Sessão Científica Bolsista Camila Lima 2015.2

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TRATAMENTO DE BIOFILMES ORAIS MULTIESPÉCIES COM PEPTÍDEO ANTI-BIOFILME
Wang Z, de la Fuente-Núñez C, Shen Y, Haapasalo M, Hancock REW (2015) Treatment of Oral Multispecies Biofilms by an Anti-Biofilm Peptide. PLoS ONE 10(7): e0132512. doi:10.1371/journal. pone.0132512

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  • O biofilme se caracteriza por bactérias organizadas em comunidade e representam um grande desafio clínico, uma vez que causam mais de 65% de todas as infecções bacterianas em seres humanos, incluindo as doenças orais.
    O biofilme representa um dos sistemas mais complexos da natureza e causam uma variedade de infecções orais, incluindo a cárie, infecções na polpa e a doenças periapicais.
    Consequentemente, a erradicação dos microorganismos responsáveis por essas infecções é um dos principais objetivos do tratamento.
  • Porém, os agentes de desinfecção modernos, para o tratamento dos biofilmes, possuem um número limitado de alvos macrocelulares e: Devido a organização complexa e heterogênea da comunidade microbiana, diferentes expressões gênicas entre células do biofilme e a presença de substâncias poliméricas extracelulares, o biofilme é muito resistente á muitos antibióticos.
    - Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de novos compostos anti-biofilmes e novas abordagens terapêuticas que possam superar esses desafios.
  • Peptídeos anti-biofilme tem sido identificados recentemente como potenciais alternativas de tratamento aos agentes de desinfecção tradicionais, devido a sua habilidade para alvos específcos de bactérias do biofilme, levando a prevenção da formação do biofilme.
    Além disso, peptídeos isolados de diferentes fontes microbianas tem mostrado efeitos anti-biofilme contra as diversas espécies presentes na placa bacteriana, tais como Streptococcus sanguinis e o Enterococcus faecalis.
  • O peptídeo 1018, isolado originalmente como um peptídeo imunomodulador, foi recentemente identificado e caracterizado como um potente composto anti-biofilme de amplo espectro que age desencadeando a perda dos nucleotídeos de sinalização de estresse da guanosina tetra e penta fosfato, que parece ter importante papel no desenvolvimento de múltiplas espécies bacterianas presentes no biofilme.
    O peptídeo 1018 tem mostrado adotar diferentes estruturas a depender do ambiente e pode ser um candidato promissor para o tratamento de infecções orais ou como componentes ativos de produtos odontológicos como: enxaguantes bucais, resina composta e cimentos endodônticos (tratamentos a longo prazo)
  • O método de microdiluição em caldo foi usado para medir a concentração inibitória mínima em caldo de carne e em caldo lysogeny. No estudo de Fuente e Wiegand, a MIC foi definida como a menor concentração do peptídeo em que nenhum crescimento bacteriano foi observado.
  • 2. Para permitir a formação da película de saliva, foram preparados discos de hidroxiapatita revestidos por saliva, que foram obtidos pelo encubamento do disco em 400 ug/ml de saliva infiltrada durante 4 horas.
    3. O biofilme foi coletado da região de primeiros ou segundos molares supeirores de três voluntário adultos saudáveis na faixa de 24 a 45 anos e foi misturado ao caldo BHI por pipetagem.
    4. Os discos HÁ e sHA foram colocados em reservatórios contendo 1,8ml de caldo BHI e 0,2ml de placa bacteriana dispersa.
    Os discos foram encubados na suspensão de BHI sob condições anaeróbias a 37C durante 3 dias.
  • Utilizando o método de formação de biofilme explicado no tópico de Modelo do Biofilme, após 3 dias de formação do biofilme nos discos, o meio de cultura foi substituído por 1,98ml de BHI fresco.
    9 discos de HÁ e sHA cobertos de biofilme foram submetidos a cada um dos grupos de diferentes concentrações do peptídeo 1018 ( 10, 5 e 1 ug/ml).
    3 discos de HÁ e sHA foram submetidos as 3 concentrações do peptídeo no meio de cultura e foram tratados pela primeira vez durante 24h.(nessas condições)
    Outros 3 discos de HÁ e sHA que também passaram pelas 3 concentrações, foram tratados pela 2 vez, recebendo então tratamento de 48h nas mesmas condições
    E outros 3 discos de HÁ e sHA que passaram pelas 3 concentrações, receberam um terceiro tratamento, resultando em 72h de tratamento.

    3. O grupo controle que consistia apenas em água estéril e o caldo BHI foi avaliado nos mesmos intervalos de tempo: 24, 48 e 72h.
  • Doze discos de HÁ e sHA com formação de placa de 3 dias, foram lavadas e preparadas em uma solução salina de fosfato com ph 7,0 e seguida imersos em 1ml de solução do peptídeo na concentração de 10ug/ml, durante 1 ou 3 minutos 1 ou 3 vezes. Todos os discos foram submetidos à todas as condições, aqueles discos que passaram por 3 tratamentos passaram pela solução salina (PBS) durante 1 minuto em cada tratamento.
  • 24 discos de HÁ e sHA com formação de biofilme de 3 dias foram preparadas com solução salina (PBS) durante 1 minuto, e os discos foram divididos em 4 grupos: .... Cada grupo foi imerso em 2ml da solução de cada medicamento por 1 ou 3 minutos.
  • Todos os discos expostos a diferentes tratamentos, foram submetidos a coloração de viabilidade bacteriana e a microscopia confocal de varredura à laser. Os discos passarma por lavagem com soro fisiologico antes da coloração.
    O produto utilizado para verificar a viabilidade bacteriana contém dois componentes. A excitação/emissão máxima foi de 480/500 nm para toda mancha celular (viva) e 490/635 nm para toda mancha de célula morta. A fluorescência de cada célula corada foi analisada com a microscopia confocal de varredura.
    As imagens obtidas foram analisadas e quantificadas através da proporção de célular vivas/mortas, com o Software 7,2
    A proporção de células verde/vermelhas indicam a proporção de células mortas (vermelhas).
  • Além das cepas de E. faecalis e S.mutans utilizadas, placa bacteriana foi coletada também. O E. faecalis se desenvolveu em ágar sangue durante a noite sob condições aeróbias e o S.mutans tb em ágar sangue mas sob condições anaeróbias. E depois, ambos foram misturados aos meios BHI e LB.
    Para que esse experimento fosse consistente com os ensaios anti-biofilme, esse experimento teve a placa bacteriana coletada de voluntários saudáveis se desenvolvendo em discos de HÁ da mesma maneira que foi descrita anteriormente no tópico de modelo do biofilme. Esses discos foram colocados em reservatórios contendo 1,8ml do BHI e cada um deles foi inoculada com 0,2 ml da suspensão bacteriana.
  • O peptídeo 1018 tem mostrado ser um potente inibidor do biofilme por atingir uma ampla variesdade de espécies bacterianas.
    Seguindo o método MIC estabelecido observou-se nesse estudo que na concentração de 80ug/ml não houve inibição signigicantte do crescimento do biofilme.
    Porém, o tratamento com 10ug/ml reduziu bastante e quase completamento o biovolume por mais de 10 vezes após 72h de tratamento.
  • Resultando em ...... De biofilme residual Para os discos de HÁ e ....... Para os discos de sHA em comparação com os controles de água estéril.
  • Foi postulado nesse estudo que o efeeito inibitório do peptídeo, reflete a morte de bactérias presentes no biofilme. Observou-se que a adição do peptídeo no início do desenvolvimento do biofilme na concentração de 10ug/ml levou a 70% de morte celular após um período de 48h.
    Um aumento similar foi observado na concentração 5ug/ml entre o 1 e 2 dias e leve redução no 3 dia.
    Comparado ao grupo controle, todos os grupos tiverem maior porcentagem de morte.
  • Além disso, o peptídeo matou com sucesso biofilmes com formação de 3 dias em ambos os tratamentos e ambas as superfícies.
  • O número de morte do biofilme está relacionado significativamente com o tempo de exposição, a concentração utilizada do peptídeo e a frequência de aplicação do medicamento. Todos os gruposde tratamento mostraram significante redução de bactérias viáveis comparadas ao grupo controle
    (SETA E QUADRADOS VERMELHOS) 10 ug/ml do peptídeo aplicado 3 vezes durante 3 dias matou o maior número de bactérias no biofilme
    A proporção de bactérias mortas aumentou substancialmente com o aumento da concentração do peptídeo em todos os casos.
  • O tratamento de curto prazo foi realizado para avaliar a rapidez com que o peptídeo 1018 age.
    2. FIG G: Sob essas condições, houve redução de biovolume de .... Nos discos HÁ e ..... Nos discos sHA.
    Cada um desses tratamentos de curto prazo levaram a valores de biovolume estatisticamente significativos mais baixos que os controles não tratados.
  • Novamente, reduzido biovolume está relacionao a aumento de morte celular como foi revelado pela microscopia confocal, em que o peptídeo desencadeia a morte celular em até 39% em discos tratados 3 vezes durante 3 minutos.
    A porcentagem de morte celular encontrada nos tratamentos a curto prazo foram menores quando comparadas com os tratamentos de longo prazo.
  • Biofilme de 3 dias de formação foram analisados pela microscopia eletrônica e revelaram: cocos, hastes e filamentos. A morte de microorganismos foi ainda mais confirmada utilzando esse exame.
    PRIMEIRO QUADRADO: Os biofilmes tratados com água estéril demonstraram-se bem organizados, com estruturas de rede com superfícies lisas e praticamente sem células bactérianas mortas.
    SEGUNDO QUADRADO: A lise celular aumentou quando o biofilme foi tratado 2 e 3 vezes com o peptídeo 1018, mostrando finas partículas dentre a estrutura do biofilme.
    Esse exame pôde demonstrar que o peptíde 1018 não sofre agregação sob as condições testadas.
  • Curvas de morte foram realizadas para avaliar se o peptídeo de fato matou bactérias nas placas de biofilme.
    As bactériad foram colhidas de biofilmes formados em discos HÁ e SHA e cultivados em meio BHI e LB.
    SETAS: O peptídeo conduziu a morte celular de maneira tempo-dependente em ambos os meios de cultura
    BOLAS MOSTRANDO A MORTE DO MUTANS E FAECALIS: E houve morte substancial do S. mutan e E. faecalis, sendo o S. mutans mais susceptível a ação do peptídeo com morte de 90-99% no tempo de 30 a 120 mint.
  • O efeito do peptídeo com a clorexeidina foi testado a curto prazo.
    FIG C: O uso de 10 ug/ml do peptídeo reduziu o biovolume do biofilme a 64% enquanto que 2% da clorexidina reduziu 73%.; Embora a combinação do peptídeo + CHX tenha tido atividade um pouco melhor, não houve diferença estatistica significativa na redução do biovolume. Nenhuma diferença foi observada entre as superfíces de HÁ e sHA.
    FIG B E A: O uso combinado da clorexidina + peptídeo 1018 demonstrou efeito adicional mais forte na morte bacteriana. Em cada caso, a proporção morte bacteriana aumentou com o aumento do tempo, não só na combinação, como isoladamente. (BOLINHAS NOS 3MIN)
  • Como já dito anteriormente, os microorganismos do ambiente oral são os agentes etiológicos primários das infecções orais e a placa dental, que compreende uma diversidade de bactérias, apresenta resistência aos agentes antimicrobianos.
    Os agentes de desinfecção tradiociais utilizados atualmente para tratamento dos biofilmes são QUÍMICOS (clorexidina, hipoclorito de sódio) e agem inibindo o desenvolvimento do biofilme e afetando o metabolismo bacteriano.
    O modelo de estudo utilizado nesse artigo mimetiza o modelo de biofilme in vivo: representando as multiespécies presentes no biofilme e a sua interação com a película de saliva.
  • É ISSO
    O presente estudo demonstoru uma potente atividade anti-biofilme do peptídeo na placa bacteriana, em termos de inibição do desenvolvimento e estímulo de morte dos microorganismos.
    É ISSO.
  • De fato, 10 ug/ml do peptídeo suprimiu o cresimento do biofilme em 75%, o que consiste com o estudo de Fuente nunez, em que o amplo espectro e a diversificada atividade antimicrobiana consegue suprimir a placa bacteriana,
  • Porém, as especíes específicas e bactérias residuais após os tratamentos, não foram identificadas.
    Como não houve diferença significativa na porcentagem de célular mortas e biovolumes nos discos HÁ e SHA, o presente estudo concluiu que a película de saliva não degrada o peptídeo 1018. Diferente do estudo de Bucki e colaboradores em 2008 que observou a atividade do peptídeo LL-37 reduzida pela saliva e fluídos corporais.
  • A clorexidina, possui atividade de espectro bacteriano, é o desinfectante oral mais utilizado, porém age de forma não específica e sua concentração de uso está associada á efeitos colaterais, como machamento dos dentes e alterações na percepção do sabor.
    A clorexidina reage com os grupos negativos presentes no envelope celular das bactérias, causando uma perde irreversível de constituintes citoplasmáticos, levando a danos na membrana e inibição enzimática.
    Um estudo de Shen e colaboradores em 2009 e 2010 demonstraram morte do biofilme pela ação da clorexidina de aproximadamente 46% durante três mintuos, uma atividade menor quando comparada ao peptídeo 10 durante o mesmo tempo.
  • 1. É ISSO
    2. Dessa forma essa combinação foi testada nesse estudo, e revelouu que a combinação do peptídeo com a CHX não reduziu o biovolume significativamente quando comparamos a ação isolada de cada um. Porém o tratamento cobinado levou a um aumento substancial na quantidade de células mortas no biofilme
    3. É isso
  • Algumas limitações de estudo foram encontradas: 1. As espécies coletadas dos voluntários podiam crescem bem ou não nos meios de cultivo
    2. O peptídeo 1018 pode não ser ativo contra todas as espécies presentes na flora oral e é provável que seja mais efetico contras espécies específicas, como foi demonstrado nesse estudo a maioir susceptibilidade do S. mutans ao peptídeo.
    3. A contagem de células mortas pode ter sido deficiente pelo fato das bactérias estarem em suspensão e não associadas a superíces podendo dificultar a contagem
    4. Ainda não se sabe se o efeito do peptídeoé preservado a longo prazo ou se ele seria ativo em biofilmes mais velhos associados por exemplo com infecções periodontais e endodonticas.
    Com base nos resultados, podemos acrescentam que a aplicação múltipla do peptídeo 1018 seria necessária para melhores resultados, e por ter ação anti-biofilme num intervalo de 3 minutos, é uma promessa para se tornar componente ativo de pastas de dentes, colutórios e gomas de mascar que controlam infecções orais
  • Em conclusão, o peptídeo 1018 com sua potente atividade antibiofilme, isolada ou em combinação com CHX, e seus efeitos de morte celular em conjunto com a CHX, tornam o peptídeo um candidato promissor para a terapia antimicrobiana contra infecções do biofilme dental.
    E apesar da remoção mecânica diária para controle do crescimento do biofilme ainda ser necessária, a aplicação do peptídeo 1018 utilizado sozinho ou em conjunto contribui eficazmente para o controle do crescimento do biofilme.
  • Sessão Científica Bolsista Camila Lima 2015.2

    1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE EDUCAÇÃO TUTORIAL Camila Lima Silva Wang Z, de la Fuente-Núñez C, Shen Y, Haapasalo M, Hancock REW (2015) Treatment of Oral Multispecies Biofilms by an Anti-Biofilm Peptide. PLoS ONE 10(7): e0132512. doi:10.1371/journal. pone.0132512 Salvador – BA – Brasil Setembro, 2015
    2. 2. Introdução Bactérias organizadas em comunidade. Erradicação dos microorganismos responsáveis pelas infecções como principal objetivo do tratamento. Desafio clínico (Scott et al., 2007; Fuente Núñez et al., 2013) CÁRIE INFECÇÕES NA POLPA DOENÇA PERIAPICAIS (Xiao et al., 2012; Chau et al., 2014) (Haapasalo et al., 2005; Wang et al. 2012) 65% das infecções bacterianas, incluindo doenças orais
    3. 3. Introdução ORGANIZAÇÃO COMPLEXA E HETEROGÊNEA DIFERENTES EXPRESSÕES GÊNICAS SUBSTÂNCIAS POLIMÉRICAS EXTRACELU- LARES RESISTÊNCIA À ANTIBIÓTICOS DESENVOLVIMENTO DE NOVOS COMPOSTOS ANTI-BIOFILME E NOVAS ABORDAGENS (Kim et al., 2014; Hirt e Gorr 2013; Love 2001)
    4. 4. Introdução Peptídeos anti-biofilme como alternativas aos agentes de desinfecção tradicionais. Peptídeos isolados de fontes microbianas com efeitos anti-biofilme contra diferentes espécies presentes na placa bacteriana (S. sanguinis e E. faecalis) Habilidade para alvos específicos das bactérias Prevenção da formação do biofilme (Fuente Núñez et al., 2012 e 2015; Kim et al., 2003; Leung et al., 2005) (Fjell et al., 2012; Wiradharma et al., 2011)
    5. 5. Introdução Peptídeo imunodulador Potente composto anti-biofilme de amplo espectro Desencadeia a perda de nucleotídeos de sinalização de estresse (ppGpp) Adota diferentes estruturas a depender do ambiente Candidato promissor para tratamento de infecções orais ou componente ativo em produtos odontológicos PEPTÍDEO 1018 ppGpp Importante no desenvolvimento de múltiplas espécies presentes no biofilme. (Fuente Núñez et al., 2014) (Zhang et al., 2014; Wieczorek et al., 2010; Hosoya et al., 2010)
    6. 6. Objetivo Testar o(s) efeito(s) do peptídeo anti-biofilme 1018 contra a placa bacteriana oral se formando na presença e ausência dos constituintes da saliva, para avaliar se o peptídeo é adequado para o uso na Odontologia, e a sua atividade em combinação com a Clorexidina.
    7. 7. Materiais e Métodos O peptídeo 1018 foi sintetizado pelo GenScript, utilizando a fase sólida do 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) Estocado e armazenado de forma estéril SÍNTESE DO PEPTÍDEO
    8. 8. Materiais e Métodos Método de microdiluição em caldo para medir a concentração inibitória miníma (MIC) em caldo de carne (BHI) e caldo lysogeny (LB) Três amostras de placa bacteriana foram cultivadas nos meios BHI e LB, e o peptídeo 1018 adicionado em concentrações crescentes (0, 10, 20, 40 e 80µg/ml) Placas incubadas à 37°C durante 24 horas CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MINÍMA MIC menor concentração do peptídeo em que nenhum crescimento foi observado (Fuente Núñez et al., 2012; Wiegand et al., 2008)
    9. 9. Materiais e Métodos Discos de hidroxiapatita (HA) estéril utilizados como substrato para o biofilme Discos de hidroxiapatita revestidos por saliva (sHA) foram preparados para permitir a formação da película de saliva Placa supragengival coletada da região de primeiros ou segundos molares superiores de três voluntários adultos saudáveis (24-45 anos) caldo BHI Discos HA e sHA 1,8 ml caldo BHI 0,2 ml placa MODELO DE BIOFILME Condições anaeróbias a 37°C por 3 dias
    10. 10. Materiais e Métodos Três diferentes concentrações do peptídeo 1018 (10µg/ml, 5µg/ml e 1µg/ml) foram adicionadas as placas no início do desenvolvimento do biofilme Grupo controle: água estéril adicionada ao meio de cultura Três discos HA e sHA foram submetidos a cada um dos grupos TESTE DE INIBIÇÃO DO BIOFILME Condições anaeróbias a 37°C por 3 dias
    11. 11. Materiais e Métodos Após 3 dias de formação do biofilme, o meio de cultura foi substituído por 1,98ml de BHI fresco 9 discos de HA e sHA cobertos de biofilme foram submetidos a cada um dos grupos de diferentes concentrações do peptídeo (10, 5 e 1µg/ml) EFEITO ANTI-BIOFILME A LONGO PRAZO EM BIOFILMES PRÉ-FORMADOS 3 HA e sHA INCUBAÇÃO ANAERÓBICA 37°C 24h 3 HA e sHA INCUBAÇÃO ANAERÓBICA 37°C 72h 3 HA e sHA INCUBAÇÃO ANAERÓBICA 37°C 48h O grupo controle (água estéril + BHI) foi avaliado em cada ponto de tempo (24, 48 e 72h)
    12. 12. Materiais e Métodos Doze discos HA e sHA com formação de placa de 3 dias, lavadas e preparadas com soluçao tampão pH 7,0 (PBS) e em seguida imersos em 1ml do peptídeo 1018 (10µg/ml) - 1 a 3 minutos -1 ou 3 vezes EFEITO ANTI-BIOFILME A CURTO PRAZO EM BIOFILMES PRÉ-FORMADOS
    13. 13. Materiais e Métodos 24 discos HA e sHA com formação de biofilme de 3 dias preparadas com a solução PBS I. ÁGUA ESTÉRIL II. DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA 2% III. 10µg/ml PEPTÍDEO 1018 IV. DIGLUCONATO DE CLOXERIDINA 2% + µg/ml PEPTÍDEO 1018 2ml da solução por 1 ou 3 minutos PEPTÍDEO 1018 COMBINADO Á CLOREXIDINA
    14. 14. Materiais e Métodos Coloração de viabilidade bacteriana e microscopia confocal de varredura a laser Dois componentes de corante: o SYTO 9 : 480/500 nm CÉLULAS VIVAS o IODETO DE PROPÍDO : 490/635 NM CÉLULAS MORTAS Imagens confocais analisadas e quantificadas (proporção vivas/mortas) Software Imaris 7.2 Proporção florescência verde/vermelha EXAME MICROSCÓPICO COM LASER CONFOCAL DAS AMOSTRAS
    15. 15. Materiais e Métodos Três placas adicionais de biofilme tratadas com 10µg/ml do peptídeo (24, 48 e 72h) e examinadas pela microscopia eletrônica Amostras submetidas á concentrações de etanol (50%, 70%, 80% e 100%) para desidratação. EXAME DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
    16. 16. Materiais e Métodos CURVAS DE MORTE DO E. faecalis, S. mutans E PLACA BACTERIANA Enterococcus faecalis ÁGAR SANGUE AERÓBIO Streptococcus mutans ÁGAR SANGUE ANAERÓBIO MEIOS BHI E LB Placa bacteriana coletadas de voluntário se desenvolvendo em discos HA 1,8 ml BHI 0,2 ml suspensão bacteriana (E. faecalis e S.mutans)
    17. 17. Materiais e Métodos Software SPSS 16.0 para Windows Padrão desvio das proporções de volume de células mortas e vivas calculados Homogeneidade da variância determinada por teste Levene Univariate ANOVA para significância dos resultados (nível 5%) ANÁLISE ESTATÍSTICA
    18. 18. Resultados Potente inibidor de biofilme por atingir ampla variedade de espécies bacterianas Seguindo o MIC (≥ 80µg/ml), não inibiu o crescimento bacteriano substancialmente O tratamento com 10µg/ml reduziu significantivamente e quase completamente o biovolume 10x após 72h ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018 (Wieczorek et al., 2010)
    19. 19. Resultados 10µg/ml ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018 DISCOS HÁ 9% 24h 7% 48h 8% 72h DISCOS sHA 8% 24h 8% 48h 6% 72h
    20. 20. Resultados Efeito inibitório do peptídeo reflete a morte de bactérias presentes no biofilme 10µg/ml 70% morte celular após 48h de incubação Aumento similar foi observado na concentração de 5µg/ml entre o 1º e 2º dia ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018 Maior número de mortes em todos os grupos comparado ao grupo controle (água estéril)
    21. 21. Resultados Sob todas as condições testadadas, 5µg/ml reduziu à 50% o biovolume e 1µg/ml à 54%, comparado ao grupo controle ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
    22. 22. Resultados Ativo contra biofilmes pré-formados em ambos os tratamentos (curto e longo prazo) e em ambas as superfícies (HA e sHA) ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
    23. 23. Resultados ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018 MORTE BACTERIANA TEMPO DE EXPOSIÇÃO CONCENTRAÇÃO DO PEPTÍDEO FREQUÊNCIA DE APLICAÇÃO
    24. 24. Resultados Tratamento de curto prazo para avaliar a rapidez com que o peptídeo 1018 age ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018 44% 61% 64% 42% VALORES DE BIOVOLUME ESTATISTICAMENTE SIGNFICATIVOS MAIS BAIXOS QUE OS CONTROLES NÃO TRATADOS
    25. 25. Resultados Reduzido biovolume relacionado a aumento de morte celular (microscopia confocal): 39% (3 tratamentos de 3 minutos em discos HA) Porcentagem de morte celular menor comparada ao tratamento de longo prazo ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
    26. 26. Resultados A microscopia eletrônica de biofilmes formados durante 3 dias revelou cocos, hastes e filamentos ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
    27. 27. Resultados Curvas de morte num período de 120 minutos para avaliar a atividade de morte celular do peptídeo O peptídeo conduziu a morte celular de forma tempo-dependente em ambos os meios de cultura (BHI E LB) Morte substancial do S. mutans e E. faecalis ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
    28. 28. Resultados O efeito do peptídeo + clorexidina foi testado a curto prazo COMBINAÇÃO DO PEPTÍDEO 1018 E CLOREXIDINA ⇩73% ⇩ 64% * *
    29. 29. Discussão Agentes de desinfecção tradicionais QUÍMICOS inibem o desenvolvimento do biofilme e afetam o metabolismo bacteriano O modelo in vitro utilizado no presente estudo mimetiza o modelo de biofilme in vivo: - Multiespécies - Interação com a película de saliva (Baehni e Takeuchi, 2003) (Shen et al., 2009 e 2011)
    30. 30. Discussão Recentemente desenvolvidos e identificados, peptídeos anti-biofilme sintéticos, oferecem nova abordagem para controle do biofilme Potente atividade anti-biofilme - Inibição do desenvolvimento - Estimula morte de microorganismos Amplo espectro atua através da ligação e degradação de nucleotídeos envolvidos na formação e manutenção do biofilme (Fuente Núñez et al., 2012; Leung et al., 2005; Tao et al., 2011) (Fuente Núñez et al., 2014)
    31. 31. Discussão No presente estudo, o peptídeo 1018 desencadeou a morte celular em biofilmes formados durante 3 dias com concentrações abaixo da MIC (80µg/ml) 10µg/ml peptídeo 1018 suprimiu crescimento em 75% AMPLO ESPECTRO E ATIVIDADE DIVERSIFICADA vs. PLACA BACTERIANA (Fuente Núñez et al., 2014; Baehni e Takeuchi 2003)
    32. 32. Espécies específicas e bactérias residuais após tratamento, não foram identificadas. Não houve diferença significativa na porcentagem de volume de células mortas e biovolume nos discos HA e sHA PELÍCULA DE SALIVA NÃO DEGRADA O PEPTÍDEO 1018 PEPTÍDEO LL-37 COM ATIVIDADE REDUZIDA PELA SALIVA E FLUÍDOS CORPORAIS Discussão (Bucki et al., 2008)
    33. 33. Discussão Com relação a aplicabilidade, o peptídeo 1018 tem sido demonstrado atóxico na concentração de 200µg/ml para fibroblastos e 375µg/ml para células vermelhas do sangue (Steinstraesser et al., 2012; Wieczorek et al., 2010)
    34. 34. Discussão Atividade de espectro bacteriano Desinfectante oral mais utilizado Ação não específica Concentração associada à efeitos colaterais Shen et al., 2009 e 2010 demonstrou a morte de 46% do biofilme pela ação da clorexidina à 2% durante 3 minutos. Atividade menor comparada ao peptídeo 1018 Clorexidina DANOS À MEMBRANA E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA PERDA IRREVERSÍVEL DE CONSTITUINTES CITOPLASMÁTICOS REAGE COM GRUPOS NEGATIVOS NO ENVELOPE CELULAR (Shen et al., 2011; Athanassiadis et al., 2007) (Brown et al., 1986)
    35. 35. Discussão Kim et al., 2003, relatou efeito inibitório sinérgico de peptídeos catiônios e CHX no crescimento de Streptococcus orais usando o teste MIC No estudo, a combinação do peptídeo 1018 + CHX não reduziu o biovolume ao comparar a ação isolada de cada componente, porém o tratamento combinado levou a um aumento significativo na quantidade de célular mortas no biofilme A saliva não interfere na ação isolada ou combinada da CHX e peptídeo 1018
    36. 36. Discussão Limitações do estudo: Espécies coletadas dos voluntários Peptídeo 1018 mais efetivo contra espécies específicas (S. mutans) Contagem de células mortas (bactérias em suspensão) Efeito inibitório do peptídeo preservado a longo prazo? Aplicação múltipla para melhores resultados Pasta de dentes, colutório, goma de mascar Atividade anti-biofilme dentro de 3 minutos
    37. 37. POTENTE ATIVIDADE ANTI- BIOFILME EFEITO DE MORTE CELULAR COM A CHX TERAPIA ANTIMICROBIANA CONTRA INFECÇÕES Discussão PEPTÍDEO 1018 Remoção mecânica diária para controle do crescimento ainda é necessária, porém a aplicação do peptídeo 1018 pode contribuir para controle eficaz do biofilme.
    38. 38. Referências

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