Eletroforese

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BIOFÍSICA - 2º ANO - 1º SEMESTRE - ELETROFORESE - FACULDADES INTEGRADAS DE BAURU - FIB

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  • – Prêmio Nobel: 1948 – Atualmente é utilizadas em vários setores: químicos, bioquímicos, industrias farmacêuticas, ciência forense, etc.
  • É uma técnica de separação baseada na migração das moléculas carregadas, numa solução, em função de aplicação de um campo elétrico. É a migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico.
  • NA IMAGEM : Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, tampão alcalino (pH: 8.5). (1) Hb AS; (2) Hb SF: resultado típico da Hb S/tal. b 0 .
  • Aplicações   Os principais campos de aplicação da eletroforese são pesquisas na área da biologia e bioquímica, tendo em vista estudos de proteínas, farmacologia, medicina forense, exames clínicos, e principalmente na parte da biologia molecular. Tem se visto a importância de escolher a técnica certa de eletroforese, pois isto pode interferir no resultado final da pesquisa. O que torna a eletroforese aplicável a todos os íons, desde inorgânicos até moléculas mais complexas, incluindo também partículas macroscópicas portadoras de carga elétrica, é o fato de suas características não sofrerem alterações. Entre os usos mais comuns estão o estudo clinico do plasma e líquido de mamíferos, resolução de misturas complexas de proteínas, ácidos nucléicos, aminoácidos, identificação de componentes, determinação a pureza e homogeneidade molecular, genética molecular e inclusive determinação da massa molecular de macromoléculas.
  • IMAGEM : CUBA DE REALIZAR ELETROFORESE
  • O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo positivo Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
  • Eletroforese

    1. 1. 1
    2. 2. A eletroforese de proteínasfoi realizada pela primeiravez em 1937 .– “Eletroforese livre”: soro sanguíneoem cinco frações protéicas principais; Arne Tiselius 2
    3. 3. DefiniçãoÉ uma técnica laboratorial de separação de frações deproteínas, enzimas, DNA e RNA. Baseada na migração das moléculas carregadas, numa solução, em função de aplicação de um campo elétrico. 3
    4. 4. Todas as partículas da mesmaespécie que possuem a mesma carga e se repelem mutuamente, evitandoconglomerações, formação de complexos e reações entre elas.
    5. 5. ELETROFORESEConsiste na separação dos componentes de um sistema pela aplicação de um campo elétrico
    6. 6. APLICAÇÃO É aplicável á:Todos os íons, desde inorgânicos até moléculas mais complexas, incluindo também partículas macroscópicas portadoras de carga elétrica.
    7. 7. APLICAÇÃO Pesquisas na área da biologia e bioquímica, tendo em vista estudos de:1. Proteínas,2. Farmacologia,3. Medicina forense,4. Exames clínicos,5. Biologia molecular
    8. 8. Entre os usos mais comuns estão...1. Estudo clinico do plasma e líquido de mamíferos2. Resolução de misturas complexas de:• proteínas,• ácidos nucléicos,• aminoácidos,
    9. 9. 3. Identificação de componentes.4. Determinação da:• pureza e homogeneidade molecular• genética molecular• determinação da massa molecular de macromoléculas.
    10. 10. Consiste na migração e separação de partículasem uma matriz (suporte), submetidas a umadiferença de potencial elétrico; Pólo (+) Pólo (-) OrigemA migração das partículas depende do seutamanho e carga. 10
    11. 11. Emprega-se uma corrente contínua para separar os componentedo sangue, urina, líquor e outras soluções, aplicando uma cargaelétrica aos mesmos. 11
    12. 12. Fatores que condicionam a migração Eletroforética A velocidade de arrasto das partículas sofre a influência de um grande número de variáveis:1. pH do meio2. pI (Ponto isoelétrico) ou pK das substancias3. eletrólitos usados4. interações com a fase fixa5. temperatura6. evaporação7. movimentos hídricos no suporte
    13. 13. A manipulação destes fatores torna a eletroforese um método muito útil.Pela simples variação do pH, é possível:1. separar uma proteína de varias outras2. separar um grupo de proteínas associadas em seus componentes3. determinar o ponto isoelétrico de proteínas4. estudar associação antígeno-anticorpo
    14. 14. Por tanto...Quanto maior a diferença pH>pI, ou pH <pI, maior é o numero de cargas negativas, ou positivas.
    15. 15. A voltagem aplicada deve ser adequada para separar o mais rapidamente possível, antes que a difusão espalhe os componentes. Voltagem muito alta, porem, aquece o sistema e prejudica a separação.
    16. 16. Tipos de Eletroforese• Eletroforese livre: livre É método em desuso devido á perturbações (ondas mecânicas, e movimento de convecção do líquido).• Eletroforese em suporte: As substancias são separadas em meio sólidos ou semi-sólido. Não há pertubarções.
    17. 17. Tipos de suportes •Papel de filtro •Acetato de celulose •Gel de agarose•Gel de poliacrilamida 17
    18. 18. 18
    19. 19. Gel de agarose Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas grandesMais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA.19
    20. 20. Eletroforese em gel de agarose1-Gel gelitificado de agarose2-Separa fragmentos longos de DNA3-Corrente elétrica sobre gel4-Partículas menores tem maior velocidade de chegar ate o pólo positivo
    21. 21. É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte deenergia.Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irámanter estáveis as condições de pH do meio. 21
    22. 22. 22
    23. 23. Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas. Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho. O ladder é formado por diferentes tamanhos de DNA e serve como marcador de peso molecular 23
    24. 24. A amostra é inseridanos “pocinhos” Partículas de menor tamanho ou carga mais negativa corre primeiro Uma corrente elétrica é aplicada 24
    25. 25. Gel de poliacrilamidaUsado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas 25
    26. 26. Eletroforese em gel de policrilamida1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra molécula2-Recupera e purifica amostras3-Em cubas de vidros4-Aplicação de corrente
    27. 27. •A poliacrilamida também pode ser utilizada como gel para a eletroforese.•É uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida.•Utilizada para observação de fragmentos menores (poucos pares de bases ou proteínas).•Melhor resolução do que a eletroforese em gel de agarose •Desvantagem: Neurotóxica 27
    28. 28. É realizada em uma cuba de eletroforese vertical. 28
    29. 29. SEMINÁRIO DE BIOFISICA 2º ANO - BIOMEDICINA 29

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