Pablo Andres Lara ID: 000133477 3er semestre - Medicina UPB 2010

1. Highly sensitive non-isotopic restrictionendonucleaseFIngerprinting of nucleotidevariability in the gp60 gene withinCryptosporidium species, genotypes andsubgenotypes infective to humans, and itsimplications AradhanaPangasa Department of VeterinaryScience, TheUniversity of Melbourne, Werribee, Australia Pablo Andrés Lara 3er Semestre – Medicina UPB

2. INTRODUCTION Geneticvariationsanalysis leads toidentification of microorganisms’sspecies and subspecies Geneticvariations leads toanadequateclassification of microorganisms Diverseamplification and separationtechniques are used

3. Cryptosporidium Protozoan parasite Apicomplexa No vectors Humanfaeces Mostcommonspecies in humans are C. Parvumand C. hominis

4. gp60 gene Codifies 15 and 40 kDacell-surfaceglycoproteinscalled GP15 and GP40 respectively This genes are involved in invasion of host cellbyCrypstosporidium

5. HumanInfection Known as Cryptosporidiosis Affectsdigestivesystem Usuallyacuteepisodes Causes diarrhea Commoninfection in AIDS patients

6. General Objective Demostratetheefectiveness of using PCR-basedrestrictionanalysisto determine and classifyseveralspecies of Cryptosporidium. Thisclasificationwas done detectingseveralmutations in the gp60 gene found in themicroorganism

7. Métodos y Materiales Obtención de muestras (heces contaminadas humanas y de rumiantes) Tinción (Ziehl – Neelsen) Heces suspendidas en buffer de fosfato (pH=7.4)

8. Métodos y Materiales Muestra llevada a 100°C y luego centrifugada ADN genómico obtenido con kit MoBio

9. Reacción en cadena de la polimerasa Sirve para la amplificacion de material genético Incremento geométrico de una secuencia De poco ADN, se puede obtener mucho En este caso, sirve para multiplicar la secuencia que codifica los gp60, y formar amplicons

10. Reacción en cadena de la Polimerasa Los amplicons luego son sometidos a REF, que son endonucleasas de restricción. Por enzimas de restricción, y luego electroforesis, puedo saber cada cepa tiene cual variación del gen Esto lo logra cortando secuencias especificas de nucleotidos

11. Resultados

12. Resultados

13. Resultados Por electroforesis se encontraron 13 cepas de Hominisy 14 cepas de Parvum Se detectó el cambio de UN par de bases, demostrando alta detección (Una T por G) Hay menos variación de nucleótidos de gp60 en Hominisque en Parvum

14. Discussion

15. Discussion

16. Discussion

17. Conclussions The use of PCR plus REF leads togreatknowledge of differentCryptosporidiumspecies. Theknowledge of differentspeciesmeansbettertreatment and epidemiologicalsurveilance

18. Conclussions REF ishighly detective of even single nucleotidealterations, in bothspecies Otherprotozoansspecies can beclassifiedproperly (taxonomy) usingthistechnique