2. YENİ ENZİMLERİN
KEŞFİNDE
METAGENOMİK
YAKLAŞIMLAR

3.  Mikrobiyal komüniteler bakteri ve arke türlerini fazlaca
bulundurur, bunların büyük bir çoğunun daha önceden kültürü
veya resmi olarak tür tayin analizi yapılmamıştır. Metagenomik
–aynı zamanda çevresel genomik de denilir– daha önce
tanımlanmamış organizmaların çevreden, direkt
olarak habitatlarından DNA ya da RNA’larını izole
ederek bu organizmaların tanımlanmasını
amaçlayan bir disiplindir. Nasıl ki bir
organizmanın total gen içeriğine
genom diyor isek, organizmaların içinde
bulundukları çevredeki toplam gen içeriklerine de
metagenom adı verilir. DNA, RNA veya protein
analiz yöntemleriyle mikrobiyal komünitedeki canlıların
genlerindeki, gen ekspresyonlarının yapıldığı bölgeler
araştırılabilir.
Metagenomik Nedir?

5.  Bir çok ortam geniş metagenom sekanslama projeleriyle
takip edilmektedir. Ekstrem ortamlarda, –halofilik, asidik gibi–
veya toprak ve aquatik ortamlar gibi bir çok alanda
metagenomik çalışmalar yürütülmektedir. Metagenomikte
ilginç olan bir bulgu da şudur ki; çevredeki çokça genin
hücresel organizmalardan ziyade virüslere ait olmasıdır.
Metagenomik

6.  İnsan vücudu 10 trilyon hücre ihtiva etmektedir ancak her birimiz
vücut hücrelerimizin 10 katı kadar daha fazla prokaryotik hücre
barındırmaktayız. Böyle düşünürsek vücudumuzdaki hücrelerin sadece %10’u
bize ait olmaktadır. Bu da bizim diğer genomumuzu oluşturmaktadır –insan
mikrobiyomu– çünkü birçok hastalığın nedeninin bu barındırdığımız prokaryotik
hücreler kaynaklı olabileceği düşünülmektedir ve bunun üstüne çok ciddi
çalışmalar, bulgular bulunmaktadır. Birçok prokaryotik bağırsaklarımızda
yaşamaktadır ve bunlar iki büyük bakteri grubuna aittirler Bacteroidetes ve
Firmicutes. Buradaki merak uyandıran buluş şu olmuştur ki; insanlar ve fareler
üzerinde yapılan deneyler sonucunda bağırsak mikrobiyomunun obeziteyle
ilişkili olduğu belirlenmiştir. Firmicutes bakterilerinin yüksek oranda olması
insanı veya fareyi şişmanlatmaktadır. Bunu nasıl olduğu hakkında önerilen
mekanizma şu yöndedir; Firmicutes bakterilerinin dietary liflerini –selüloz içeren
besinler– kısa zincirli yağ asitlerine çevirdiği ve böylece insanın veya farenin bu
besinleri absorblayacağı hale dönüşmesinden kaynaklanmaktadır. Yani kişi aynı
ölçüde beslense dahi daha çok şişmanlayacaktır.
Metagenomik

7.  Gen madenciliği potansiyel olarak faydalı olabilecek yeni
genlerin o genleri taşıyan organizmaların kültürünü yapmaksızın
organizmalardan toplanmasıdır; ki bu da metagenomiğin temelini
oluşturmaktadır. Bu proseste DNA ya da RNA direkt olarak
çevresel ortamdan toplanır ve metagenomik kütüphane
oluşturmak üzere uygun bir vektöre klonlanır. Nükleik asitler
yaşayan organizmadan veya ölü hücrelerden toplanabilir ancak
toplanacak olan nükleik asitin degrade olmadan önce alınmasına
özen gösterilmelidir, aksi takdirde genomik değerlendirmelerin ve
nükleik asit sekanslamaların yapılması mümkün değildir. Eğer
çevresel habitatdaki canlılardan RNA izole edildiyse bu RNA
revers transkriptaz enzimiyle önce DNA’ya dönüştürülmelidir,
ardından vektöre klonlanıp metagenomik kütüphanelere
eklenmelidir.
Gen Madenciliği

8.  Metagenomik aynı zamanda belirli kirleticileri
degrade eden yeni enzimlerin ve yeni antibiyotiklerin
keşfinde kullanılmaktadır. Şimdiye kadar birçok lipaz,
kitinaz, esteraz ve diğer degradatif enzimler ve bu
enzimlere ait yeni substratlar bu yöntemle
bulunmuştur. Bazı enzimler sıklıkla endüstriyel
uygulamalarda kullanılmaktadır, bu enzimler bazı
endüstriyel ortamlara –yüksek sıcaklık, yüksek veya
düşük pH– uyum sağlaması açısından kıymetlidir.
Gen Madenciliği

9. Farzedelim ki belirli bir kirleticiyi yüksek sıcaklıkta
degrade etmesini istediğimiz bir enzime ihtiyacımız
var. Burada öncelikle ilk adım hedef kirleticiyle kirletilmiş
sıcak bir ortam bulmak olacaktır ve varsayalım ki bu
kirleticiyi temizleyecek olan mikroorganizmalar da bu sıcak
habitatta bulunmaktadır. Bu hipotezimizde yapmamız
gereken bu sıcak ortamdaki mikroorganizmalardan DNA
izole etmek ve bunları bakterilere klonlamak olacaktır ve
daha sonra klon genleri bulunduran konak bakterinin hedef
kirletici üzerindeki etkisi gözlemlenmelidir.
Gen Madenciliği

10.  Başka bir örnek verelim; Varsayalım ki ticari uygulamalarda
kullanılmak üzere termostabil –yüksek sıcaklıklarda iş
görebilen– lipaz enzimine ihtiyacımız var. Lipaz trigliseritleri
hidrolize eden bir enzimdir ve bu nedenle kozmetikde ve
farmasötik uygulamalarda kullanılmaktadır. Ancak endüstriyel
üretimlerde kullanılan enzimlerin yüksek sıcaklıklarda etki
göstermesi beklenir. Bu nedenle termofil
mikroorganizmalardan izole DNA örnekleriyle moleküler
biyologlar bir metagenomik kütüphane oluşturdular. Bu
kütüphanedeki sıcaklılığa dayanıklılık geni E.coli ’lere transfer
edildi ve rekombinant suşlar istenilen ortamda ve sıcaklıkla
lipaz aktivitesini ifade ettiler. Bu izolatların ürettiği lipaz
incelendiğinde 90°C ve üzerinde bile enzim aktivitesini
gerçekleştirdiği görülmüştür.
Gen Madenciliği

11.  Mikrobiyal komünitelerin moleküler çalışmalarına en
kapsamlı olarak yaklaşan metagenomik belirli bir çevredeki
bütün mikrobiyal genomları karakterize eder. Metagenomikten
önce mikrobiyal komünite analizleri tipik olarak belli bir ortamdaki
tek bir genin çeşitliliğine dayalı olmaktaydı. Ancak çevresel
genomikte herhangibir yerdeki mikrobiyal komünitenin bütün
genleri model olarak örneklenebilir, bu da komünitenin fonksiyonu
ve yapısı hakkında tek gen analizlerine göre daha ayrıntılı bir
araştırma yapma olanağı sağlar. Bunu bir örnekle açıklayacak
olursak. Varsayalım ki belli bir ortamda nitrojen fiksasyonu prosesinde
görevli enzim toplanmak isteniyor, buradaki limitasyon şudur;
ortamımız NH4
+ (amonyum) , NO3
- (nitrat) ve fikse edilmiş N2
(nitrojenin) diğer türlüleri ile sınırlı olmasıdır ki nitrojen fikse edebilen
bakterileri seçebilelim. Oysa çevresel genomikte komünitedeki bütün
DNA’nın sekanslanma imkanı vardır.
Metagenomik

12. Toplam komüniteden örneğin 16s rRNA’yı
kodlayan gen toplanır, sekanslanır ve
filogenetik ağaç yapılmak üzere işlenir.
Sonuçlar iki türlü olur. Birincisi, komünitedeki
pek çok üyenin filogenetiği çıkartılır. İkincisi;
yeni filotipler belirlenir.
Tek Gen Odaklı İncelemeler:

13. Komünitenin toplam DNA’sı alınır ve ileri
teknoloji sekanslama teknikleriyle –shotgun
sekanslama gibi– gen sekansları yapılır ve
sekanslanan DNA fragmentleri tekrar bir
araya getirilir sonuçlar incelenir. Birincisi;
bütün gen katogorisi tanımlanmış olur.
İkincisi; Yeni genler keşfedilir. Üçüncüsü;
Genlerin filotiplerle bağlantısı tespit edilir.
Çevresel Genomik –Metagenomik –

14.  Metagenomik ile bilinen organizmalardaki yeni genleri ve yeni
organizmalardaki bilinen genleri tespit edebiliriz. DNA’nın proteinleri
kodlayan bilgiyi içerdiğini biliyoruz. Ancak bazı proteinler homolog olarak ifade
ediliyor ve bilinen başka hiçbir türde bu aynı proteine rastlanmıyor bu tip
genlere ‘’ORFan’’ genler ‘’öksüz genler’’ denmektedir. ORFan isminin verilmesi
Open Reading Frame’e yani proteinin oluşmaya başlaması için gerekli triplet
–ATG– ‘yi içeren DNA ya da RNA zincirine gönderme olarak verilmiştir. Sargasso
Denizi’nde yapılan çalışmalarla bir canlıda metabolizma ile ilgili gen kodlayan
bölgelerin daha önce metabolizma ile ilgisi bilinmeyen başka canlıların
genomunda da bulunduğu görülmüş. Örnek verecek olursak; amonyak
monooksigenaz enzimini kodyalan genler amonyak okside eden
bakteriler için temel enzimdir, ancak bu DNA fragmentleri aynı
zamanda arke genlerini de içerisinde bulundurduğu görülmüş ve bu da
amonyak okside eden arkelerin olabileceği görüşünün öne atılmasını
sağlamıştır. Bu öneri mikrobiyologların nitrifikasyon yapan (bir tür
arkenin –Nitrosopumilus maritimus– NH3  NO2
− deniz ortamından
izole edilmesiyle daha da güç kazanmıştır.
Metagenomik

15.  Bir başka örnek verecek olursak; Yine Sargasso Denizi’nde
Yapılan çalışmalarla proteobacterilerin biyoluminesans
üretmekle ilgili proteorhodopsin proteinini kodlayan gen
bölgesinin filojenik olarak bakterilele bağlantılı olan başka
türlerde de olduğu gözlenmiştir. Proteorhodopsin daha
önceleri Gammaproteobakterilerden kültürü yapılmadan
okyanus suyundan DNA fragmentleri toplanarak analiz
edilmişti, ilerleyen metagenomik çalışmalar göstermiştir ki;
proteorhodopsin deniz arkelerinde ve tatlı su bakterilerinde
geniş bir şekilde ifade edilmektedir. Bu çalışmalar ışığın
fizyolojide ve ekolojideki önemini işaret etmiş olmuştur.
Metagenomik

16.  Son yıllarda dünya genelinde bakterilerin direnç genleri
kazanımlarıyla ilgili olarak enfeksiyonel hastalıklarda bir artış
görülmektedir. Dirençli patojenler ileri derecede ölümcül
olabilmekte ve sağlık endüstrisine çok pahalıya mâl
olabilmektedirler. Bu çalışmada temel amaç, kültüre alınmış
mikroorganizmaların antibiyotik rezistans genlerine ve
antimikrobiyal bileşiklere odaklanmaktır. Metagenomik
yaklaşımlar ile bu antibiyotik rezistans genlerini ve
antimikrobiyal bileşiklerin olası rezervlerini, mikroorganizmalar
kültüre alınmadan mikrobiyal komünitenin bulunduğu
habitatdan direkt olarak inceleyebiliriz.
Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal
Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış

17.  Son zamanlarda dünya genelinde kolay kontrol edilemeyen sağlık
problemlerinin başında, enfeksiyonların tedavisinde olası engel antibiyotik
direnci süregelmektedir. Antibiyotik dirençli patojenlerin yüksek sağlık
masraflarına ve yüksek ölüm oranlarına sahip olduğunu söylemiştik. Yakın bir
zamana kadar antibiyotikler sadece insan sağlığında iyileştirici ajan
olarak kullanılmıştı, ancak günümüzde artık hemen hemen
endüstriyel her yerde –agrikültürde, yemek endüstrisinde, veteriner
uygulamalarında... – kapsamlı ve yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.
Tabiki bu geniş kullanımın doğaya ve insan sağlığına etkisi büyük
olmuştur. Çünkü antibiyotiklerin bu derecede tedbirsiz kullanımı ile
bakterilerde antibiyotik direnç genleri oluşmuştur ve mikribiyal
enfeksiyonlara karşı tedavi yöntemlerinin mücadelesinde daha fazla
efor sarfetme gereksinimi doğmuş hem de bilinen ve daha önce
kullanılan antibiyotiklere karşı bakterilerde direnç yolakları
gelişmiştir.
Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal
Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış

18.  Bu koşullar dikkate alınarak son 10 yılda metagenomik
yaklaşımlar farklı çevrelerdeki antibiyotik direnç genlerine ve
antimikrobiyal bileşiklerinin iç dünyasına bakmamıza imkân
sağlamıştır. Metagenomik analizleri aslında moleküler metodlarla
aynıdır. Ekstraksiyon, amplifikasyon, sekanslama ve çevreden alınan
nükleik asitlerin analizi olarak 4 kısımda tamamlanır. Metagenomik
yaklaşımlardan önce kültüre alınmış mikroorganizmalar
antimikrobiyal aktiviteyi ve antibiyotik rezistans genlerini izole etmede
ve klonlamada önemli kaynak olmuşlardır ancak araştırmacılar
mikroorganizmaları standart laboratuvar kültürlerinde büyütmeye
çalıştıklarında çokça mikrobiyal çeşitlilik de kaybolmuştur. Bu sebeple
metagenomik yaklaşımlar direnç genlerini ve antimikrobiyal bileşikleri
mikroorganizmaları kültüre almadan belirlemek için güvenilir bir
yaklaşımdır.
Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal
Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış

19.  Bir örnek verecek olursak; Alaska topraklarında β-lactam
antibiyotiğine dirençli ortamlar olup olmadığı araştırılmış. Bu analiz
önemlidir çünkü örnek alınan toprağın daha önceden antibiyotik
maddelerine ve insan kaynaklı kirliliğe maruz kalmadığı görülmüş.
Bu araştırma sonucunda, Alaska topraklarındaki β-lactamaz
karakterizasyonun klinik ve laboratuvar ortamlarındaki β-
lactamaz’dan daha farklı olduğuna ve daha çok atasal
homologlarına ait olduğuna kânaat getirilmiştir. Ayrıca Alaska
toprakları metagenomik kütüphanesinden alınan bu β-
lactamaz’ın filogenetik analizi sonucu bunun klinik ortamlardaki
β-lactamaz sekansından daha farklı olduğu görülmüştür ve
farklı sekansta olmasına karşın E.coli suşlarına β-lactamaz’a
karşı yine de direnç kazandırabilmiştir.
Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal
Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış