử trùng từ cành của cây Cao su và thảo luận. + Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng phát sinh chồi từ các mẫu vật vô trùng của cây Cao su và thảo luận. - Kết luận và khuyến nghị (1 trang) Ở phần này, chúng tôi rút ra những kết luận trên cơ sở của kết quả nghiên cứu. Đồng thời, chúng tôi cũng đưa ra những khuyến nghị cho việc tiếp tục nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su. - Tài liệu tham khảo (4 trang) Phần này, chúng tôi liệt kê các tài liệu tham khảo gồm có: Tài liệu tiếng việt, tài liệu nước ngoài và tài liệu internet. 4
  16. 16. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhanh chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật được bao hàm trong ứng dụng của Công nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân giống và nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, cải thiện và tạo giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus…[16]. Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào khẳng định: Mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào [29]. Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào này tách từ nhu mô lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật, kết quả thu được là không thành công [23]. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào ông đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Theo ông, mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là: Mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành công trong thí nghiệm chứng minh 5
  17. 17. chứng tính toàn năng của tế bào do bởi ông đã chọn cây Một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh. Một nguyên nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó những hiểu biết khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mô thực vật còn hạn chế nên ông đã không tìm ra được môi trường dinh dưỡng tối thích hợp cho sự phân chia tế bào [1], [16], [23]. Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành công để chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Nỗi bật là các công trình sau: Năm 1922, Kotte và cs. đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của một cây hòa thảo và đã tạo được một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sau một thời gian ngắn thì hệ rễ này sinh trưởng chậm dần và ngừng lại [23], [32]. Đến năm 1934, White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ Cà chua (Lycopersicum esculentum) trên một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Năm 1937, ông phát hiện tầm quan trọng của các vitamin thuộc nhóm B là B1, B6 và PP để thay thế cho dịch chiết nấm men và thấy rằng việc thay thế này hoàn toàn phù hợp. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Cùng lúc với White, Gautheret cũng đã thu được kết quả phân chia các tế bào của tầng sinh gỗ ở cây liễu [16], [23]. Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo Cà rốt (Daucus carota) bằng cách cấy chuyền đều đặn 6 tuần một lần. Lúc này, White đã thành công tương tự với cây thuốc lá. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật được khai sinh từ đó [17]. Từ năm 1941 – 1954, những phát hiện về vai trò của các chất kích thích sinh trưởng như IAA, NAA, 2,4-D, kinetin và vai trò của các vitamin, nước dừa là tiền 6
  18. 18. đề kỹ thuật cho việc làm thí nghiệm ổn định, dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào [31]. Năm 1951, Nitsch đã khắc phục được tính không giao hợp tiền giao tử khi nghiên cứu và thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dưa chuột và lần đầu tiên tạo được hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có sức sống). Sau này có rất nhiều nhà khoa học thành công trong nuôi cấy hạt phấn, các quá trình sinh trưởng của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện in vitro [19]. Năm 1953, Miller và Skoog tạo được rễ từ mãnh mô cắt từ thân cây Thuốc lá (Nicotiana tabacum). Đến năm 1957, hai ông công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm tỉ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỉ lệ này tăng thì dẫn đến sự tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau và đóng góp rất lớn vào việc điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy [16], [17], [29], [32]. Năm 1958, Reinert và Steward tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch [30]. Năm 1960, Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) lần đầu tiên đã tách được tế bào trần (protoplast) khi dùng enzyme cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật. Cũng trong năm 1960, Bergman thành công trong việc thu một số dung dịch huyền phù không có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết các tế bào đơn. Các tế bào này có thể gieo trên môi trường, trong các hộp lồng, nó sẽ tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo [16], [17]. Năm 1962, Kante và cs. thông báo về khả năng thụ phấn trong điều kiện in vitro của cây Thuốc phiện (Papaver somniferum) [2]. 7
  19. 19. Năm 1964, Guha và cs. thu được phôi trưởng thành từ nuôi cấy bao phấn cây Cà độc dược (Datura inoxia). Năm 1966, ông tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây Cà độc dược. Năm 1967, nhóm Bourgin và Nitsch lại thành công khi tạo cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Những thành công này đã khiến giới khoa học bắt đầu chú ý đến việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. Việc này đã đóng góp rất nhiều kiến thức cho lĩnh vực di truyền thực vật và thực tiễn chọn giống [29]. Năm 1966, Morel hoàn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi Cymbidium. Ý tưởng của ông được thai nghén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên quan sát sự sinh trưởng và phát triển của chồi ngọn cây hoa lan trong lúc cố tìm cách để làm sạch bệnh cây hoa lan giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [2]. Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi cấy protoplast của lá cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh. Cho đến nay, kỹ thuật protoplast đã được thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa các loài, một việc không thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast giúp sự nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, giúp cho việc nghiên cứu vai trò của các DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật dung hợp protoplast đã thu được 104 trường hợp lai, bao gồm con lai trong loài, con lai giữa các loài, con lai giữa các chi và con lai giữa các chi phụ. Đến năm 1995, con số trên đã gấp hai lần. Điều đó chứng tỏ kỹ thuật dung hợp protoplast đã trợ giúp rất hiệu quả cho công tác chọn tạo giống [16], [17]. Từ năm 1972 đến 1977, Melchers đã đưa ra những cải tiến mới về phương pháp nuôi cấy bao phấn và túi phấn để nhận được cây con đơn bội với số lượng lớn và đưa ra các luận điểm cần phải gắn phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với các phương pháp chọn giống khác [18]. 8
  20. 20. Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gene thực vật. Đó là kỹ thuật đưa một gene cần thiết có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật hay một gene tổng hợp vào các giống cây trồng muốn cải tạo. Chỉ trong một thời gian ngắn một loạt phương pháp đưa gene ngoại lai vào thực vật được công bố. Sau khi đưa được gene ngoại lai vào tế bào người ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật để nuôi cấy các tế bào đã được chuyển nạp. Sau đó cho tái sinh lại thành cây nguyên vẹn mang những đặc tính sinh học mới. Chúng sinh trưởng, phát triển, ra hoa, kết hạt bình thường và được coi như một giống cây trồng mới. Lĩnh vực công nghệ gene đã có những thành công to lớn không chỉ trên đối tượng thực vật mà còn thành công trên đối tượng động vật và vi sinh vật. Năm 1988, Toriyama thành công khi chuyển gene kháng bệnh vàng lụi (Tungro) vào protoplast lúa nhóm Japonica và tái sinh cây hoàn toàn từ protoplast chuyển gene. Năm 1991, Burbank đã thành công trong việc ghép gene miễn dịch đối với loài gián cánh cứng Colorado cho khoai tây đã được trồng thử ở một vài nơi ở Maine Oregar. Kết quả khoai tây có thể miễn dịch đặc biệt với loài gián cánh cứng [3], [16], [23]. Ở viện nghiên cứu Nông nghiệp Pháp (INRA), các nhà khoa học đã chuyển thành công gene Capsul vào cây thuốc lá. Các nhà khoa học của viện lúa Quốc tế (IRRI) đã chuyển thành công các gene khác nhau vào cây lúa, cụ thể là gene Bt (gene chống sâu đục thân ở lúa), gene Chitinase chống bệnh do nấm gây ra như đạo ôn, khô vằn. Các giống cây trồng chuyển gene hiện đang được khảo nghiệm và trồng trong điều kiện nhà kính tại Công ty Di truyền chọn giống và sản xuất hạt giống tại Bruxell (Bỉ). Ở Mỹ đã sản xuất hai loại cây trồng là cà chua cứng quả và bảo quản lâu hơn 45 ngày, loại thứ hai là giống ngô chống sâu đục thân và có năng suất cao. Thực vật chuyển gene thực tế đã trở thành hàng hóa trên thị trường. Năm 1996, người ta đã ứng dụng cho trồng trọt khoảng 18.000 km2 từ Ả rập đến Bắc Mỹ và sản phẩm được đem bán trên thị trường với những ưu việt như bí ngô chống chịu được virus, khoai tây và bông không bị côn trùng phá hoại, bông và 9
  21. 21. đậu tương chống chịu được các chất diệt cỏ. Ngô chuyển gene cũng đã được trồng đại trà và được bán rộng rãi trên thị trường Châu Âu [1], [5]. Nói tóm lại, sự phát triển như vũ bão của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật cùng với sự ra đời của công nghệ gene thực vật đã mở ra một hướng mới cho nền nông nghiệp thế giới. Với các giống cây trồng được tạo ra bằng các phương pháp này, nền nông nghiệp thế giới đang bước vào “Cuộc cách mạng xanh lần thứ hai”, góp phần không nhỏ vào đảm bảo an toàn lương thực và nhu cầu của con người. Các nhà nông học sẽ có thêm một phương pháp mới trong việc cải tạo tự nhiên [24]. 1.2. NHỮNG ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG IN VITRO 1.2.1. Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản phẩm thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền. Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ nhân giống vô tính in vitro đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Sản phẩm cây giống đồng nhất: Nhân giống vô tính in vitro về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gene dị hợp hay đồng hợp. Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống. 10
  22. 22. Nâng cao chất lượng cây trồng: Nuôi cấy mô là phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm, vi khuẩn khỏi các cây trồng đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng nuôi cấy mô thường tăng năng suất 15-30 % so với nguồn gốc. Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống nhân giống vô tính in vitro như cây con in vitro hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ. Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về sinh thực vật quốc tế. Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể được tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc vào mùa vụ [12]. 1.2.2. Hạn chế của nhân giống in vitro Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng điều được nhân giống thương phẩm bằng nhân giống vô tính in vitro. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gene. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải quyết. Chi phí sản xuất cao: Nhân giống vô tính in vitro đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn 11
  23. 23. đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng nhân lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền [12]. 1.3. ỨNG DỤNG CỦA NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở MỘT SỐ CÂY CÔNG NGHIỆP Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro thật chất là một tiến bộ vượt bậc về chất của phương thức nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, ghép cành, chiết cành… Ở đây, giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học là đã biến những phương thức cổ điển đó thành những phương thức mới về chất cho phép giải quyết những vấn đề khó khăn, những hạn chế mà phương thức nhân giống cổ điển không thể giải quyết được [15]. Cây công nghiệp ở nước ta gồm cây công nghiệp ngắn ngày như: Mía, sắn, lô hội…; cây công nghiệp dài ngày như các cây: Cà phê, tiêu, điều, ca cao, cao su… là những loại cây chiếm tỉ trọng rất cao trong lĩnh vực nông nghiệp ở nước ta, do mang lại giá trị cao về mặt kinh tế, nhu cầu về những mặt hàng cây công nghiệp trong nước và xuất khẩu khá cao và đang ngày càng tăng. Phương thức nhân giống in vitro cho phép ta có thể tận dụng hầu hết các bộ phận của cây từ đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân, mảnh lá,… để tiến hành nuôi cấy và hiện nay đã mang lại những thành công rất lớn [24]. Kỹ thuật nhân giống in vitro đã được áp dụng rộng rãi để nhân giống các loại cây trồng như: Cây nông nghiệp, cây thuốc, cây hoa… và đã mang lại kết quả cao. Đối với các cây công nghiệp, phương thức nhân giống truyền thống đã được tiến hành phổ biến từ lâu. Ngày nay, việc ứng dụng nhân giống vô tính in vitro cây công nghiệp cũng đã được áp dụng và phát triển mạnh. 12
  24. 24. Một số nghiên cứu ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro ở cây công nghiệp: - Ở cây công nghiệp ngắn ngày: Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang, “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội (Aloe vera L.) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2008: Tập VI, Số 6: 514-521, khoa Nông học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã đạt kết quả rất khả quan. Kỹ thuật tạo vật liệu khởi đầu in vitro nên sử dụng mẫu lấy ở vụ xuân và khử trùng đơn trong dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho hiệu quả khử trùng tốt, tỉ lệ mẫu sống và bật chồi cao (68,5%). Môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi Lô hội in vitro là môi trường MS bổ sung 2,5 mg/L BAP, có hệ số nhân cao (5,3 lần), chất lượng chồi tốt. Môi trường có kinetin và hỗn hợp BAP với - IAA đều không có tác dụng làm tăng hệ số nhân và chất lượng chồi in vitro. Bổ sung 0,5 ppm - NAA hoặc IBA vào môi trường cho tỉ lệ ra rễ cao (79,1 - 89%). Môi trường có than hoạt tính 1,5 - 2,0 g/L cho khả năng ra rễ đạt cao nhất. Tỉ lệ ra rễ đạt 100%, chất lượng rễ tốt. Giá thể ra cây Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn. Cây ra ngôi trên giá thể này tỉ lệ sống đạt 81,4%, cây sinh trưởng phát triển tốt. Thời vụ không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả ra cây Lô hội in vitro [22]. - Ở cây công nghiệp dài ngày: Trên thế giới: Phương pháp vi nhân giống tạo dòng cây Hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy như: Đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trưởng thành (Mathews và Rao, 1984; Agarwal, 1988; Philip và cs. 1992; Nazeem và cs. 1993; Nirmal Babu và cs. 1993; Joseph và cs. 1996; Lissamma và cs. 1996) [7]. Phương pháp vi nhân giống cây tiêu P. chaba đã được (Nirmal Babu và cs. 1993; Rema và cs. 1995) tiêu chuẩn hóa. Sự chuyển hóa của mô phân sinh rễ và mô phân ngọn đã giúp cây con phát triển ở cây tiêu: P. longum và P. colurinum đã 13
  25. 25. được báo cáo về vấn đề này (Nirmal Babu và cs. 1993). Các cây con in vitro của giống cây này đã được đánh giá, thử nghiệm ở phòng nghiên cứu chủng loại Calicus ở Ấn độ. Những phương pháp vi nhân giống cây tiêu này đã đóng góp quan trọng cho nền kinh tế và mối quan hệ giữa các giống tiêu [7]. Trong nước: Năm 2003, Đoàn Thị Ái Thuyền, TS. Thái Xuân Du và Đỗ Xuân Giáp, “Bước đầu nghiên cứu nhân giống một số cây hồ tiêu sạch virus (Piper nigrum L.)” tại viện Sinh học nhiệt đới. Mẫu chồi sau khi lấy được rửa sạch và sát trùng bằng cồn 700 rồi dùng nước tẩy javel pha loãng khoảng 1/3 khử trùng mẫu trong khoảng 30-40 phút. Có thể dùng HgCl2 0,1% hoặc dùng dung dịch kháng sinh Cefotaxin 1% từ 1-2 giờ. Sau khi ngâm trong dung dịch kháng sinh Cefotaxin 1% (1, 2, 24) giờ. Kết quả cho 20-70% mẫu bị nhiễm sau 7-14 ngày nuôi cấy. Khi bổ sung Cefotaxin 1% vào môi trường nuôi cấy. Kết quả cho khoảng 20-30% mẫu được vô trùng hoàn toàn sau 3-4 tuần nuôi cấy. Đồng thời khi cấy chuyển sang môi trường mới không có kháng sinh, chồi mới không có khả năng tái nhiễm trở lại. Ngoài ra, khử nghiệm thử trùng bằng cách kết hợp dung dịch Acid Benzoic bão hòa, dung dịch tẩy javel và kháng sinh. Kết quả thu được khoảng 40-50 % mẫu khử trùng không tái nhiễm. Khả năng tạo chồi mới của đốt gốc là tốt nhất so với đốt giữa và đốt ngọn. Khả năng tạo mô sẹo ở mỗi loại đốt cũng tương tự như ở tạo chồi. Khi nồng độ BA hơn 5,0 mg/L hoặc TDZ sẽ ức chế khả năng hình thành chồi và khi bổ sung một nồng độ Cytokinin và Auxin thích hợp sẽ làm tăng số chồi hình thành ở đốt cấy hồ tiêu. Nồng độ NAA và IBA càng cao thì khối mô sẹo tạo ra càng nhiều. Các mô sẹo trắng, xốp khi chuyển sang môi trường tạo chồi sẽ có ít khả năng tái tạo chồi. Môi trường MS có bổ sung BA (0,5 mg/L), Ki (0,5 mg/L), IBA (0,5 mg/L) là thích hợp cho khả năng biệt hóa chồi từ mô sẹo. Ở nồng độ BA (0,3 mg/L), Ki (0,5 mg/L), IBA (0,5 mg/L) chồi sẽ phát triển mạnh hơn, chồi lớn hơn và khi cắt chồi nuôi cấy trên môi trường MS thì khả năng tạo rễ và phát triển tốt hơn những môi môi trường còn lại. Môi trường tạo rễ là ½ MS + NAA (0,1-1,0 mg/L) hoặc IBA (0,1-1,0 mg/L). Môi trường MS ½ có bổ sung than 14
  26. 26. hoạt tính (1,0 mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu. Không sử dụng Auxin cho mục đích ra rễ [25]. Năm 2005, Nguyễn Hữu Định, ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện “Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Tiêu (Piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cấy mô với chất khử trùng chồi tiêu bằng kháng sinh Tetracylin hoặc Streptomyxin” cho hiệu quả cao nhất khi thời gian xử lí là 6 giờ. Kháng sinh Tetracylin hiệu quả khử trùng cao hơn kháng sinh Streptomyxin. Môi trường thích hợp nhất cho mẫu lá tiêu hình thành và phát triển mô sẹo là môi trường bổ sung 3 mg/L BA + 1 mg/L IBA. Môi trường thích hợp nhất cho mô sẹo tái sinh chồi là môi trường có bổ sung 3 mg/L BA + 0,3 mg/L TDZ [7]. Năm 2011, Nguyễn Cảnh Chính, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã “Nghiên cứu khả năng nhân giống vô tính cây Chè đắng (llex kaushue S.Y Hu) bằng phương pháp giâm cành” [6]. Hiện nay, trên thế giới việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân nhanh các loại cây trồng đã trở thành công cụ nhân giống chủ yếu. Tuy nhiên ở Việt Nam với cây công nghiệp dài ngày như cao su, cà phê… kỹ thuật này còn chưa được nghiên cứu ứng dụng nhiều mặt dù cũng đã có một số kết quả nhất định. Từ năm 1993 đã có công trình nghiên cứu tạo và nhân phôi vô tính từ mô lá cho cây cà phê lai Arabusta của trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia tại thành phố Hồ Chí Minh. Nhưng lượng cây tái sinh trực tiếp từ phôi là không cao và chưa được ứng dụng rộng rãi cho sản xuất [37]. 1.4. VÀI NÉT VỀ CÂY CAO SU 1.4.1. Đặc điểm chung của họ Đại kích hay họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Họ Thầu dầu là một họ lớn, gần 290 chi và khoảng 7500 loài, phân bố chủ yếu ở các xứ nhiệt đới, nhưng các đại diện thân cỏ cũng gặp ở vùng ôn đới, thậm chí 15
  27. 27. vùng hàn đới; trung tâm phân bố chủ yếu của họ là Nam Mĩ, châu Phi, Đông Á và Đông Nam Á. Nước ta có khoảng 80 chi với gần 460 loài [8]. Đặc điểm chung của họ là cây rất đa dạng: Thân gỗ, thân bụi, thân cỏ, đôi khi mọng nước chứa đầy nhựa mủ như sữa. Lá cũng đa dạng: Mọc cách hoặc mọc đối, đơn hoặc kép, gân lông chim hay chân vịt,… thường có lá kèm, đôi khi lá kèm biến thành gai. Hoa tập hợp thành cụm hoa chùm, chùy… gồm nhiều xim hai ngả. Hoa đơn tính, cùng cây hay khác cây. Hoa đều, gốc có là bắc, thường mẫu 5, ít khi mẫu 3. Bao hoa kép hoặc đơn (chỉ có đài), đôi khi hoàn toàn không có bao hoa. Nhị từ nhiều đến 5 hoặc giảm chỉ còn 1 (chi Euphorbia). Trong hoa đực có các dấu vết của nhụy. Bộ nhụy luôn luôn gồm 3 lá noãn dính lại với nhau thành bầu trên, 3 ô, mỗi ô chứa 1 hay 2 noãn đảo. Noãn thường có nút đậy lỗ noãn do vách bầu phát triển thành, về sau để lại di tích trên hạt gọi là mồng. Quả mở thành 3 hay 6 mảnh vỏ, đôi khi là quả mọng hoặc quả hạch. Hạt thường có nội nhủ dầu. [8]. Trong họ Đại kích hay họ Thầu dầu có đến 10 loài cây cho mủ cao su, dưới đây là tên một số loài Hevea khác Hevea brasiliensis [14]. + H. benthamiana: Cây cao trên 27 m, gốc cây phình to. Cây thường mọc ở vùng đất phù sa, ngập nước định kỳ vào mựa mưa ở dọc bờ sông Amazon. Năng suất mủ cao su kém, chất lượng mủ tốt [14]. + H. camagoana: Cây nhỏ, cao từ 2-12 m, mọc cạnh các dòng chảy và vùng đầm lầy. Cây cho năng suất mủ kém, mủ trắng [14]. + H. camporum: Cây thấp, chiều cao dưới 2 m, chỉ tìm thấy ở vùng đầu nguồn, vùng sa mạc, Cây cho năng suất mủ kém, mủ trắng [14]. + H. guianensis: Loài này có vùng phân bố rộng nhất, cây cao 20-35 m, thân hình trụ, thường chỉ phân cành ở chiều cao 1/2 thân trở lên. Năng suất mủ kém, mủ màu hơi vàng, chất lượng mủ thấp [14]. + H. microphylla : Cây cao 18-20 m, thân mảnh khảnh, gốc cây hơi to. Năng suất mủ kém [14]. 16
  28. 28. + H. nitida : Cây nhỏ đến trung bình, thân hình trụ. Mủ màu trắng đậm đặc, chứa nhiều chất nhựa (resin), ít cao su [14]. + H. pauciflora : Cây lớn cao trên 25 m, thân hình trụ. Mủ có màu trắng, chứa nhiều chất nhựa, ít cao su [14]. + H. rigidifolia : Cây cao trung bình 12-18 m, thân hơi nghiêng. Mủ trắng, nhiều chất nhựa, không chứa đủ cao su theo chất lượng thương mại đòi hỏi [14]. + H. Spruceaa: Cây cao đến trên 25 m, gốc cây hơi phình to ra, tán lá nặng, lá mọc hơi chúc xuống, mặt dưới lá có lông tơ. Mủ trắng, ít cao su. Cây mọc trên đất thấp, ngập nước định kỳ ở dọc bờ sông [14]. Ngoài Hevea brasiliensis và 9 loài kể trên còn có trên 2.000 loài thuộc các họ khác cũng có thể cho mủ cao su và phần lớn sống trong vùng nhiệt đới. Nhưng cho đến nay chưa có một loài nào có thể cạnh tranh được với cây Hevea brasiliensis [14]. 1.4.2. Đặc điểm riêng của cây Cao su 1.4.2.1. Tên khoa học Cây Cao su (Hevea brasiliensis) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [20]. 1.4.2.2. Đặc tính thực vật Cây Cao su thuộc loại thân gỗ, to, cao. Sự phát triển chiều cao của thân phụ thuộc vào đỉnh sinh trưởng (chồi ngọn). Thân cao su lúc còn non thường có màu tím hoặc xanh tím. Hình dạng của thân ở cây thực sinh và cây ghép có khác nhau: Thân cây có hình trụ và có chân voi là cây ghép và thân cây hình chóp cụt, không chân voi là cây thực sinh [27]. Khi cắt ngang thân ta có thể thấy rõ ràng 3 phần là gỗ, vỏ và 1 lớp mỏng ngăn cách giữa chúng là tượng tầng (cambium). Mủ cao su chỉ thấy xuất hiện nhiều trong phần vỏ [27]. Lá cao su là loại lá kép lông chim mọc cách, mỗi lá gồm ba lá chét. Khi trưởng thành lá có màu xanh đậm ở mặt trên và xanh nhạt ở mặt dưới. Lá được 17
  29. 29. hình thành do sự phân hóa của đỉnh sinh trưởng. Quá trình phát triển lá có thể chia thành những giai đoạn sau: Đầu tiên mầm ngủ bắt đầu mọc với một đoạn thân không lớn hơn 1cm, sau đó nó lớn dần lên và có màu tím. Lá lúc này nhỏ, mềm, có màu tím và mọc rủ xuống. Tiếp theo thân lại vươn ra thêm một đoạn và trở nên xanh hơn, lá phát triển rộng và dài hơn, có màu xanh. Sau cùng của quá trình này là sự ổn định lá là giai đoạn tầng lá ổn định. Lá mọc ngang, cứng và có màu xanh đậm. Lá cao su thường phát triển thành tầng trên thân khi chưa phân cành hoặc trên cành. Thời gian hình thành 1 tầng lá có thể kéo dài từ 25-50 ngày tuỳ thuộc rất nhiều vào điều kiện khí hậu [27]. Sau 3-4 năm sinh trưởng cao su thường biểu hiện đặc tính rụng lá theo mùa (rụng lá sinh lý), thường nhất là vào dịp đầu năm, từ tháng 1-4 tùy từng nơi. Sau khi rụng lá cao su sẽ cho lá mới và hoa gần như đồng thời [27]. Hoa cao su có màu vàng, nhỏ, không cánh hoa, đài dính thành đĩa năm răng, tiểu nhụy 5-10. Hoa có hương thơm, thuộc loại đơn tính, có hoa đực và hoa cái riêng [13]. Với tỉ lệ 1 hoa cái /60 hoa đực. Hoa đực thường nở trước hoa cái một thời gian nên phần lớn hoa thụ tinh bằng giao phấn chéo thông qua trung gian côn trùng và gió [27]. Nhìn chung khả năng thụ phấn trên cao su xảy ra với tỉ lệ tương đối thấp. Kết quả nghiên cứu tại Lai Khê cho thấy tỉ lệ thụ quả là 8,46% khi có trợ giúp kích thích sinh trưởng [8]. Quả cao su thuộc loại quả nang (vỏ quả khô có nhiều mảnh) có đường kính từ 3-5 cm. Quả có 3 buồng, mỗi buồng có một hạt. Khi chín quả nứt theo chiều dọc bắn tung hạt ra ngoài. Hạt có thể văng xa đến 15 m. Bên ngoài hạt là một lớp vỏ cứng láng. Hạt có dạng gần tròn hay bầu dục với mặt lưng láng và mặt bụng hơi phẳng hơn. Bên trong hạt cấu tạo bởi phôi và nội nhủ. Nội nhủ chiếm phần lớn thể tích của hạt và chứa chủ yếu là chất béo, đạm và nước. Do hạt thường chín sinh lý trước khi rụng khá lâu nên sau khi rụng hạt rất dễ mất sức nảy mầm, do hiện tượng oxy hóa chất béo và mất nước xảy ra nhanh chóng khi chưa gặp điều kiện thuận lợi cho việc nảy mầm. Vì thế mà hạt thường được gieo ngay sau khi thu từ vườn cây để khắc phục hiện tượng trên [27]. 18
  30. 30. Bộ rễ cao su bao gồm các loại: Rễ cọc dài từ 3-5 m, có thể đâm sâu đến 10 m, làm nhiệm vụ giữ cho cây đứng vững, hút nước và chất khoáng; rễ ngang hay rễ hấp thu là loại rễ mọc ngang trên tầng đất mặt từ 0-30 cm, loại rễ này nhiều và mập có khả năng vươn xa từ 6-10 m, có khả năng phân nhánh nhiều, khả năng tái sinh tốt. Rễ ngang thường lan rộng theo chiều rộng của tán; rễ tơ là loại rễ đóng vai trò chủ yếu trong việc hút nước và muối khoáng cho cây ở tầng đất mặt, do rễ ngang chỉ xuất hiện nhiều ở lớp đất mặt nên hầu hết rễ tơ cũng xuất hiện ở lớp đất mặt. [4]. Cao su là cây trồng nhiệt đới điển hình nên thường sinh trưởng bình thường trong khoảng nhiệt độ từ 22-300 C, và khoảng nhiệt độ tối thích là 26-280 C. Cao su thường được trồng trong những vùng có lượng mưa từ 1800-2500 mm/năm. Ẩm độ không khí bình quân thích hợp cho sinh trưởng của cao su là trên 75%, ẩm độ không khí còn thể hiện tương quan thuận với dòng chảy mủ khi khai thác [14]. Cây Cao su được người Pháp đưa vào Việt Nam lần đầu tiên năm 1878. Đặc biệt với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều ở Việt Nam cây Cao su đã thích nghi và phát triển tốt, diện tích cao su ngày càng được mở rộng [34]. Năm 2007 diện tích cao su ở Đông Nam Bộ (339.000 ha), Tây Nguyên (113.000 ha), Trung tâm phía Bắc (41.500 ha) và Duyên Hải miền Trung (6.500 ha) [34]. Bình Dương là một trong những vùng đất đầu tiên trồng cây Cao su ở Việt Nam. Gắn liền với quá trình khai hoang lập đồn điền của tư bản Pháp vào đầu thế kỷ XX, Bình Dương là nơi tập trung nhiều đồn điền cao su ở Đông Nam bộ [36]. 1.4.2.3. Thành phần hóa học Cây Cao su có: - Nhựa mủ chứa 70% nước và 20-30 % cao su. Cao su là một polymer của isopren (polypren), các dãy polyisorenic có cấu trúc cao đối với các nối kép và 19
  31. 31. trọng lượng phân tử có thể vượt quá 1 triệu. - Nhũ tương chứa các chất khoáng (0,50%), các glucid (1-2%), các protid (aminoacid), các men (oxydaza). - Quả chứa một tinh dầu lỏng (20-34% ở hạt, 38-53% ở nhân) màu vàng rơm, mùi dầu lanh, dính. - Hạt chứa một glycosid cyanogenetic độc [33]. 1.4.3. Giá trị kinh tế của cây Cao su Cây Cao su là một loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế rất cao. Đây là loại cây mà sản phẩm của nó chủ yếu được dùng làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp và tiểu thủ công nghiệp. Kinh danh cao su xét về mặt kinh tế có thể nói cho lợi nhuận “kép” từ sản phẩm chính là mủ và gỗ, trong khi thu hoạch sản phẩm từ mủ thì giá trị cây ngày càng tăng trưởng cho nguồn thu từ gỗ khi thanh lý [10]. - Mủ cao su: Sản phẩm chủ yếu của cây cao su là mủ với nhiều loại sản phẩm đa dạng như: Cao su vỏ ruột xe chiếm 70% sản lượng cao su thế giới, kế đó là cao su để làm các ống, băng chuyền, đệm giảm xóc, vật liệu chóng mài mòn, các trang thiết bị hàng không, dụng cụ gia đình, dụng cụ y tế, dụng cụ thể thao…[21]. Cao su tự nhiên có đặc tính khác biệt hơn hẳn cao su nhân tạo về độ giản, độ đàn hồi cao, chống nứt, chống lạnh tốt, ít phát nhiệt khi cọ sát, dễ sơ luyện… Sản phẩm từ mủ cao su thiên nhiên là một trong những nguyên liệu cần thiết của nhiều ngành công nghiệp hiện đại trên thế giới, sếp thứ tư sau dầu mỏ, than đá, sắt thép và đặc biệt là không thể chế biến được cao su nhân tạo có đặc tính như cao su thiên nhiên. Sản phẩm từ mủ cao su thiên nhiên có trên 50 ngàn công dụng khác nhau và rất cần thiết cho các ngành công nghiệp ô tô, máy bay, sản xuất dụng cụ y tế và nhiều ngành công nghiệp phục vụ tiêu dùng khác [10]. 20
  32. 32. - Gỗ cao su: Cây Cao su hết niên hạn khai thác thanh lý, trên một ha trung bình có thể khai thác được 160 m3 gỗ nguyên liệu với giá trị thanh lý khoảng 80 triệu đồng (theo thời giá hiện nay), đủ để tái canh khoảng 2 ha kiến thiết cơ bản. Gỗ cao su đã được chế biến để sản xuất bàn, ghế, tủ, giường,… có giá trị giao động từ 600-900 USD/m3 [10]. Kinh doanh sản xuất cao su thiên nhiên là ngành hàng chiến lược ở nước ta. Hàng năm ngành cao su đem lại trên 1 tỷ USD kim ngạch xuất khẩu cho nền kinh tế, góp phần quan trọng thúc đẩy nhanh tiến trình công nghiệp hóa – hiện đại hóa nông nghiệp, nông thôn ở nước ta trong giai đoạn hiện nay. Về mặt xã hội: Doanh nghiệp nhà nước kinh doanh cao su thiên nhiên đã tạo công ăn việc làm cho hàng chục vạn lao động từ các vùng. Nhờ thuận lợi về giá cả, thị trường, thu nhập của người lao động được nâng cao vào những năm gần đây làm thay đổi bộ mặt kinh tế - văn hóa - xã hội. Nhiều địa phương đã sử dụng cây Cao su như một giải pháp xóa đói giảm nghèo [10]. Cây Cao su được xem là loại cây đa mục đích, vừa có giá trị kinh tế cao, vừa thực hiện nhiệm vụ của những cánh rừng phòng hộ, phòng chống thiên tai, bảo vệ đất, chống xói mòn. 21
  33. 33. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: Tủ vô trùng, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon… Dụng cụ: Pise, kéo, bộ đồ cấy, đĩa petri, đèn cồn,… 2.1.2. Vật liệu Hạt và cành cao su lấy từ các hộ nông dân trồng cao su tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu Chúng tôi tiến hành thu thập, phân tích, tổng hợp những tài liệu có nội dung liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu để có cơ sở lý thuyết, phương pháp nghiên cứu phù hợp phục vụ cho việc hoàn thành khóa luận nghiên cứu của mình. Các nguồn tài liệu khác được sử dụng tham khảo thêm như: Giáo trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Tạp chí Sinh học, Tạp chí Công nghệ Sinh học, luận văn, luận án, bài báo khoa học... 22
  34. 34. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 2.2.2.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Nhiệt độ: 25 ± 20 C Độ ẩm: 75-80 % Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux Môi trường nuôi cấy Các môi trường được sử dụng gồm: Môi trường MS cơ bản, môi trường MS có bổ sung 0,5-1 mg/L BAP và môi trường MS có bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng là BAP, IBA (mg/L) Các thành phần khác: Đường saccharose, aga (gam) Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng KOH 0,1N và NaOH 0,1N) trước khi hấp khử trùng bằng nồi hấp ở 1 atm (1210 C) trong 30 phút. 23
  35. 35. Bảng 2.1. Thành phần môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962) THÀNH PHẦN HÀM LƯỢNG (mg/L) 1. Đa lượng KNO3 1900 KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 FeSO4.7H2O 27,8 Na2-EDTA 37,3 2. Vi lượng H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 3. Vitamin Myo-inositol 100 Thiamne.HCl 0,1 Pyridoxine.HCl 0,5 Nicotinic acid 0,5 4. Amoni acid Glycine 2 24
  36. 36. 2.2.2.2. Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu Tìm ra nồng độ chất khử trùng thích hợp và thời gian tối ưu cho khử trùng mẫu hạt và cành cây Cao su. Hạt (chọn những hạt to, vỏ bóng, cứng) lấy từ vườn cao su được rửa qua bằng nước máy cho hết bụi bẩn bám vào. Dùng dao tách bỏ lớp vỏ cứng. Dùng xà bông rửa hạt nhẹ nhàng. Rửa lại bằng nước máy nhiều lần dưới vòi nước. Để hạt vào trong bình pise vô trùng và rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Chuyển mẫu vào tủ cấy. Trong tủ cấy vô trùng, hạt của cây Cao su được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, mẫu được xử lí sơ bộ bằng cồn 700 trong thời gian 1 phút. Mẫu được rửa lại 5 lần nước cất vô trùng. Tiếp tục thăm dò với các chất khử trùng ở nồng độ và thời khác nhau gồm: Nước javen theo tỉ lệ (1: 3) khử trùng trong thời gian 15 phút. HgCl2 0,1% khử trùng trong 2 khoảng thời gian là 5 phút và 10 phút để nghiên cứu tỉ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm, tỉ lệ phần trăm mẫu vô trùng và tỉ lệ phần trăm mẫu nảy chồi. Tiếp tục rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần. Hạt được cắt đôi hoặc còn nguyên được cấy lên các môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. Cành mang chồi nách và chồi đỉnh (chọn những cành có đường kính khoảng 1 cm, mang nhiều chồi nách, xanh, cứng và khỏe) của cây Cao su được rửa qua bằng nước máy cho hết bụi bẩn bám vào. Dùng xà bông rửa các đoạn cành nhẹ nhàng. Rửa lại bằng nước máy nhiều lần dưới vòi nước. Để các đoạn cành vào trong bình pise vô trùng và rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Chuyển mẫu vào tủ cấy. Trong tủ cấy vô trùng, cành mang chồi của cây Cao su được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, mẫu được xử lí sơ bộ bằng cồn 700 trong thời gian 1 phút. Mẫu được rửa lại 5 lần nước cất vô trùng. Tiếp tục thăm dò với chất khử trùng ở cùng nồng độ với thời gian khác nhau là HgCl2 0,1% khử trùng trong 3 khoảng thời gian là 22 phút, 30 phút và 35 phút để nghiên cứu tỉ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm, tỉ lệ phần trăm mẫu vô trùng và tỉ lệ phần trăm mẫu nảy chồi. Tiếp tục rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần. Cành được cắt để lấy đoạn chồi nách và chồi đỉnh (khoảng 25
  37. 37. 1cm) và được cấy lên các môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. 2.2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro từ chồi đỉnh. Nghiên cứu ảnh hưởng của MS lên khả năng tạo chồi in vitro từ đỉnh chồi. Tìm nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi. Đỉnh chồi (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên, được khử trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar. Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP lên khả năng tạo chồi in vitro từ đỉnh chồi. Đỉnh chồi (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên, được khử trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar và bổ sung BAP với các nồng độ từ 0,5-1 mg/L. Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 26
  38. 38. Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP và IBA lên khả năng tạo chồi in vitro từ đỉnh chồi. Đỉnh chồi (khoảng 1cm) từ các chồi in vitro ở thí nghiệm được khử trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar bổ sung (5 mg/L BAP + 5mg/L IBA). Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro từ chồi nách. Nghiên cứu ảnh hưởng của MS lên khả năng tạo chồi in vitro từ chồi nách. Tìm nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi. Chồi nách (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên được khử trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar. Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP lên khả năng tạo chồi in vitro từ chồi nách. Chồi nách (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên được khử trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar bổ sung BAP với các nồng độ từ 0,5-1 mg/L. 27
  39. 39. Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP và IBA lên khả năng tạo chồi in vitro từ chồi nách. Chồi nách (khoảng 1cm) từ các chồi in vitro ở thí nghiệm được khử trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar bổ sung (5 mg/L BAP + 5mg/L IBA). Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 2.2.3. Phương pháp xử lý thống kê số liệu Số liệu trong các bảng kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsof Excel. 28
  40. 40. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ MỘT SỐ MẪU CÂY CAO SU Các mẫu vật khác nhau được thu nhận từ quả và hạt cao su. Chọn những hạt khô có vỏ cứng phía ngoài còn nguyên vẹn. Một số hạt được gieo nảy mầm tạo nguồn nguyên liệu khử trùng. Hạt được tách vỏ cứng phía ngoài, và ngâm trong nước cất vô trùng 2 giờ đồng hồ làm nguyên liệu. Kết quả thu được sau 3 tuần nuôi cấy như sau. Bảng 3.1. Tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel) Hiệu quả khử trùng của mẫu Mẫu Hạt Phôi Đoạn thân Chồi đỉnh Lá Hạt cắt nguyên từ hạt nảy từ hạt nảy mầm ngang Chất khử trùng mầm mầm HgCl2 0,1% 10% 100% 29% 21% 100% 52% (30 phút) Nước javel 5% 100% 18% 14% 100% 39% (tỉ lệ 1:3) Khả năng khử trùng của HgCl2 0,1%, 30 phút tốt hơn so với nước javel (tỉ lệ 1:3) ở tất các nguồn mẫu nghiên cứu. Đối với các loại mẫu thì hiệu quả khử trùng của phôi, lá mầm là tốt nhất. Đối với hạt còn nguyên thì một số loại nấm phát triển phía trong, chất khử trùng không vào được bên trong nên hiệu quả khử trùng thấp nhất. 29
  41. 41. % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 hạt phôi nguyên HgCl2 0,1%, 30' javel (1:3) Tên mẫu đoạn chồi lá hạt cắt thân đỉnh mầm ngang Biểu đồ 3.1. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel) Kết quả trên có nhiều nét tương đồng với kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Thanh Thúy với đề tài (2006) “Nhân giống in vitro cây Giáng hương (Pterocarpus macrocarpus)”, luận văn tốt nghiệp trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh [28]. Hạt cây Giáng hương mang một số loại nấm nên hiệu quả khử trùng còn hạn chế. Hướng nghiên cứu tiếp theo: Nghiên cứu thời gian khử trùng của các chất khử trùng trên để tạo tỉ lệ mẫu vô trùng cao hơn đồng thời rút ngắn thời gian để giảm tác dụng của chất khử trùng lên mô, tế bào nhằm thu được tỉ lệ mẫu tạo chồi cao nhất. 30
  42. 42. Hình 3.1. Mẫu in vitro từ hạt cây Cao su 3.2. THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ CÀNH CỦA CÂY CAO SU Sau 8 tuần, tỉ lệ (%) mẫu chồi đỉnh và chồi nách được khử trùng với cùng chất khử trùng HgCl2 0,1% ở thời gian 22 phút, 30 phút và 35 phút được trình bày ở Bảng 3.2. Nhìn chung với cùng một chất khử trùng HgCl2 0,1% ở thời gian khác nhau cho hiệu quả khử trùng khác nhau. 31
  43. 43. Bảng 3.2. Tỉ lệ (%) mẫu được vô trùng với chất khử trùng HgCl2 0,1% ở thời gian khác nhau Chồi đỉnh Chồi nách Mẫu % mẫu% vô% mẫu % mẫu% vô% mẫu Chất khử trùng nhiễm trùng chết nhiễm trùng chết HgCl2 0,1% 87,5 12,5 0 41,18 51,47 7,35 (22 phút) HgCl2 0,1% 12,5 62,5 25 61,54 36,92 1,54 (30 phút) HgCl2 0,1% 0 80 20 16 77,33 6,67 (35 phút) Dung dịch HgCl2 0,1% khử trùng ở thời gian 35 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất. Tỉ lệ phần trăm vô trùng cao hơn hẳn so với khử trùng ở 22 phút và 30 phút. Nhưng tỉ lệ phần trăm mẫu chết cao hơn so với khử trùng ở 22 phút và 30 phút. Đối với mẫu khử trùng với HgCl2 0,1% trong thời gian 22 phút thì ngược lại, tỉ lệ phần trăm mẫu vô trùng thấp hơn so với khử trùng ở 30 phút và 35 phút. Mặc khác tỉ lệ phần trăm mẫu nhiễm cao hơn hẵn so với khử trùng ở 30 phút và 35 phút. Phần trăm mẫu chết thì rất thấp. Từ việc phân tích trên cho thấy khi tăng thời gian khử trùng thì kết quả mẫu vô trùng cao nhưng tỉ lệ mẫu chết tăng lên do chất khử trùng đã làm tổn thương phôi, mô của mẫu. Đối với chất khử trùng HgCl2 0,1% khi khử trùng với các khoảng thời gian khác nhau thì thời gian thích hợp nhất là 30 phút cho tỉ lệ vô trùng cao, mẫu chết và mẫu nhiễm ít. 32
  44. 44. Theo Hoàng Thị Thế, Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo (2013) “Quy trình nhân giống in vitro cây Ba kích (Morinda officenalis How)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 11, số 3: 285-292 [26]. Cũng thấy rằng hiệu quả khử trùng có sự khác nhau giữa chồi đỉnh và chồi nách. Tuy nhiên kết quả tốt nhất thu được khi dùng 15 phút Ca(HClO)2 10% và 5 phút HgCl2 0,1%. Khi chúng tôi hạ nồng độ chất khử trùng xuống thấp hơn thì tỉ lệ mẫu nhiễm quá nhiều, khả năng phát sinh chồi không cao. Cây Cao su là loại cây lấy mũ, có nhiều loài nấm, vi khuẩn ký sinh bên ngoài và nội sinh bên trong. Hướng phát triển tiếp theo: Tiếp tục thăm dò một số chất khử trùng khác cho hiệu quả khử trùng, khả năng phát sinh chồi tốt hơn. Hình 3.2. Mẫu chồi đỉnh và chồi nách vô trùng khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% 33
  45. 45. 3.3. THÍ NGHIỆM 3: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI TỪ CÁC MẪU VẬT CỦA CÂY CAO SU Kết quả nghiên cứu khả năng phát sinh chồi từ các mẫu vô trùng của cây Cao su sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP 0-1 mg/L và bổ sung (5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA) được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi từ các mẫu ở các môi trường nuôi cấy Môi trường MS MS + BAP MS + BAP MS + BAP 5 mg/L Mẫu 0,5 mg/L 1 mg/L + IBA 5 mg/L Phôi - - - - Hạt - - - - Đoạn thân từ hạt - - - - nảy mầm Chồi đỉnh từ hạt + - - - nảy mầm Lá mầm - - - - Hạt cắt ngang - - - - Chồi đỉnh cành - - - - non Chồi nách cành - - - + non Chồi đỉnh cành - - - - già Chồi nách cành - - - + già 34
  46. 46. Ghi chú: (-): Không có khả năng phát sinh chồi. (+): Có khả năng phát sinh chồi. Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy khả năng phát sinh chồi ở các mẫu đã vô trùng trong các môi trường là khác nhau tùy loại mẫu và tùy vào môi trường. Hầu hết ở các môi trường mẫu chỉ sống được trong thời gian 1-2 tuần đầu, sau đó chuyển sang màu xám đen và chết. Ở phôi và lá mầm, một số mẫu vẫn như ban đầu sau 8 tuần. Nhưng quá trình tạo chồi vẫn không diễn ra. Để mẫu tạo chồi cần có quá trình cân bằng giữa chất điều hòa sinh trưởng bên ngoài môi trường và nội sinh bên trong mô cây Cao su. Ở môi trường MS, chồi nách sau 1 tuần nuôi cấu có dấu hiệu cảm ứng, mẫu xù xì, phồng rộp và có màu trắng, chồi nách có hiện tượng nhú lên. Nhưng sau 2 tuần mẫu xạm đen và có dấu hiệu ngừng phát triển. Đối với mẫu chồi đỉnh từ hạt nảy mầm lại có khả năng phát sinh chồi ở môi trường MS. 35
  47. 47. Hình 3.3. Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS Quá trình tạo chồi được nhận thấy rõ nhất là môi trường MS bổ sung BAP 5 mg/L + IBA 5 mg/L trên mẫu vật là chồi nách. Sau 1 tuần nuôi cấy bắt đầu có dấu hiệu cảm ứng. Sau 2 tuần nuôi cấy mẫu bắt đầu bung nhiều chồi nhỏ từ mắt cành. Ở chồi đỉnh không có hiện tượng này. 36
  48. 48. Hình 3.4. Sự thích ứng của mẫu với môi trường MS bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA Thêm vào đó, sau 5 tuần nuôi cấy, chồi nách từ môi trường MS tuy không phát sinh chồi nhưng sau khi được chuyển quả môi trường MS bổ sung BAP 5 mg/L + IBA 5 mg/L thì quá trình tạo chồi bắt đầu. 37
  49. 49. Hình 3.5. Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BAP 5 mg/L + IBA 5 mg/L Khả năng tái sinh chồi mới từ chồi nách và chồi đỉnh khác nhau ở các loại cây khác nhau. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có nhiều nét tương đồng với kết quả của Lê Văn Tường Huân và cs. khi nghiên cứu trên đối tượng cây Chanh dây với đề tài cấp bộ “Nhân giống vô tính in vitro cây Chanh dây (Pasiflora edulis Sims) sử dụng đoạn thân mang chồi nách” [9]. Chồi nách cho hệ số nhân chồi và khả năng phát sinh chồi tốt hơn so với chồi đỉnh. 38
  50. 50. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Nồng độ chất khử trùng và thời gian tối ưu cho khử trùng mẫu từ chồi đỉnh và chồi nách cây Cao su là HgCl2 0,1%, 30 phút. Tỉ lệ chồi đỉnh vô trùng là 62,5%, chồi nách vô trùng là 36,92%. - Trong các môi trường bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, môi trường có bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA là môi trường thích hợp cho khả năng phát sinh chồi in vitro. - Mẫu tốt nhất cho quá trình phát sinh chồi mới là chồi nách ở cành non và cành già. 2. KHUYẾN NGHỊ Cây Cao su là loài cây không những mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân tỉnh Bình Dương mà còn là một lợi thế xuất khẩu của Việt Nam. Nghiên cứu nhân giống in vitro sẽ đáp ứng về nguồn cây giống đảm bảo chất lượng phục vụ cho việc trồng trọt quy mô lớn. Do thời gian có hạn chúng tôi chưa thể hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây Cao su, do vậy chúng tôi khuyến nghị tiếp tục có những nghiên cứu sau: - Tiếp tục thăm dò các chất khử trùng cho hiệu quả tốt nhất. - Tiếp tục nghiên cứu tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau cho hệ số nhân chồi tốt nhất. - Nghiên cứu môi trường tạo rễ cho chồi in vitro. - Nghiên cứu các điều kiện tự nhiên thích hợp để chuyển cây con in vitro ra vườn ươm. 39
  51. 51. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Bá (1997), “Thực vật chuyển gene và môi trường”, Sinh học ngày nay, Dịch từ La Recherch. 2. Đái Duy Ban, Lê Thanh Hòa (1996), Công nghệ sinh học đối với vật nuôi và cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994), Những thành tựu khoa học kỹ thuật đưa vào sản xuất, Chuyên đề: Công nghệ gene trong sản xuất vacxin thế hệ mới, Trung tâm thông tin tư liệu, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Nguyễn Khoa Chi (1985), Cây Cao su – Kỹ Thuật trồng – Chăm sóc – Chế biến, Nxb Nông nghiệp. 5. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, Nxb Khoa học và Kỹ thuật. 6. Nguyễn Cảnh Chính (2011), “Nghiên cứu khả năng nhân giống vô tính cây Chè đắng (llex kaushue S.Y Hu) bằng phương pháp giâm cành”, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 7. Nguyễn Hữu Định (2005), “Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Tiêu (Piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cây mô”, Luận văn tốt nghiệp, Ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 8. Trần Thị Thuý Hoa, Lê Mậu Tuý, Phạm Hải Dương, Vũ Văn Trường và Lại Văn Lâm (2001), Tuyển chọn giống cao su khuyến cáo giai đoạn 1999- 2001. Trong kết quả hoạt động khoa học năm 2000. Nxb Nông nghiệp. 9. Lê Văn Tường Huân và cs. (2013), “Nhân giống vô tính in vitro cây Chanh dây (Pasiflora edulis Sims) sử dụng đoạn thân mang chồi nách”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 8(3) . 10. Võ Thị Thu Hồng (2011), “Phương pháp xác định giá trị vườn cao su khi chuẩn bị đi vào tiến hành cổ phần hóa các nông trường cao su trực thuộc 40
  52. 52. tổng công ty cao su Đồng Nai”, Luận văn tốt nghiệp, Ngành quản trị kinh doanh, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn Ngọc Hải (1997), Công nghệ sinh học trong công nghiệp, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 12. Nguyễn Hữu Hổ (2004), Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học mở bán công thành phố Hồ chí minh. 13. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Quyển II, Nxb Trẻ. 14. Nguyễn Thị Huệ (1997), Cao su - Kiến thức tổng quát và kỹ thuật nông nghiệp, Nxb Trẻ. 15. Nguyễn Hoàng Lộc (1993), “Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc nhân nhanh các cây trồng có giá trị kinh tế”, Thông tin Khoa học, Sở Khoa học - Công nghệ và Môi trường Thừa Thiên Huế. 16. Nguyễn Hoàng Lộc (1998), Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. 17. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nxb Y học, Hà Nội. 18. Phan Cự Nhân, Trần Đình Miên (1997), Tìm hiểu công nghệ sinh học hiện đại, Nxb Giáo dục, Hà Nội. 19. Trần Duy Quý (1997), Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 20. Hoàng Thị Sản, Hoàng Thị Bé (2005), Phân loại học thực vật, Bộ giáo dục và đào tạo – dự án đào tạo giáo viên THCS, Nxb Đại học Sư phạm. 21. Văn Mai Sơn (2001), Những thành tựu cơ bản của khoa học công nghệ Cao su ứng dụng ở miền Đông Nam bộ, Nxb Nông nghiệp. 22. Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang (2008), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội (Aloe vera L.) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2008: Tập VI, Số 6: 514-521, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 41
  53. 53. 23. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và Ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 24. Phan Văn Thuần (2008), “Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro cây hoa Păng-Xê (Viola tricolor L.)”, Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Khoa học-Đại học Huế. 25. Đoàn Thị Ái Thuyền, TS. Thái Xuân Du và Đỗ Xuân Giáp (2003), “Bước đầu nghiên cứu nhân giống một số cây hồ tiêu sạch virus (Piper nigrum L.)”, Viện Sinh học nhiệt đới. 26. Hoàng Thị Thế, Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo (2013) “Quy trình nhân giống in vitro cây Ba kích (Morinda officenalis How)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Tập 11, số 3: 285-292. 27. Đinh Xuân Thức (2008), Bài giảng cây công nghiệp dài ngày, Dự án hợp tác Việt Nam – Hà Lan, Trường Đại học Nông Lâm Huế. 28. Đặng Thị Thanh Thúy (2006), “Nhân giống in vitro cây Giáng hương (Pterocarpu macrocarpus)”, luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 29. Nguyễn Văn Uyển và các tác giả (1984), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng, Nxb TP. Hồ Chí Minh. 30. Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 31. Atique Akbar M. and Shyamal Roy K. (2006), “Effects of liquid medium on rooting and acclimation of regenerated microshoots of banana (Musa sapientum L.) cs. Sagar”, Plant Tissue Culture & Biotech, 16(1), pp. 11-18. 32. Rober N. T., Dennis J. G. (2000), Plant Tissue Culture Concept and Laboratory Exercise, CRC Press, New York. 42
  54. 54. TÀI LIỆU INTERNET 33. http://www.lrc-hueni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/thuocdongy/C/ Caosu.htm&key=&char=C 34. http://vi.wikipedia.org/wiki/Cao_su_(cây) 35. http://www.cesti.gov.vn/th-gi-i-d-li-u/phat-tri-n-cay-cao-su-vi-t-nam.html 36. http://khcnbinhduong.gov.vn/?s=AV&CateID=NTlC5Xa3Q0KidJk3391DZ Q%3D%3D&ArtID=SOmCLtSw9y%2FgwJR6nbvY1A%3D%3D 37. http://idoc.vn/tai-lieu/trien-vong-nhan-giong-vo-tinh-cho-cay-ca-phe.html 43

×