Tecnologia enzimática livro

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Tecnologia Enzimática
Este site é baseado no livro de texto "Tecnologia Enzimática 'escrito por Martin Chaplin
e Christopher Bucke (Cambridge University Press, 1990), que está atualmente fora de
catálogo. Espera-se que ele será gradualmente editada e atualizada, mantendo-se
neste site.
Capítulo 1 : Fundamentos da cinética enzimática
 Por enzimas?
 Nomenclatura de Enzimas
 Unidades de enzima
 O mecanismo de ação da enzima
 Cinética simples de ação enzimática
 Efeito do pH e da força iónica sobre a catálise enzimática
 Efeito da temperatura e da pressão
 Reacções reversíveis
 A inibição de enzimas
 Determinação da V max e K m
 Resumo e Bibliografia do Capítulo 1
Capítulo 2 : preparação da enzima e uso
 Fontes de enzimas
 Triagem para novas enzimas
 Mídia para a produção da enzima
 Preparação de enzimas
 Centrifugação
 Filtration
 Sistemas bifásicos aquosos
 Ruptura celular
 Ultrasonic rompimento celular
 Homogeneizadores de alta pressão
 A utilização de moinhos de esferas
 Uso de Freeze-prensas
 A utilização de métodos líticas
 Preparação de enzimas a partir da solução clarificada
 Tratamento térmico
 Cromatografia
 Cromatografia de troca Ion
 A cromatografia de afinidade
 Cromatografia de exclusão em gel
 Preparação de enzimas para venda
 Atendimento ao Cliente

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 Segurança e aspectos regulatórios do uso de enzimas
Capítulo 3 : A preparação e a cinética de enzimas imobilizadas
 O argumento econômico para a imobilização
 Métodos de imobilização
 A cinética de enzimas imobilizadas
 Efeito de partição de soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas
 Efeitos de difusão do soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas
 Análise dos efeitos difusionais em suportes porosos
Capítulo 4 : A utilização em larga escala de enzimas em solução
 A utilização em larga escala de enzimas em solução
 A utilização de enzimas em detergentes
 Aplicações de proteases na indústria de alimentos
 O uso de proteases nas indústrias de couro e lã
 A utilização de enzimas na hidrólise de amido
 Produção de xarope de glucose
 Produção de xarope contendo maltose
 Enzimas na indústria de sacarose
 Glicose a partir de celulose
 O uso de lactase na indústria de lacticínios
 Enzimas nas indústrias de sucos de frutas, vinho, cerveja e das destilarias
 A glucose oxidase e catalase na indústria alimentar
 Aplicações médicas de enzimas
Capítulo 5 : imobilizada enzimas e seus usos
 Reactores enzimáticos
 Reactores de membrana
 Reactores de fluxo contínuo
 Reactores de leito fixo
 Fluxo de reactores de tanque agitado contínuo
 Os reactores de leito fluidizado
 Processos de enzima imobilizada
 Xaropes de milho de alto -fructose (HFCS)
 Uso de raffinase imobilizada
 Uso de invertase imobilizada
 A produção de ácidos aminados
 Uso de lactase imobilizada
 Produção de antibióticos

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 Preparação de acrilamida
 Resumo e Bibliografia do capítulo 5
Capítulo 6 : Biosensores
 A utilização de enzimas em análise
 Quais são biossensores?
 Biossensores calorimetria
 Biossensores potenciométricos
 Biossensores amperométricos
 Biossensores ópticos
 Biossensores Piezo-elétrico
 Imunossensores
Capítulo 7 : Os recentes avanços na tecnologia enzimática
 As reacções enzimáticas em sistemas bifásicos líquidos
 A estabilização de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos
 Equilíbrio em sistemas bifásicos aquosos-orgânicos
 Cinética de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos
 O uso de sistemas aquosos de 2 fases
 Exemplos práticos da utilização de enzimas 'ao contrário'
 As glicosidases utilizadas em reacções sintéticas
 A interesterificação de lípidos
Capítulo 8 : Perspectivas da tecnologia enzimática
 Para onde a tecnologia enzimática?
 O uso de substratos de "não naturais"
 Engenharia Enzyme
 Enzimas artificiais
 Sistemas de regeneração Coenzima
 Conclusões

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Por enzimas?
Catalisadores aumentar a velocidade das reações de outra forma lenta ou
imperceptíveis sem sofrer qualquer alteração líquida em sua estrutura. O
desenvolvimento inicial do conceito de catálise na 19 th
século andava de mãos dadas
com a descoberta de poderosos catalisadores de fontes biológicas. Estes foram
chamados enzimas e foram mais tarde descobriu ser proteínas. Eles mediar todas as
reações de síntese e de degradação realizados por organismos vivos. Eles são
catalisadores muito eficientes, muitas vezes, muito superior aos catalisadores químicos
convencionais, razão pela qual eles estão sendo utilizados cada vez mais na sociedade
de alta tecnologia de hoje, como uma parte muito significativa da expansão
biotecnológico. Sua utilização criou um negócio de bilhões de dólares, incluindo uma
grande diversidade de processos industriais, produtos de consumo, e florescente campo
de biossensores. Outras aplicações estão sendo descobertos constantemente.
As enzimas têm um número de vantagens distintas sobre os catalisadores químicos
convencionais. Entre tais são a sua especificidade e seletividade não só para as
reações particulares, mas também em sua discriminação entre as partes semelhantes
de moléculas (regioespecificidade) ou isômeros ópticos (estereoespecificidade). Eles
apenas catalisar as reações de intervalos muito estreitos de reagentes (substratos), o
qual pode consistir de um pequeno número de classes de compostos intimamente
relacionados (por exemplo, tripsina catalisa a hidrólise de alguns pépticos e ésteres, em
adição a maioria das proteínas), uma única classe de compostos (por exemplo,
hexocinase catalisa a transferência de um grupo fosfato do ATP para várias hexoses),
ou um único composto (por exemplo, glucose-oxidase de glucose oxida apenas entre os
açúcares que ocorrem naturalmente). Isto significa que a reação pode ser catalisada
escolhido para a exclusão de reações secundárias, eliminando subprodutos
indesejáveis. Assim, as produtividades mais elevadas podem ser alcançadas, reduzindo
os custos de material. Como um bônus, o produto é gerado em um estado não
contaminada reduzindo assim os custos de purificação e a carga ambiental a
jusante. Muitas vezes, um número menor de etapas podem ser necessários para
produzir o produto final desejado. Além disso, certas reações Estero específicas (por
exemplo, a conversão de glicose em frutose) não pode ser conseguida por métodos
químicos clássicos sem um grande dispêndio de tempo e esforço. Enzimas trabalhar
sob condições de processamento geralmente moderadas de temperatura, pressão e
pH. Isto diminui os requisitos de energia, reduz os custos de capital devido ao
equipamento de processo resistente à corrosão e reduz ainda mais a reações laterais
indesejadas. As altas velocidades de reação e regulação catalítico simples obtidos em
reações catalisadas por enzimas permitem um aumento da produtividade com redução
de custos de produção, devido a salários e despesas gerais.

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Existem algumas desvantagens da utilização de enzimas que não pode ser ignorada
mas que estão actualmente a ser tratadas e superar. Em particular, o custo elevado de
isolamento e purificação da enzima ainda desencoraja a sua utilização, especialmente
em áreas que têm actualmente um procedimento alternativo estabelecido. A natureza
geralmente instável de enzimas, quando removido de seu ambiente natural, é também
uma grande desvantagem para o seu uso mais extensivo.
Nomenclatura de Enzimas
Todas as enzimas contêm um esqueleto da proteína. Em algumas enzimas esta é a
única componente da estrutura. No entanto, existem porções adicionais não proteicos
geralmente presentes que pode ou não participar na actividade catalítica da
enzima. Grupos de hidratos de carbono ligadas covalentemente são comumente
encontradas características estruturais que muitas vezes não têm relação direta com a
atividade catalítica, embora eles podem muito bem afetar a estabilidade de uma enzima
e solubilidade.Outros fatores frequentemente encontrados são íons metálicos ( co-
fatores ) e baixa moléculas orgânicas de peso molecular ( coenzimas ). Estes podem
ser vagamente ou fortemente ligados por forças não covalentes ou covalentes. Eles são
frequentemente componentes importantes que contribuem tanto para a actividade e a
estabilidade das enzimas. Este requisito para cofactores e coenzimas deve ser
reconhecido se as enzimas devem ser utilizados de forma eficiente e é particularmente
relevante em processos contínuos, onde pode haver uma tendência para que se
separam da parte de proteína de uma enzima.
As enzimas são classificadas de acordo com o relatório do Comitê de Nomenclatura
nomeado pela União Internacional de Bioquímica (1984). Esta comissão
enzima atribuído cada enzima um nome recomendado e um 4-part número
distintivo. Deve notar-se que alguns nomes alternativos permanecem em uso comum,
tais que eles vão ser utilizados, se for caso disso, no presente texto. A comissão enzima
( EC ) dividir números enzimas em seis grupos principais de acordo com o tipo de
reacção que é catalizada:
(1) Oxidorredutases que envolvem reações redox em que o hidrogênio ou oxigênio
átomos ou elétrons são transferidos entre as moléculas. Esta classe extensa inclui as
desidrogenases (transferência de hidreto), oxidases (transferência de elétrons ao
oxigênio molecular), oxigenases (transferência de oxigênio do oxigênio molecular) e
peroxidases (transferência electrónica de peróxido). Por exemplo: a glicose oxidase (EC
1.1.3.4, nome sistemático, -D-glucose: oxigênio 1-oxidoreductase).

6
[1,1]
-D-glicose + oxigénio D-glucono-1,5-lactona + peróxido de hidrogénio
(2) Transferases que catalisam a transferência de um átomo ou grupo de átomos (eg
acil-, alquil- e glycosyl-), entre duas moléculas, mas excluindo estas transferências como
são classificados nos outros grupos (por exemplo, oxidoreductases e hidrolases). Por
exemplo: aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1, nome sistemático, L-aspartato:
aminotransferase 2-oxoglutarato, também chamado de transaminase glutâmico-
oxalacética ou simplesmente GOT).
[1,2]
L-aspartato + 2-oxoglutarato oxaloacetato + L-glutamato
(3) Hidrolases que envolvem reacções hidrolíticas e a sua reversão. Isto é actualmente
a classe mais comum encontrado de enzimas dentro do campo da tecnologia de enzima
e inclui as esterases, glicosidases, lipases e proteases. Por exemplo: quimosina (CE
3.4.23.4, nenhum nome sistemática declarado; também chamada renina).

7
[1,3]
-caseína + água Pará - -caseína + caseino macropéptido
(4) liases que envolvem reacções de eliminação em que um grupo de átomos é
removido a partir do substrato. Isto inclui as aldolases, descarboxilases, desidratases e
alguns pectinases, mas não inclui hidrolases. Por exemplo: histidina amoníaco-liase (EC
4.3.1.3, nome sistemático, L-histidina amónia-liase; também chamado histidase).
[1.4]
L-histidina urocanate + amoníaco
(5) Isomerases que catalisam isomerisations moleculares e inclui as epimerases,
racemases transferases e intramoleculares. Por exemplo: xilose isomerase (CE 5.3.1.5,
nome sistemático, D-xilose ketol-isomerase; comumente chamado isomerase glucose).

8
[1,5]
-D-glucopiranose -D-frutofuranose
(6) As ligases , também conhecido como sintetases, formam um grupo relativamente
pequeno de enzimas que envolvem a formação de uma ligação covalente juntar duas
moléculas em conjunto, juntamente com a hidrólise de um nucleósido-trifosfato. Por
exemplo: a glutationa-sintetase (EC 6.3.2.3, nome sistemático, -L-glutamil-L-cisteína:
glicina ligase (ADP-formação); também chamado glutationa-sintetase).
[1.6]
ATP + -L-glutamil-L-cisteína + glicina + ADP + fosfato de glutationa
Unidades de enzima
A quantidade de enzima presente ou usado num processo é difícil de determinar, em
termos absolutos (por exemplo gramas), como a sua pureza é frequentemente baixo e
uma proporção pode estar em uma forma inactiva, ou parcialmente activa,
estado. Parâmetros mais relevantes são a actividade da preparação de enzima e as
actividades de enzimas quaisquer contaminantes. Estas actividades são habitualmente
medida em termos da unidade de actividade ( U ) que é definida como a quantidade que
irá catalisar a transformação de 1 micromole de substrato por minuto, em condições
normalizadas.Tipicamente, isto representa 10 -6
- 10 -11
Kg de enzimas puras e 10 -4
-

9
10 -7
Kg para as preparações de enzimas industriais. Outra unidade de actividade
enzimática foi recomendada. Este é o katal ( kat ), que é definida como a quantidade
que irá catalisar a transformação de uma mole de substância, por segundo (1 kat = 60
000 000 L). É uma unidade impraticável e ainda não recebeu ampla aceitação. Por
vezes, as unidades de actividade não-padrão são usados, tais como Soxhet, Anson e
Kilo Novo unidades, que são baseadas em modificações físicas, tais como a redução da
viscosidade e supostamente melhor entendida pela indústria. Justamente, essas
unidades são gradualmente caindo em desuso. A actividade é uma medida do conteúdo
de enzimas que é claramente de grande interesse, quando a enzima é para ser utilizada
em um processo. Por esta razão, as enzimas são geralmente comercializados em
termos de actividade e não o peso. A actividade específica (por exemplo, L kg -1
) é um
parâmetro de interesse, alguma utilidade como um índice de pureza mas menor
importância. Existe um grande problema com essas definições de actividade; a noção
bastante vago de "condições normais". Estes destinam-se a referir-se a condições
óptimas, especialmente no que diz respeito ao pH, força iónica, temperatura,
concentração de substrato e a presença e concentração de cof actores e coenzimas. No
entanto, estas condições óptimas assim-chamados variar tanto entre laboratórios e
entre fornecedores. Eles também depender da aplicação particular em que a enzima é
para ser utilizada. Além disso, as preparações da mesma actividade específica nocional
pode ser diferente no que diz respeito à estabilidade e ser capaz de muito diferente
catalítica total de produtividade (isto é o total de substrato convertido em produto,
durante o tempo de vida do catalisador, sob as condições especificadas). Condições
para a atividade inicial máximo não são necessariamente aqueles para a máxima
estabilidade. Grande cuidado deve ser tomado a consideração desses fatores quando o
catalisador mais eficiente para um fim específico deve ser escolhido
O mecanismo da catálise enzimática
A fim de que ocorra a reacção, as moléculas do reagente devem conter energia
suficiente para atravessar uma barreira de energia potencial, a energia de
activação . Todas as moléculas possuem diferentes quantidades de energia,
dependendo, por exemplo, na sua história recente colisão mas, em geral, apenas alguns
têm energia suficiente para a reacção. Quanto mais baixa for a barreira de energia
potencial para reacção, os mais reagentes têm energia suficiente e, consequentemente,
mais rápida é a reacção irá ocorrer. Todos os catalisadores, incluindo as enzimas, a
função através da formação de um estado de transição, com os reagentes, de energia
livre mais baixa do que seria encontrada na reacção não catalisada (Figura 1.1). Mesmo
reduções bastante modestos neste barreira de energia potencial pode produzir grandes
aumentos na taxa de reação (por exemplo, a energia de ativação para a repartição não
catalisada de peróxido de hidrogênio em oxigênio e água é de 76 kJ M -1
que, na
presença da enzima catalase, esta é reduzida para 30 kJ M -1
e a taxa de reacção é
aumentada por um factor de 10 8
, suficiente para converter um tempo de reacção
medido em anos em um medido em segundos).

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Figura 1.1. Um diagrama esquemático que mostra o perfil de energia livre do decurso
da reacção catalisada por uma enzima que envolve a formação de enzima-substrato
(ES) e da enzima de produtos complexos (PE), isto é,
O caminho da reação catalisada passa pela transição Unidos TS c1 , TS c2 e TS c3 , com
energia livre padrão de ativação G c
*
, ao passo que a reação não catalisada
atravessa os TS estado de transição ucom energia livre padrão de
ativação G u
*
. Neste exemplo, o passo limitante da velocidade seria a conversão de
ES em PE. Reações envolvendo vários substratos e produtos, ou mais intermediários,
são ainda mais complicada. O esquema de reação Michaelis-Menten [1.7] daria um
perfil semelhante, mas sem a calha energia livre complexo EP-. O perfil esquemático
para a reacção não catalisada é mostrado como a linha tracejada. Deve notar-se que o
efeito catalítico apenas se refere à redução da energia livre de activação padrão
de G u
*
a G c
*
e não tem efeito sobre a mudança total de energia livre (isto é. a
diferença entre os pontos iniciais e finais ) ou a constante de equilíbrio relacionada.

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Há um número de mecanismos pelos quais esta diminuição da energia de activação
pode ser conseguida.A mais importante delas envolve inicialmente a enzima de ligação
do substrato (s), com a orientação correcta para reagir, perto dos grupos catalíticos no
complexo enzima activo e quaisquer outros substratos. Desta forma, a energia de
ligação é usado parcialmente, a fim de reduzir a contribuição da activação considerável
entropia, devido à perda dos reagentes '(e grupos catalíticos') de translação e de
rotação de entropia, no sentido da energia total de activação. Outros fatores que
contribuem são a introdução de tensão em que os reagentes (permitindo mais energia
de ligação a estar disponível para o estado de transição), a prestação de uma via
alternativa e reativa a dessolvatação de reagir e catalisando grupos iônicos.
As energias disponíveis para ligação de enzimas para os seus substratos é determinada
principalmente pela complementaridade de estruturas (ou seja, um ajuste 3-dimensional
boa mais forças de ligação iónicos e / ou não-covalentes hidrogénio óptimas). A
especificidade depende repulsão estérica mínima, a ausência de cargas não solvatadas
ou não emparelhados, e a presença de ligações de hidrogénio suficientes. Estas
energias de ligação são capazes de ser muito grande. Como exemplos, constantes de
dissociação antígeno-anticorpo são caracteristicamente perto de 10 -8
M (energia livre
de ligação é de 46 kJ M -1
), o ATP se liga a miosina com uma constante de dissociação
de 10 -13
M (energia livre de ligação é de 75 kJ M -1
) e biotina liga-se a avidina, uma
proteína encontrada na clara do ovo, com uma constante de dissociação de 10 -15
M
(energia livre de ligação é de 86 kJ M -1
). No entanto, as enzimas não usar esta energia
de ligação potencial simplesmente a fim de vincular o substrato (s) e formam complexos
estáveis e duradouras. Se fosse este o caso, a formação do estado de transição entre
ES e EP implicaria uma extremamente grande variação de energia livre, devido à
quebra destas fortes forças de ligação, e a velocidade de formação de produtos seria
muito lento. Eles devem usar essa energia de ligação para reduzir a energia livre do
estado de transição. Isto é geralmente conseguido através do aumento da ligação para
o estado de transição, em vez de os reagentes e, no processo, a introdução de uma
estirpe energético no sistema e permitindo interacções mais favoráveis entre os grupos
catalíticos da enzima e os reagentes.
Cinética simples da ação da enzima
Estabeleceu-se que as enzimas formar um complexo ligado aos seus reagentes (isto
é, substratos ) durante o decurso da sua catálise e antes da libertação dos
produtos. Isto pode ser simplesmente ilustradas, utilizando o mecanismo baseado no de
Michaelis e Menten para uma reacção de um substrato, pela sequência de reacção:
Enzima + Substrato (complexo enzima-substrato) Enzima + Produto

12
[1,7]
onde k 1 , k -1 e k 2 são as respectivas constantes de velocidade, tipicamente possuindo
valores de 10 5
- 10 8
M -1
s -1
, 1 - 10 4
s -1
e 1 - 10 5
s -1
, respectivamente ; o sinal de os
subscritos indicam a direcção em que a constante de velocidade está a actuar. Por
razões de simplicidade a reacção inversa, relativa à conversão de substrato para
produto não está incluído neste esquema. Este é (1) admissíveis para o início da
reacção quando não há nenhuma, ou pouca, o presente produto, ou (2) quando a
reacção é eficazmente irreversível. Reações reversíveis são tratadas com mais detalhes
mais adiante neste capítulo.A velocidade da reacção (v) é a taxa à qual o produto é
formado.
(1,1)
onde [] indica a concentração molar do material fechado (isto é, [ES] é a concentração
do complexo enzima-substrato). A taxa de alteração da concentração do complexo
enzima-substrato é igual à taxa de formação do seu menos a taxa do seu automóvel,
para a frente para se obter o produto ou para trás para regenerar substrato.
portanto:
(1,2)
Durante o curso da reacção, a enzima total no início da reacção ([E] 0 , no tempo zero)
está presente quer como a enzima livre ([E]) ou o complexo ES ([ES]).
ou seja, [E] 0 = [E] + [ES] (1.3)
portanto:
(1,4)
Reunindo termos juntos,
isto dá:

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(1,5)
A equação diferencial de 1,5 é difícil de manusear, mas pode ser consideravelmente
simplificado se pode presumir-se que o lado esquerdo é igual a [ES] sozinho. Este
pressuposto é válido sob o estado estacionário aproximação suficiente mas
desnecessariamente restritivo que a taxa de formação de ES é igual à sua velocidade
de desaparecimento pela formação de produto e reversão para o substrato (ou seja, d
[ES] / dt é zero). Além disso é válido quando a condição:
(1,6)
é válido. Isto ocorre durante uma parte substancial do curso de tempo de reacção ao
longo de uma vasta gama de constantes cinéticas e concentrações de substrato e em
baixo para concentrações enzimáticas moderadas. A variação em [ES], [d ES] / dt, [S] e
[P], com o curso de tempo da reacção é mostrado na Figura 1.2, onde pode ser visto
que a equação simplificada é válido durante a maior parte do reacção.

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. Figura 1.2 Simulação computacional das curvas de progresso da d [es] / dt (0-10 -7 escala M),
[ES] (0-10 -7 escala M), [S] (0-10 -2 escala M ) e [P] (0 - 10 -2 M escala) por uma reacção de
obedecer a uma cinética de Michaelis-Menten, com k 1 = 10 6 M -1 s -1 , k -1 = 1000 s -1 , k 2 = 10
s -1 , [E] 0 = 10 -7 M e [S] 0 = 0,01 M. A simulação mostra três fases distintas para o curso de
tempo de reacção, de uma fase transiente inicial, que tem a duração de cerca de um milésimo de
segundo, seguido por um período mais fase de estado estacionário de cerca de 30 minutos, quando
[ES] permanece constante, mas apenas uma pequena proporção do substrato reage. Isto é seguido
pela fase final, tendo cerca de 6 horas, durante o qual o substrato é completamente convertido em
produto. é muito menos do que [ES] durante ambas as duas últimas fases.
A equação de Michaelis-Menten (abaixo) é simplesmente derivadas a partir das
equações 1.1 e 1.5, substituindo K m para . K m é conhecida como a constante
de Michaelis com um valor tipicamente no intervalo de 10 -1
- 10 -5
M. Quando k 2 << k -
1 , K m é igual à constante de dissociação ( k-1 / k 1 ) do complexo de substrato da
enzima.

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(1,7)
ou, mais simplesmente
(1,8)
onde V max é a taxa máxima de reacção, o que ocorre quando a enzima está
completamente saturada com substrato (ou seja, quando [S] é muito maior do
que K m , V max é igual a k 2 [E], 0 , como o valor máximo [ ES] pode ter é [E] 0 quando
[E] 0 é menor que [S] 0 ). Equação 1.8 pode ser rearranjada para mostrar a dependência
da taxa de reacção na proporção de [S] para K m ,
(1,9)
bem como a natureza da hipérbole retangular do relacionamento, tendo asymptotes na v
= V max e [S] = -K m ,
(V max -v) (K m + [S]) = V max K m (1,10)
A concentração de substrato nestas equações é a concentração real no momento e,
num sistema fechado, apenas será aproximadamente igual à concentração inicial de
substrato ([S] 0 ), durante a fase inicial da reacção. Por isso, é usual utilizar estas
equações para relacionar a velocidade inicial da reacção com a concentração inicial de
substrato, e facilmente predeterminado, (figura 1.3). Isto evita também qualquer
problema que possa ocorrer através da inibição do produto ou reversibilidade de
reacção (ver mais tarde).

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Figura 1.3. Uma trama normalizada da taxa inicial (v 0 ) em função da concentração inicial de
substrato ([S] 0 ) para uma reacção de obedecer a cinética de Michaelis-Menten (equação 1.8). A
trama foi normalizada a fim de torná-lo mais geralmente aplicável traçando a taxa relativa de
reacção inicial (v 0 / V max ) em função da concentração inicial de substrato em relação à constante
de Michaelis ([S] 0 / K m , mais vulgarmente designado a como  , a concentração de substrato
sem dimensão). A curva é uma hipérbole retangular com asymptotes em v 0 = V max e [S] 0 = -
K m . A tangente à curva na origem passa pelo ponto (v 0 = V máx ), ([S] 0 = K m ). A
relação V max / K m é um parâmetro importante cinética que descreve a especificidade relativa de
uma quantidade fixa de enzima para o seu substrato (mais precisamente definida em termos
de k cat / K m ). A concentração do substrato, o que dá uma taxa de metade da velocidade máxima
de reacção, é igual a K m .
Tem sido demonstrado que alguns enzimas seguir à equação de Michaelis-Menten
longo de uma larga gama de condições experimentais. No entanto, continua a ser, de
longe, a equação mais geralmente aplicáveis para descrever reações enzimáticas. Na
verdade, pode ser aplicada de forma realista a um número de reacções que têm um
mecanismo muito mais complexa do que a descrita aqui. Nestes casos Km permanece
uma quantidade importante, característica da enzima e do substrato, correspondente à
concentração do substrato necessária para metade das moléculas de enzima para se
ligar ao substrato (e, portanto, fazendo com que a reacção prossiga a metade da sua

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velocidade máxima) mas o significado cinética preciso derivado anterior não podem ser
titulares e pode ser enganosa. Nestes casos, o K m é provável que igualam uma relação
muito mais complexa entre as várias constantes de taxa envolvidos no esquema de
reacção. Mantém-se independente das concentrações da enzima e do substrato e indica
o grau de ligação entre a enzima e o seu substrato para uma dada concentração de
substrato, um K inferiorm indicando um maior grau de ligação. V max depende claramente
da concentração de enzima e, para alguns, mas não todas, as enzimas podem ser em
grande parte independente do substrato específico utilizado. K m e V max tanto pode ser
influenciada pela carga e conformação da proteína e do substrato (s) que são
determinados pelo pH, temperatura, força iónica e outros factores . É muitas vezes
preferível substituir k cat para k 2 , onde V max = k gato [E], 0 , como o significado preciso
de k 2 , acima, podem também ser enganadora. k cat também é conhecido como
o número de turnover como ele representa o número máximo de moléculas de
substrato que a enzima pode 'virar' para produtos em um tempo definido (por exemplo,
os números de volume de negócios de amilase, glucoamilase e glicose isomerase
são 500 s -1
, 160 s -1
e 3 s - 1
, respectivamente; uma enzima com uma massa molecular
relativa de 60000 e actividade específica 1 mg L -1
tem um número de turnover de 1 s -
1
). A relação k cat / K m determina a taxa relativa de reacção a concentrações baixas de
substrato, e é conhecida como a constante de especificidade . É também aparente a
2 nd
constante de velocidade de ordem a baixas concentrações de substrato (ver Figura
1.3), onde
(1.11)
Muitas aplicações de enzimas envolvem sistemas abertos, onde a concentração de
substrato permanece constante, devido à reposição, ao longo do curso de tempo de
reacção. Isto é, é claro, a situação que prevalece frequentemente in vivo . Nestas
circunstâncias, a equação de Michaelis-Menten é obedecida uma gama ainda maior de
concentrações de enzima do que o permitido em sistemas fechados, e é comumente
usado para modelar sistemas cinéticos da enzima imobilizada (ver Capítulo 3).
As enzimas têm evoluído ao maximizar k cat / K m (ou seja, a constante de especificidade
para o substrato) mantendo K m aproximadamente idêntica à concentração de substrato
encontrados naturalmente. Isto permite que a enzima para operar de forma eficiente e
ainda exercer algum controlo sobre a velocidade da reacção.
A constante de especificidade é limitada pela taxa na qual os reagentes encontram um
ao outro sob a influência de difusão. Para uma reacção de um único substrato, a taxa de
encontro entre o substrato e a enzima é de cerca de 10 8
- 10 9
M -1
s -1
. A constante de
especificidade de algumas enzimas abordar este valor, ainda que o intervalo dos valores
determinados é muito larga (por exemplo, k cat / K m para a catalase é de 4 x 10 7
M -1
s -
1
, enquanto que é 25 M -1
s -1
durante isomerase da glicose, e para outras enzimas
varia de menos de 1 M -1
s -1
a superior a 10 8
M -1
s -1
).

18
Efeito do pH e da força iónica
As enzimas são moléculas anfotéricos contendo um grande número de grupos ácidos e
básicos, situada principalmente na sua superfície. Os encargos sobre estes grupos
podem variar, de acordo com as suas constantes de dissociação de ácido, com o pH do
ambiente ( Tabela 1.1 ). Isto irá afectar o custo total líquido das enzimas e a distribuição
de carga na sua superfície exterior, para além da reactividade dos grupos
cataliticamente activas. Estes efeitos são especialmente importantes no bairro dos sítios
ativos.Tomadas em conjunto, as alterações nas taxas de pH com afectar a actividade,
solubilidade e estabilidade estrutural da enzima.
Tabela 1.1 . pK um s um
e calores de ionização b
dos grupos ionizantes comumente
encontrados em enzimas.
Grupo
Usual
pK umintervalo
Custo
aproximado de
pH 7
Heats de
ionização
(kJ mol -1 )
Carboxilo (C-
terminal, ácido
glutâmico, ácido
aspártico)
3-6 -1.0 5
Amónio (N-terminal)
(lisina)
7-9 1,0 +45
9-11 1,0 +45
Imidazolilo
(histidina)
5-8 0,5 +30
Guanidilo (arginina) 11-13 1,0 +50
Fenólicos (tirosina) 9-12 0.0 +25
Tiol (cisteína) 8-11 0.0 +25
um
O pK um (definida como -Log 10 (K um )) é o pH ao qual metade dos grupos são
ionizados. Note-se a semelhança entre o K um de um ácido e de K m de uma enzima,
que é a concentração do substrato em que metade das moléculas de enzima ter ligado
substrato. ( Voltar )
b
Por convenção, o calor (entalpia) de ionização é positiva quando o calor é retirado da
solução circundante (isto é, a reacção é endotérmica) pela dissociação dos iões de
hidrogénio. ( Voltar )

19
Haverá um pH, característica de cada enzima, em que a carga líquida na molécula é
zero. Isto é chamado de ponto isoeléctrico (pi), na qual a enzima geralmente possui uma
solubilidade mínima em soluções aquosas. De uma maneira semelhante ao efeito sobre
as enzimas, a distribuição de carga e carga sobre o substrato (s), o produto (s) e
coenzimas (onde aplicável) também será afectado por alterações de pH. O aumento da
concentração de iões de hidrogénio será, além disso, aumentar a competição bem
sucedida dos iões de hidrogénio para qualquer locais na enzima de ligação catiónico de
metal, reduzindo a concentração de catião metálico ligado. Uma redução na
concentração de iões de hidrogénio, por outro lado, leva a aumento da concentração de
iões hidroxilo que competir com ligandos para as enzimas 'divalentes e trivalentes
causando a sua conversão em hidróxidos e, em concentrações elevadas, hidroxilo, a
remoção completa da enzima. A temperatura também tem um efeito marcado sobre
ionisations, cuja extensão depende dos calores de ionização dos grupos particulares em
causa ( Tabela 1.1 ). A relação entre a variação no pK um e a mudança de temperatura é
determinada por um derivado da equação de Gibbs-Helmholtz:
(1.12)
em que T é a temperatura absoluta (K), R é a constante da lei de gás (8,314 JM -1
K -
1
), H é o calor de ionização e a constante numérica (2,303) é o logaritmo natural de
10, como pKa um 's são baseados em logaritmos com base 10. Esta variação é suficiente
para deslocar o pI de enzimas até uma unidade de pH no sentido de um menor aumento
da temperatura de 50C.
Estas variações de carga, além de quaisquer consequentes alterações estruturais, pode
ser refletido em mudanças na ligação do substrato, a eficiência catalítica e a quantidade
de enzima ativa. Ambos V max e de K m vai ser afectada devido às modificações
resultantes para as constantes cinéticas de k 1 , k -1 e k cat(k 2 no mecanismo de
Michaelis-Menten), e a variação da concentração de enzima activa . O efeito do pH
sobre a V max de uma reacção enzimática catalisada pode ser explicado com o uso,
geralmente verdade, pressuposto de que apenas uma forma carregada de enzima é
optimamente catalítica e, portanto, a concentração máxima do intermediário enzima-
substracto não pode ser maior do que o concentração desta espécie. Em termos
simples, assumir EH -
é a única forma activa do enzima,
[ 1,8 ]
A concentração de EH -
é determinada pelas duas dissociações
[ 1,9 ]

20
[ 1.10 ]
com
(1.13)
e
(1,14)
No entanto,
(1,15)
portanto:
(1.16)
Como a velocidade da reacção é dada por k 2 [EH -
S] e esta é máxima quando [EH -
S]
é máximo (ou seja, quando [EH. -
S] = [EH -
] 0 ):
(1,17)
O V max será maior quando
(1,18)
portanto:
(1,19)
Esta derivação envolveu uma série de simplificações sobre a situação real; ignora o
efeito da ionização de substratos, os produtos e os complexos enzima-substrato e
presume EH -
é uma única espécie ionizado quando ela pode conter uma mistura de
grupos ionizados diferente mas com carga global idêntica, embora o processo de

21
ligação do substrato tenderá para fixar as espécies iônicas necessárias. Ele, no entanto,
produzir uma variação de taxa máxima com pH que dá a curva comumente encontrado
'em forma de sino "( Figura 1.4 ). Quando o esquema de reacção real é mais complexa,
pode haver uma relação mais complexa entre V max e pH. Em particular, pode haver
uma mudança no passo determinante da velocidade com o pH. Deve ser reconhecido
que K m pode mudar com o pH de uma forma independente do V max , uma vez que
geralmente envolve outros, ou adicionais, grupos ionizáveis. É claro que em menores
concentrações de substrato não saturando as mudanças de actividade com pH pode ou
não refletir as mudanças na V max . Deve também notar-se a partir da discussão anterior
que a variação da actividade com o pH depende do sentido de reacção sob
consideração. O pH óptimo pode muito bem ser diferente na direcção para a frente do que
mostrado pela reacção inversa. Isto é particularmente visível quando as reações que
liberam ou utilizam prótons são considerados (por exemplo, desidrogenases) onde não
podem muito bem ser superior a 2 pH unidades diferença entre o pH ideal mostrado pelas
taxas de frente e reações reverter.
Figura 1.4. Um diagrama esquemático de aplicação geral da variação na taxa de uma reacção
catalisada por enzima (V max ) com o pH da solução. O centro (pH ótimo) e amplitude dessa
"forma de sino 'curva depender das constantes de dissociação de ácido dos grupos relevantes na
enzima. Deve notar-se que algumas enzimas têm perfis de pH da actividade que mostram pouca
similaridade com este diagrama.
A variação da actividade com o pH, dentro de um intervalo de 2-3 unidades de cada
lado da pi, é normalmente um processo reversível. Os extremos do pH, no entanto,
provocar um tempo e dependente da temperatura, essencialmente irreversível, a
desnaturação. Em solução alcalina (pH> 8), pode haver destruição parcial dos resíduos

22
cisteína devido a catalisada por base reacções -eliminação, enquanto que, em
soluções ácidas (pH <4), a hidrólise das ligações peptídicas lábeis, por vezes
encontrada ao lado de resíduos de ácido aspártico , pode ocorrer. A importância do
conhecimento sobre a variação da atividade com pH não pode ser mais enfatizado. No
entanto, um número de outros factores pode significar que o pH óptimo do
V max diagrama -pH pode não ser a escolha do pH em um processo tecnológico
envolvendo enzimas. Estes incluem a variação de solubilidade do substrato (s) e
produto (s), mudanças na posição de equilíbrio para uma reacção, a supressão da
ionização de um produto para facilitar a sua divisão e recuperação para um solvente
orgânico, e a redução da susceptibilidade a oxidação ou a contaminação microbiana. O
principal factor de tal é o efeito do pH sobre a estabilidade da enzima. Esta relação é
ainda mais complicada pela variação do efeito do pH com tanto a duração do processo
e a temperatura ou perfil de temperatura-tempo. O parâmetro importante derivada
destas influências é a produtividade da enzima (ou seja, a quantidade de substrato que
é capaz de converter em produto). A variação de pH com a produtividade pode ser
semelhante à do V max relação -pH mas as mudanças na composição da corrente e o
tempo de contacto do substrato pode também fazer alguma contribuição. Em geral, a
variação deve ser determinado de acordo com as condições do processo industrial. É
possível alterar os perfis de pH da actividade de enzimas. A ionização dos ácidos
carboxílicos envolve a separação dos grupos libertados de carga oposta. Este processo
é incentivada dentro das soluções de maior polaridade e reduzido por soluções menos
polares. Assim, reduzindo a constante dieléctrica de uma solução aquosa através da
adição de um co-solvente de polaridade baixa (por exemplo, dioxano, etanol), ou por
imobilização (ver Capítulo 3 ), aumenta o pKa de um dos grupos de ácido carboxílico. Este
método é, por vezes, útil, mas geralmente não aplicável aos enzima reações
catalisadas, pois pode causar uma mudança drástica na produtividade de uma enzima
devido a desnaturação (mas veja Capítulo 7 ). O pK umdos grupos básicos não são
igualmente afetados, pois não há separação de cargas, quando grupos básicos
ionizar. No entanto, os grupos básicos protonados que são estabilizadas por grupos
vizinhos carregados negativamente será estabilizado (ou seja, ter reduzido pK um ) por
soluções de baixa polaridade. As alterações na força iónica (  ) da solução pode
também ter algum efeito. A força iónica é definida como metade da soma total da
concentração (c i ) de todas as espécies iónicas (I) na solução vezes o quadrado da sua
carga (z i ); isto é.  = 0,5 (c i z i
2
).
Por exemplo, a força iónica de uma solução 0,1 M de CaCl 2 é 0,5 x (0,1 x 2 2
+ 0,2 x
1 2
) = 0,3 M.
Na maior solução iónica força, cobrar separação é estimulado com uma concomitante
redução do ácido carboxílico pK um s. Estas alterações extensivas, como eles podem
ser, têm pouco efeito sobre a carga total da molécula de enzima em pH neutro e,
portanto, só é susceptível de exercer uma pequena influência sobre o ponto isoeléctrico
da enzima. Métodos de derivatização química estão disponíveis para converter cargas
superficiais do positivo para o negativo e vice-versa. Verificou-se que uma única
mudança na carga tem pouco efeito sobre o perfil de pH da actividade, a menos que
seja no local activo. No entanto, se todas as lisinas são convertidos em carboxilatos (por

23
exemplo, por reacção com anidrido succínico) ou se todos os carboxilatos são
convertidas em aminas (por exemplo, por acoplamento de etileno diamina por meio de
uma carbodiimida, ver Capítulo 3 ) o perfil pode ser deslocado sobre um pH unidade na
direcção de pH mais elevado ou inferior, respectivamente. A causa desses desvios é
principalmente a estabilização ou desestabilização das taxas no local activo durante a
reacção, e os efeitos são mais evidentes a baixa força iónica. Alguns, mais poderoso,
métodos para mudar o perfil de pH-atividade são específicas de enzimas imobilizadas e
descrito no Capítulo 3 .
A força iónica da solução que é um parâmetro importante que afecta a actividade da
enzima. Isto é especialmente perceptível em catálise depende do movimento de
moléculas carregadas em relação ao outro. Assim, tanto a ligação de substratos
cobradas para enzimas e o movimento de grupos carregados dentro do sítio catalítico
"ativo" será influenciada pela composição iônica do meio. Se a velocidade da reacção
depende da abordagem de porções carregadas da seguinte relação aproximada pode
segurar,
(1.20)
onde k é a constante de velocidade real, k 0 é a constante de velocidade a zero, a força
iónica, z Uma ez Bsão as cargas electrostáticas das espécies reagentes, e Ié a força
iónica da solução. Se as cargas sejam opostas, em seguida, há uma diminuição na taxa
de reacção com o aumento da força iónica enquanto que, se as cargas são idênticos,
um aumento na taxa de reacção irá ocorrer (por exemplo, o passo de controlo da
velocidade do mecanismo catalítico de quimotripsina envolve a abordagem de dois
grupos carregados positivamente, 57
histidina +
e 145
de arginina +
causando um aumento
significativo em k cat no aumento da força iónica da solução). Mesmo se uma relação
mais complexa entre as constantes de velocidade e a força iónica se mantém, é
claramente importante para controlar a força iónica das soluções em paralelo com o
controlo de pH.
Efeito da temperatura e da pressão
Taxas de todas as reacções, incluindo aquelas catalisada por enzimas, sobem com o
aumento da temperatura de acordo com a equação de Arrhenius.
(1,21)
onde k é a constante de velocidade cinética para a reacção, A é a constante de
Arrhenius, também conhecido como o factor de frequência, L *
é a energia livre
padrão de activação (kJ M -1
) que depende da factores de entalpia e entropia, R é a
constante de lei dos gases e T é a temperatura absoluta.Energias livres padrão típicos
de ativação (15-70 kJ M -1
) dá origem a aumentos na taxa por fatores entre 1,2 e 2,5
para cada 10C aumento da temperatura. Este factor para o aumento da velocidade de

24
reacção para cada aumento de 10 ° C na temperatura é geralmente indicada pelo
termo Q 10 (isto é, neste caso, Q10 está dentro do intervalo 1,2-2,5). Todas as constantes
de velocidade que contribuem para o mecanismo catalítico irá variar
independentemente, resultando em alterações tanto K m e V max . Daqui resulta que,
numa reacção exotérmica, a reacção inversa (tendo uma energia de activação superior)
aumenta mais rapidamente com a temperatura de reacção para a frente. Isto, não só
altera a constante de equilíbrio (ver equação 1,12), mas também reduz a temperatura
óptima para a conversão máxima medida que a reacção progride. O inverso aplica-se
para reacções endotérmicas, tais como a de isomerase de glucose (verreacção [1,5] ),
onde a proporção de frutose em glucose, no estado de equilíbrio, aumenta de 1,00 para
1,17 a 55C em 80C.
Em geral, é preferível a utilização de enzimas em altas temperaturas, a fim de fazer uso
deste aumento da taxa de reacção mais a protecção contra ela proporciona a
contaminação microbiana. As enzimas, porém, são proteínas e sofrem essencialmente
irreversível desnaturação (isto é. a alteração conformacional que implica uma perda de
actividade biológica), a temperaturas acima daquelas a que se encontram normalmente
expostos no seu ambiente natural. Estas reacções de desnaturação têm energias livres
de padrão de activação de cerca de 200-300 kJ mol -1
(Q 10 no intervalo de 6-36), o que
significa que, acima de uma temperatura crítica, há uma rápida taxa de perda de
actividade ( Figura 1.5 ) . A perda real da atividade é o produto dessa taxa ea duração
da incubação ( Figura 1.6 ). Isso pode ser devido a alterações covalentes, tais como a
desaminação de resíduos de asparagina ou alterações não covalentes, tais como o
rearranjo da cadeia de proteína. Inactivação por desnaturação pelo calor tem um efeito
profundo sobre a produtividade enzimas ( Figura 1.7 ).
Figura 1.5. Um diagrama esquemático que mostra o efeito da temperatura sobre a
actividade de uma enzima reacção catalisada. curto período de incubação; ----- longo

25
período de incubação. Note-se que a temperatura à qual parece haver actividade
máxima varia com o tempo de incubação.
estabilidade de uma enzima reacção catalisada. As curvas mostram a atividade
percentual restante como o período de incubação aumenta. Do alto que representam
aumentos iguais na temperatura de incubação (50C, 55C, 60C, 65C e 70C).
produtividade de uma reacção catalisada por enzima. 55C; 60C; 65C. A produtividade
óptima é visto a variar com o tempo do processo, o que pode ser determinado por
outros factores adicionais (por exemplo, custos gerais). É muitas vezes difícil conseguir
um controlo preciso da temperatura de um processo catalisado enzima e, sob estas
circunstâncias, pode ser visto que é prudente errar no lado de baixa temperatura.

26
A desnaturação térmica de uma enzima pode ser modelada pela seguinte esquema de
desactivação de série:
[1.11]
onde k d1 e K d2 são os coeficientes da taxa de desactivação de primeira ordem, E é a
enzima nativa, que pode, ou não, ser uma mistura de equilíbrio de um número de
espécies, caracterizada a estrutura ou actividade, e E 1 e E 2 são moléculas de enzima
de actividade específica média em relação a E de A 1 e A2 . A 1 pode ser maior ou
menor que a unidade (isto é, E 1 pode ter actividade mais elevada ou mais baixa do que
E) Um passo que 2 é normalmente muito pequena ou zero. Este modelo permite que os
raros casos que envolvem a enzima livre (por exemplo, a tirosinase) e os casos que
envolvem um pouco plebeu enzima imobilizada (ver Capítulo 3), onde há uma pequena
ativação inicial ou período de graça que envolve a perda insignificante discernível de
atividade durante períodos de incubação curto, mas antes a desactivação mais
tarde. Supondo que, no início da reacção:
(1,22)
e:
(1,23)
No instante t,
(1,24)
Decorre o esquema de reacção [1.11] ,
(1,25)
Integrando a equação 1.25 usando a condição de contorno na equação 1.22 dá:
(1,26)
A partir do esquema de reacção [1,11],

27
(1,27)
Substituindo [E] a partir da equação 1.26,
(1,28)
Integrando a equação 1.27 usando a condição de contorno na equação 1.23 dá:
(1,29)
Se o termo "atividade fraccionada» (A f
) é introduzido onde,
(1.30)
em seguida, substituindo [E 2 ] a partir da equação 1.24, dá:
1.31
portanto:
1,32
Quando ambos A 1 e A 2 são iguais a zero, os simples de primeira ordem resultados de
expressão velocidade de desactivação
(1.33)
A meia-vida (t 1/2 ) de uma enzima é o tempo que leva para a actividade para reduzir à
metade da actividade original (i, e. Uma f
= 0,5). Se a inactivação do enzima obedece a
equação 1,33, a meia-vida pode ser derivada simplesmente,
(1,34)
portanto:
(1,35)

28
Neste caso simples, a semi-vida da enzima é mostrada a ser inversamente proporcional
à taxa de desnaturação.
Muitas preparações de enzimas, ambos gratuitos e imobilizados, parecem seguir este
esquema de desativação do tipo série. No entanto, porque os dados de confiança e
reprodutível é difícil de obter, os dados de inactivação deverá, em geral, ser considerada
como sendo um pouco propensa a erros. Não é de estranhar que esses dados podem
ser feitas para ajustar um modelo envolvendo quatro parâmetros determinados (A 1 ,
A 2 , k d1 e k D2 ). Apesar dessa possível reserva, equações 1.32 e 1.33 permanecem
bastante útil e a teoria possui a vantagem definitiva da simplicidade. Em alguns casos, o
tipo série de desactivação pode ser devido a micro-heterogeneidade estrutural, em que
a preparação de enzima é constituída por uma mistura heterogénea de um grande
número de formas estruturais afins. Estas podem ter sido formados durante o história
passada da enzima durante a preparação e armazenagem devido a uma série de
reacções secundárias, tais como a desamidação de um ou dois resíduos de asparagina
ou glutamina, ou a proteólise limitada de intercâmbio de dissulfureto. Alternativamente,
pode ser devido ao equilíbrio de estrutura quaternária ou a presença de variantes
genéticas distintas. Em qualquer caso, a maior variabilidade ainda mais evidente será a
cinética de inactivação do tipo série. O efeito prático disto é que geralmente k d1 é
aparentemente muito maior que k d2 e A 1 é menor que a unidade.
A fim de minimizar a perda de actividade em armazenamento, mesmo temperaturas
moderadas devem ser evitados. A maioria das enzimas são estáveis durante meses, se
refrigerado (0 - 4C). Arrefecimento abaixo de 0 ° C, na presença de aditivos (por
exemplo, glicerol), que evitar o congelamento, em geral, pode aumentar esta
estabilidade de armazenamento ainda mais. Soluções enzimáticas de congelamento é
melhor evitar, uma vez que muitas vezes provoca desnaturação devido ao estresse e
pH variação causada pela formação de gelo cristal. As constantes de primeira ordem de
desactivação são muitas vezes significativamente menor no caso de enzima-substrato,
enzima-inibidor e complexos enzima-produtos que ajuda a explicar os efeitos
estabilizadores substanciais de ligandos adequados, especialmente a concentrações
onde existe pouco enzima livre (por exemplo, [S] >> K m ). Outros factores, tais como a
presença de anti-oxidantes de tiol, pode melhorar a estabilidade térmica, em casos
particulares.
Verificou-se que a desnaturação pelo calor de enzimas é essencialmente devido às
interacções das proteínas com o ambiente aquoso. Eles são geralmente mais estáveis
no concentrado, em vez de diluir, soluções. Em um estado predominantemente seco ou
desidratado, eles permanecem ativos por períodos consideráveis, mesmo em
temperaturas acima de 100C. Esta propriedade tem uma grande importância
tecnológica e está sendo explorada pelo uso de solventes orgânicos (ver Capítulo 7 ).
As alterações de pressão também afetará as reações catalisadas enzima. Claramente
qualquer reação envolvendo gases dissolvidos (por exemplo Oxigenases e
descarboxilases) serão particularmente afectados pelo aumento da solubilidade do gás

29
em altas pressões. A posição de equilíbrio da reacção também será deslocado devido a
qualquer diferença nos volumes molares entre os reagentes e produtos.No entanto, um,
se bastante pequena, a influência adicional é devido às mudanças de volume que
ocorrem durante enzimática de ligação e catálise. Algumas misturas de enzimas-
reagentes podem sofrer reduções no volume, no montante de até 50 ml toupeira -
1
durante a reação devido a restrições de conformação e as mudanças na sua
hidratação. Este, por sua vez, pode conduzir a uma duplicação da kcat , e / ou uma
redução para metade na K m para um aumento de 1000 vezes na pressão. Os efeitos
relativos em k cat e K m depender das variações de volume e de ligação relativa durante
a formação dos estados de transição da reacção.
Reacções reversíveis
Uma reacção enzimática reversível (por exemplo, a conversão de glicose em frutose,
catalizada pela isomerase da glucose) pode ser representado pelo seguinte esquema de
reacção onde a atravessa os estágios reversíveis de enzima-substrato (ES) a formação
do complexo, a conversão enzima-produto (EP ) complexo e, finalmente, a dessorção
do produto. Nenhuma etapa de controlo de taxa está completamente.
[1.12]
Os pares de equações simétricas podem ser obtidas pela alteração na concentração
dos intermediários com o tempo:
(1,36)
(1,37)
Assumindo que não há nenhuma desnaturação, a concentração total de enzima deve
permanecer constante e:
(1.38a)
portanto:
(1.38b)
coleta de termos [ES]

30
(1.39a)
(1.39b)
e,
(1.38c)
agrupando termos [EP]
(1.40a)
(1.40b)
Sob condições semelhantes às discutidas anteriormente para o mecanismo de
Michaelis-Menten (por exemplo, sob as premissas de estado estacionário quando
ambos d [ES] / dt e d [EP] / dt é zero, ou mais exactamente quando
(1,41)
e
(1,42)
são ambas verdadeiras. As seguintes equações podem ser derivados a partir da
equação 1.39b utilizando a aproximação, dada por equações 1,41 e termos colectores.
(1.43a)
(1.43b)

31
(1.43c)
Além disso, as seguintes equações (simétricas ao acima) pode ser derivada a partir da
equação 1.40butilizando a aproximação, dada pela equação de 1,42 , e recolhendo
termos.
(1.44a)
(1.44b)
(1.44c)
Substituindo [ES] da equação 1.44c na equação 1.43a
(1.43d)
(1.43E)
(1.
43f)
Removendo condições idênticas a partir de ambos os lados da equação:
(1,43 g)
Juntando todos os termos [EP]:
(1.43h)
(1.43i)

32
Além disso, a substituição de [EP] a partir da equação 1.43c na equação 1.44a
(1.44d)
(1.44e)
(
1.44f)
Removendo condições idênticas a partir de ambos os lados da equação:
(
1,44 g)
Juntando todos os termos [ES]:
(1.44h)
(1.44i)
A taxa de líquido de reacção (isto é. Taxa à qual o substrato é convertido no produto
menos a taxa à qual o produto é convertido ao substrato) pode ser denotado
por v onde,
(1,45)
Substituindo a partir de equações 1.43i e 1.44i
(1.46a)
Simplificando:

33
(1.46b)
Portanto,
(1,47)
onde:
(1,48)
(1,49)
(1,50)
(1,51)
Em equilíbrio:
(1,52)
e, porque o numerador da equação de 1,47 deve ser igual a zero,
(1,53)
onde [S] e [P] são as concentrações no equilíbrio do substrato e produto (em tempo
infinito). Mas, por definição,
(1,54)
Substituindo a partir da equação 1.53

34
(1,55)
Este é o Haldane relação.
Portanto:
(1,56)
Se K m
S
e K m
P
são aproximadamente iguais (por exemplo, a isomerase comercial
imobilizada glicose, Sweetase, tem K m (glucose) de 840 mm e K m (frutose) de 830 mM
a 70 ° C), e notando que o total quantidade de substrato e produto em qualquer altura,
deve ser igual à soma do substrato e do produto no início da reacção:
(1,57)
Portanto:
(1,58)
Portanto:
(1,59)
onde:
(1,60)
K 'não é um verdadeiro constante cinética, uma vez que só é constante se o substrato
inicial, bem como a concentração do produto é mantido constante.
Além disso,
(1,61)

35
Substituindo na equação 1,54 ,
(1,62)
Deixe [S #
] igualar a diferença de concentração entre a concentração real de substrato
e a concentração de equilíbrio.
(1,63)
Portanto:
(1,64)
Substituindo na equação 1.47
(1,65)
Reorganizando a equação 1.55 ,
(1.66)
Portanto:
(1,67)
Portanto:
(1,68)
Onde

36
(1,69)
Portanto:
(1,70)
Portanto:
(1,71)
e:
(1,72)
Tal como no caso de K 'na equação 1.59 , K não é um verdadeiro constante cinética,
uma vez que varia com [S] e, por conseguinte, a soma de [S] 0 e [P] 0 . É apenas se
constante a concentração de substrato inicial mais produto é mantido constante. Por um
argumento semelhante, mas simétrica, a taxa líquida de reação inversa,
(1,73)
com constantes definidas como anteriormente, mas por simetricamente troca de
K m
P
com K m
S
, V e r
com V f
.
Ambas as equações ( 1.59 ) e ( 1.68 ) são úteis na modelagem de reações reversíveis,
particularmente a reação tecnologicamente importante catalizada pela isomerase
glucose. Eles podem ser mais desenvolvidas para dar estimativas de tempo de
produtividade e para uso na comparação de diferentes configurações de reatores
(ver capítulos 3 e 5 ).
Embora nunca uma enzima pode alterar a posição de equilíbrio de uma reacção
catalisada, pois não tem qualquer efeito sobre o padrão de variação de energia livre
envolvidos, que podem favorecer a reacção numa direcção, em vez de o seu
inverso. Ele consegue isso por apenas obrigatório o produto (s) fracamente da ligação
forte, como complexos enzima-reagente, os reagentes nesta direção preferencial,
mas. A enzima está ligada com o reagente (s), favorecendo a sua reacção, deixando

37
pouco livre para catalisar a reacção no sentido inverso. É pouco provável, portanto, que
a mesma preparação de enzima seria óptimo para catalisar uma reacção reversível em
ambas as direcções.
A inibição de enzimas
Um certo número de substâncias podem causar uma redução da taxa de reacção
catalisada por uma enzima. Alguns destes (por exemplo, ureia) desnaturantes de
proteínas não-específicos. Outros, que actuam geralmente de forma bastante
específica, são conhecidos como inibidores. A perda de actividade pode ser reversível,
em que a actividade pode ser restabelecida por remoção do inibidor, ou irreversível, que
a perda de actividade é dependente do tempo e não pode ser recuperado durante a
escala temporal de interesse. Se a enzima inibida é totalmente inactivo, a inibição
irreversível comporta-se como uma perda dependente do tempo da concentração de
enzima (isto é. Baixa V max ), em outros casos, envolvendo inactivação incompleta, pode
haver alterações dependentes do tempo em ambos K m e V max .Íons de metais pesados
(por exemplo, mercúrio e chumbo) geralmente deve ser impedido de entrar em contato
com as enzimas como eles costumam causar tal inibição irreversível através da ligação
forte com a estrutura de aminoácidos.
Mais importante para a maioria dos processos catalisados por enzimas é o efeito de
inibidores reversíveis.Estes são geralmente discutidos em termos de uma extensão
simples para o esquema de reacção de Michaelis-Menten.
[1.13]
em que I representa o inibidor reversível e o inibidor (dissociação) Constantes de K i e
K i são dadas por '
(1,74)
e,
(1,75)

38
Para os presentes fins, presume-se que nem E eu nem ES I pode reagir para formar o
produto. Equilíbrio entre E I e ES I é permitido, mas não faz nenhuma contribuição
líquida para a equação da taxa de como deve ser equivalente ao equilíbrio estabelecido
por meio de:
[1.14]
A ligação de inibidores pode mudar com o pH da solução, conforme discutido
anteriormente para o substrato de ligação, e resultar na variação independente de
ambos K i e K i 'com o pH.
A fim de simplificar a análise substancialmente, é necessário que a taxa de formação de
produto (k 2 ) é lento em relação ao estabelecimento do equilíbrio entre as espécies.
Portanto:
(1,76)
também:
(1,77)
onde:
(1,78)
portanto:
(1,79)
Substituindo a partir das equações (1.74), (1.75) e (1,76), seguido por simplificação, dá:
(1,80)
portanto:

39
(1,81)
Se a concentração total de enzima é muito menos do que a concentração total de
inibidor (isto é, [E] 0 << [I ] 0 ), em seguida:
(1,82)
Esta é a equação utilizada geralmente para a inibição mista envolvendo tanto E I e
ES I complexos (Figura 1.8a ). Um número de processos simplificados existir.
A inibição competitiva
K i "é muito maior do que a concentração total de inibidor e o ES eu complexo não é
formado. Isto ocorre quando tanto o substrato e inibidor competem para a ligação ao
local activo da enzima. A inibição é mais perceptível a baixas concentrações de
substrato, mas pode ser superada em concentrações suficientemente elevadas de
substrato como o V max permanece não afectada ( Figura 1.8b ). A equação de taxa é
dada por:
(1,83)
em que K m
app
é a aparente K m para a reacção, e é dada por:
(1,84)
Normalmente, o inibidor competitivo tem alguma semelhança estrutural com o substrato,
e muitas vezes é um produto da reacção ( inibição do produto , por exemplo, inibição
de lactase por galactose), que podem causar uma perda substancial de produtividade
quando são requeridos elevados graus de conversão. A equação de velocidade para a
inibição produto é obtido a partir das equações (1,83) e (1,84).
(1,85)

40
Um efeito similar é observado com substratos concorrentes, bastante situação comum
em conversões industriais, e especialmente relevante para hidrólises macromoleculares
onde um número de diferentes substratos podem coexistir, todos com diferentes
parâmetros cinéticos. A reação envolvendo dois co-substratos pode ser modelado pelo
regime.
[1.15]
Ambos os substratos competem para o mesmo sítio catalítico e, por conseguinte, a sua
ligação é mutuamente exclusivas e que se comportam como inibidores competitivos das
reacções uns dos outros.Se as taxas de formação de produto são muito mais lenta do
que a obtenção de equilíbrio (isto é, k 2 e k 4são muito menos do que k -1 k e -3 ,
respectivamente), a taxa de formação de P 1 é dada por :
(1,86)
e a taxa de formação de P 2 é dada pela
(1,87)
Se as concentrações de substrato são pequenos em relação aos seus K m valores:
(1,88)
Portanto, em uma situação competitiva usando o mesmo enzima e com ambos os
substratos na mesma concentração:
(1,89)

41
onde e > neste caso simplificado. As taxas relativas de reacção estão
na razão das constantes de especificidade. Se ambas as reacções produzem o mesmo
produto (por exemplo, algumas hidrólises):
(1,90)
portanto:
(1,91)
Inibição não competitiva
K i é muito maior do que a concentração total de inibidor e o complexo EI não é
formado. Isto ocorre quando o inibidor se liga a um sítio que só se torna disponível após
o substrato (S 1 ) foi ligado ao sítio activo da enzima. Esta inibição é mais comumente
encontrados em reacções de multi-substrato, onde o inibidor é competitivo em relação a
um substrato (por exemplo, S 2 ), mas não competitiva em relação ao outro (por
exemplo, S 1 ), em que o esquema de reacção pode ser representada pela
[1.16]
A inibição é mais notável em concentrações elevadas de substrato (ou seja, S 1 no
esquema acima) e não pode ser ultrapassado tanto como o V max e de K m são
igualmente reduzidos ( Figura 1.8c ). A equação da taxa é:
(1,92)
onde V max
app
e K m
app
são a V aparente max e K m dada por:
(1,93)
e

42
(1,94)
Neste caso, a constante de especificidade não é afectada pela inibição. Normalmente, o
inibidor não competitivo também tem alguma semelhança estrutural com um dos
substratos e, novamente, é muitas vezes um produto de reacção.
. Figura 1.8 . Um diagrama esquemático que mostra o efeito de inibidores reversíveis da
velocidade de reacções catalisadas por enzimas nenhuma inibição, (a) a inibição mista
([I] = K i = 0,5 K i '); inferior V max
app
(= 0,67 V max ), maior K m
app
(K = 2 m ). (B) a inibição
competitiva ([I] = K i ); V max
app
inalterada (= Vmax ), maior K m
app
(K = 2 m ). (C) inibição
não competitiva ([I] = K i '); inferior V max
app
(= 0,5 V max ) e Km
app
(K = 0,5 m ). (D) inibição
não competitiva ([I] = K i = K i '); inferior V max
app
(= 0,5 V max ), inalterada Km
app
(=
K m ).
Um caso especial de inibição não competitiva é inibição pelo substrato que ocorre em
concentrações elevadas de substrato de cerca de 20% de todas as enzimas conhecidas
(por exemplo, invertase é inibida por sacarose). Ela é causada principalmente por
ligação mais do que uma molécula de substrato para um local activo destinado a apenas
um, frequentemente por diferentes partes das moléculas de substrato que se ligam a
diferentes sublocais dentro do local de ligação ao substrato. Se o complexo resultante é
inactiva neste tipo de inibição provoca uma redução na velocidade da reacção, em
concentrações elevadas de substrato. Ele pode ser modelada pela seguinte esquema

43
[1.17]
onde:
(1,95)
A suposição é feita que ESS não pode reagir para formar o produto. Segue-se a partir
da equação ( 1.82 ) que:
(1,96)
Mesmo os valores bastante elevados para K S levam a uma estabilização da taxa de
reação em concentrações elevadas de substrato, e menores K S valores causar uma
inibição substancial ( Figura 1.9).

44
Figura 1.9. O efeito de inibição pelo substrato na taxa de uma reacção catalisada por
enzima. Uma comparação é feita entre a inibição causada pelo aumento
K S relativamente a K m . nenhuma inibição, KS / K m >> 100; K S / K m = 100; K S / K m =
10 ; K S / K m = 1. Pela natureza da ligação fazendo com que esta inibição, que é pouco
provável que K S / K m <1.
Inibição não-competitiva
Ambos os complexos e EI ESI são formadas igualmente bem (ou seja, K i é igual a
K i '). Isto ocorre quando o inibidor se liga a um local afastado do local de ligação ao
substrato, causando uma redução da taxa catalítica. É muito raramente encontrada
como um caso especial de inibição mista. A inibição fraccionada é idêntico em todas as
concentrações de substrato e não pode ser superada pelo aumento da concentração do
substrato, devido à redução em V max ( Figura 1.8d ). A equação de taxa é dada por:
(1,97)
onde V max
app
é dada por:
(1,98)
A diminuição na velocidade de reacção com o pH, descrito anteriormente, pode ser
considerado como um caso especial de inibição não-competitiva; o inibidor ser o ião
hidrogénio no lado ácido da óptimo ou o ião hidróxido no lado alcalino.
Determinação da V max e K m
É importante ter um conhecimento tão completa quanto possível das características de
desempenho das enzimas, se eles são para ser utilizados mais eficientemente. A
cinética parâmetros V max , K m , k cat / Km deve, portanto, ser determinado. Existem duas
abordagens para este problema usando a curva de progresso da reacção (método
integral) ou se as velocidades iniciais de reacção (método diferencial). Uso de qualquer
um dos métodos depende do conhecimento prévio do mecanismo para a reacção e,
pelo menos aproximadamente, as condições óptimas para a reacção. Se o mecanismo
é conhecido e complexo, em seguida, os dados devem ser reconciliados com o modelo
adequado (hipótese), geralmente por uso de uma análise computer-aided envolvendo
um ponderados mínimos quadrados. Muitos desses programas de computador estão
disponíveis no momento e, se não, a habilidade de programação envolvida é geralmente

45
bastante baixo. Se o mecanismo não é conhecido, as tentativas iniciais são geralmente
feitos para ajustar os dados para o modelo de cinética de Michaelis-
Menten. Combinando as equações ( 1.1 ) e ( 1.8 ),
(1.99)
que, na integração, usando a condição de contorno que o produto está ausente no
tempo zero e substituindo [S] por ([S] 0 - [P]), se torna
(1.100)
Se a conversão fraccionada ( X ) é introduzida, onde
(1.101)
então a equação (1.100) pode ser simplificada para dar:
(1.102)
A utilização da equação ( 1.99 ) envolve a determinação da taxa inicial de reacção
sobre uma ampla gama de concentrações de substrato. As taxas iniciais são utilizados,
de modo que [S] = [S] 0 , a predeterminada e conhecida com precisão a concentração
do substrato no início da reacção. A sua utilização também assegura que não há
nenhum efeito de reversibilidade da reacção ou inibição produto que pode afectar o
método integral com base na equação ( 1.102 ). A equação ( 1.99 ) pode ser utilizado
directamente, utilizando um programa de computador, que envolve um dos mínimos
quadrados ponderados encaixar, onde os parâmetros para determinar a relação
hiperbólica entre a velocidade inicial da reacção e da concentração inicial de substrato
(isto é. de K m e V max ) são escolhidos a fim de minimizar os erros entre os dados e o
modelo, e é feita a suposição que os erros inerentes aos dados praticamente
determinadas são normalmente distribuídas em torno do seu valor médio (livre de
erros).
Em alternativa, o enredo linear direta pode ser usado ( Figura 1.10 ). Este é um método
estatístico não paramétrico poderoso que depende da suposição de que quaisquer erros
nos dados experimentalmente derivados são tão propensos a ser positivo (ou seja,
muito alta) como negativo (ou seja, muito baixo). É prática comum para mostrar os
dados obtidos pelos métodos estatísticos acima num dos três lotes linearizadas,
derivadas a partir da equação ( 1.99 ) ( Figura 1.11 ). Destes, o lote duplo recíproco é o

46
preferido para testar a correção qualitativa de um mecanismo proposto, eo enredo
Eadie-Hofstee é o preferido para a descoberta de desvios de linearidade.
Figura 1.10. O enredo linear direta. Um gráfico da taxa inicial da reacção em função da
concentração inicial de substrato, também mostra a maneira como as estimativas
podem ser feitas directamente do K me V max . Cada par de pontos de dados pode ser
utilizada para fornecer uma estimativa independente destes parâmetros (ou seja, n (n-1)
/ 2 estimativas de pontos de dados com n diferindo [S] 0 ). Estas estimativas são
determinadas a partir das interseções das linhas que passam pelos pontos (x, y) (- [S] 0 ,
0) e (0 v,); cada intersecção formando uma estimativa separada do K m e V max . Os
cruzamentos são classificados separadamente, a fim de valor de ambos K
aumentando m e V max e os valores medianos tomadas como base as melhores
estimativas para esses parâmetros. O erro nestas estimativas podem ser simplesmente
determinadas a partir de sub-intervalos de estas estimativas, a largura da sub-gama
depende da precisão necessária para o erro e o número de pontos de dados na
análise. Neste exemplo, existem sete pontos de dados e, portanto, 21 Estimativas para
ambos K m e V max . A lista de classificação das estimativas para K m (MM) é 0.98,1.65,
1,68, 1,70, 1,85, 1,87, 1,89, 1,91, 1,94, 1,96, 1,98 , 1,99, 2,03, 2,06, 1,12, 2,16, 2,21,
2,25, 2,38 , 2,40, 2,81, com um valor médio de 1,98 mM. O K m deve estar entre as 4
(1,70 mM) e 18 (2,25 mM) estimativa em um nível de confiança de 97% (Cornish-
Bowden et al. , 1978).A lista das estimativas para V max (  m.min -1
) é classificada
separadamente como 3,45, 3,59, 3,80, 3,85, 3,87, 3,89, 3,91, 3,94, 3,96, 3,96, 3,98 ,
4,01, 4,03, 4,05, 4,13, 4,14, 4,18, 4,26, 4,29, 4,35, com um valor médio de

47
3,98  m.min -1
. O V max deve estar entre as 4 (3,85  m.min -1
) e 18 (4,18  m.min -1
)
estimativa em um nível de confiança de 97%. Pode ser visto que as estimativas
periféricas têm pouca ou nenhuma influência sobre os resultados. Esta é uma grande
vantagem sobre os procedimentos estatísticos menos quadrados, onde os pontos de
dados falsos causam efeitos fortemente tendenciosas.
Figura 1.11. Três formas em que a relação hiperbólica entre a velocidade inicial da
reacção e da concentração de substrato inicial
podem ser reorganizadas para dar parcelas lineares. Os exemplos são desenhados
usando K m = 2 mM e V max = 4 M min -1
.
(A) Lineweaver-Burk (double-recíproca) lote de 1 / v contra 1 / [S] 0 dando intercepta em
1 / V max e -1 / Km
(1.103)
(B) Eadie-Hofstee lote de v contra v / [S] 0 dando intercepta na V max e V max / K m

48
(1.104)
c) Hanes-Woolf () lote de meio recíproca de [S] 0 / v contra [S] 0 intercepta dando a K m /
V max e K m .
(1,105)

49
A curva de progresso da reacção ( Figura 1.12 ) pode ser usado para determinar a
constante de especificidade (k cat / K m ), fazendo uso da relação entre o tempo de
reacção e conversão fraccionada (ver equação ( 1.102 ). Isto tem a vantagem sobre a
utilização das taxas iniciais (acima) em que há menos determinações precisam de ser
feito, possivelmente apenas uma curva de progresso é necessária, e por vezes a
velocidade inicial da reacção é bastante difícil de determinar devido à sua rápida
descida. Se apenas a parte inicial de a curva do progresso, ou um seu derivado, é
utilizado na análise, este procedimento pode ser utilizado mesmo em casos em que há
inibição competitiva pelo produto, ou em que a reacção é reversível.

50
Figura 1.12. Um gráfico esquemático que mostra a quantidade de produto formado
(produtividade) contra o tempo de reacção, num sistema fechado. A constante de
especificidade pode ser determinada por um ajuste ponderada menos ao quadrado dos
dados para a relação dada pela equação (1.102).
O tipo de inibição e as constantes de inibição pode ser determinada a partir do efeito de
diferentes concentrações de inibidor sobre a aparente K m , V max e k cat / K m , embora
algumas parcelas mais especializados não existem (por exemplo, Cornish-Bowden,
1974 ).
Resumo e Bibliografia do Capítulo 1
a. Enzimas são catalisadores específicos de vasto alcance e utilidade.
b. A sua actividade é regulada pela sua estrutura e do ambiente físico.
c. Cuidados devem ser tomados em relação à interpretação de unidades reportados
de atividade enzimática e as condições necessárias para a máxima produtividade.
d. As enzimas podem perder a sua atividade catalítica reversível ou
irreversivelmente devido a desnaturação ou inibição, dependente das condições
e. Os valores de K m , V max , constantes de especificidade, o pH óptimo e a velocidade
de desnaturação térmica são todos de importância e utilidade para enzima
tecnologia
Referências e Bibliografia
1. Bender, ML, Kezdy, JF & Gunter, CR (1964). A anatomia de uma catálise
enzimática: . quimotripsina Journal of the American Chemical Society , 86 ,
3714-21.

51
2. Chaplin, MF (1986). Estrutura da proteína e a actividade da enzima . Oxford, UK:
IRL Press Ltd. (Este é um pacote de software CAL / simulação adequado para
IBM ou da BBC micocomputers)
3. Cornish-Bowden, A. (1974). Um método gráfico simples para determinar as
constantes de inibição de inibidores mistos, não competitivas e não-
competitivas. Biochemical Journal , 137 , 143-4.
4. Cornish-Bowden, A. (1976). Os princípios da cinética da enzima . London:
Butterworth.
5. Cornish-Bowden, A. & Endrenyi, L. (1986). Regressão robusta de dados cinéticos
da enzima.Biochemical Journal , 234 , 21-9.
6. Cornish-Bowden, A., Porter, WR & Trager, WF (1978). Avaliação dos limites de
confiança de distribuição gratuita para os parâmetros cinéticos da enzima. Journal
of Theoretical Biology , 74 , 163-75.
7. Crompton, IE & Waley, SG (1986). A determinação das constantes de
especificidade em reacções catalisadas por enzimas. Biochemical Journal , 239 ,
221-4.Eisenthal, R. & Cornish-Bowden, A. (1974). O enredo linear
direta. Biochemical Journal , 139 , 715-20.
8. Fersht, A. (1985). A enzima e estrutura mecanismo , 2a ed, Nova Iorque:
WHFreeman & Co.Henderson, PJF (1978). A análise estatística dos dados
cinéticos da enzima. Techniques nas ciências da vida, Bioquímica vol. B1 / 11,
Técnicas em proteínas e enzimas bioquímica - parte 2. pp B113 / 1-41,
Amsterdam: Elsevier / North-Holland Biomedical Press.
9. Henley, JP & Sadana, A. (1985). Categorização de desativações de enzimas que
utilizam um mecanismo do tipo série. Enzyme e Microbial Tecnologia , 7 , 50-60.
10.Hill, CM, Waight RD & Bardsley, WG (1977). Será que qualquer enzima seguir a
equação de Michaelis-Menten? Molecular e Cellullar Biochemistry , 15 , 173-8.
11.Koshland, DE Jr. (1962). A comparação das velocidades de reação não
enzimáticas e enzimáticos.Journal of Theoretical Biology , 2 , 75-86.
12.Michaelis, L. & Menten, ML (1913). A cinética da ação invertin. Biochemische
Zeitschrift , 49 , 333-69.
Fontes de enzimas
Biologicamente enzimas activas podem ser extraídos a partir de qualquer organismo
vivo. Uma ampla gama de fontes são usadas para a produção de enzima comercial
de Actinoplanes para Zymomonas , do espinafre para veneno de cobra. Dos cem ou
mais enzimas sendo usado industrialmente, mais de metade são de fungos e leveduras
e mais de um terço são de bactérias com o restante dividido entre animais (8%) e planta
(4%) fontes ( Tabela 2.1 ). Uma muito maior número de enzimas podem ser utilizados
na análise química e diagnóstico clínico. As fontes não microbianas proporcionar uma
proporção maior destas, no momento presente. Os micróbios são preferidos para
plantas e animais, como fontes de enzimas, porque:
1. eles são geralmente mais baratos de produzir.

52
2. seu conteúdo de enzimas são mais previsíveis e controláveis,
3. fornecimento regular de matéria-prima de composição constante são mais
facilmente arranjado, e
4. tecidos vegetais e animais contêm materiais mais nocivos do que os micróbios,
incluindo phecompostos nolic (de plantas), inibidores de enzimas endógenas e
proteases.
Estão sendo feitas tentativas para superar algumas destas dificuldades com o uso de
cultura de células animais e vegetais.
Tabela 2.1 . Algumas enzimas industriais importantes e suas fontes.
Enzyme um Número
CEb Fonte
Intra / extra
CELULARESc
Escala de
produção d
Utilização
industrial
Enzimas de Animais
Catalase 1.11.1.6 Fígado Eu - Comida
Chymotrypsin 3.4.21.1 Pâncreas E - Couro
Lipase e 3.1.1.3 Pâncreas E - Comida
Coalho f 3.4.23.4 Abomaso E + Queijo
Tripsina 3.4.21.4 Pâncreas E - Couro
Enzimas de plantas
Actinidin 3.4.22.14 Kiwis E - Comida
amilase 3.2.1.1 Cevada maltada E +++ Preparação
-amilase 3.2.1.2 Cevada maltada E +++ Preparação
Bromelina 3.4.22.4 Latex Pineapple E - Preparação
-glucanase g 3.2.1.6 Cevada maltada E ++ Preparação
Ficina 3.4.22.3 Latex Fig E - Comida
Lipoxigenase 1.13.11.12 Soja Eu - Comida
Papaína 3.4.22.2 Latex Mamão E ++ Carne
Enzimas bacterianas
amilase 3.2.1.1 Bacilo E +++ Amido
-amilase 3.2.1.2 Bacilo E + Amido
Asparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli Eu - Saúde
A glicose isomerase h 5.3.1.5 Bacilo Eu ++
Xarope de
frutose
A penicilina amidase 3.5.1.11 Bacilo Eu - Farmacêutico
Proteasei 3.4.21.14 Bacilo E +++ Detergent
Pullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella E - Amido
Fungal enzymes

53
amilase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ Baking
Aminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus Eu - Farmacêutico
Glucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ Amido
Catalase 1.11.1.6 Aspergillus Eu - Comida
Cellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - Waste
Dextranase 3.2.1.11 Penicillium E - Comida
Glucose oxidase 1.1.3.4 Aspergillus Eu - Comida
Lactasel 3.2.1.23 Aspergillus E - Dairy
Lipase e 3.1.1.3 Rhizopus E - Comida
Rennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ Queijo
Pectinasen 3.2.1.15 Aspergillus E ++ Drinks
Pectin lyase 4.2.2.10 Aspergillus E - Drinks
Proteasem 3.4.23.6 Aspergillus E + Baking
Raffinaseo 3.2.1.22 Mortierella Eu - Comida
Yeast enzymes
Invertasep 3.2.1.26 Saccharomyces I/E - Confectionery
Lactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - Dairy
Lipase e 3.1.1.3 Candida E - Comida
Raffinaseo 3.2.1.22 Saccharomyces Eu - Comida
a Os nomesde usocomum são dadas.Comoa maioriadasenzimasindustriaissãoconstituídospormisturasde
enzimas,estesnomespodemvariarem relaçãoaosnomesrecomendadosde seucomponenteprincipal.Sempreque
necessário,osnomesrecomendadosdestecomponente principalé dadoabaixo.
B, o númeroCE do componente principal.
c I - enzimaintracelular;E- enzimaextracelular.
d +++> 100 ton ano-1; ++> 10 ton ano-1;+> 1 ton ano-1;- <1 ton ano-1.
e triacilglicerol lipase;
f quimosina;

54
g endo-1,3(4) -b-glucanase;
h xilose isomerase;
i subtilisina;
j-dextrinaumaendo-1,6-a-glucosidase;
k 1,4-glucanoum-glicosidase;
l b-galactosidase;
m proteinase aspárticamicrobiana;
n poligalacturonase;
o a-galactosidase;
p b-frutofuranosidase.
Na prática,a grande maioriadasenzimasmicrobianasvirde umnúmeromuitolimitadode géneros,espéciesde
Aspergillus,que asespéciesde Bacilluse Kluyveromyces(tambémchamadoSaccharomyces) espéciespredominantes.
A maioriadasestirpesutilizadas,quertenhamsidoempregadaspelaindústriade alimentospormuitosanosouque
tenhamsidoderivadosdessascepaspormutaçãoe seleção.Existemmuitopoucosexemplosdautilizaçãoindustrialde
enzimasque têmsidodesenvolvidosparaumatarefa.Brilhantesexemplosde taisempreendimentossãoa produção
de xarope de alta frutose utilizandoisomerase glucose e àutilizaçãode pullulanasenahidrólisedoamido.
Os produtoresde enzimasindustriaise seusclientesirãocompartilharosobjetivoscomunsdaeconomia,eficáciae
segurança.Elesvãoquererter estirpesde altorendimentode micróbiosque fazemaenzimaconstitutivae segregam-
loem seumeiode crescimento(enzimasextracelulares).Se aenzimanãoé produzidaconstitutivamente,de indução
temde serrápidae barata. Produtoresprocuraráutilizarcepasde micróbioque sãoconhecidosporseremgeralmente

55
seguro.Osusuáriosvãopagar poucoemconta a maneiraemque a enzimaé produzida,masvai insistiremter
preparaçõesque têmumaactividade conhecidae manteressaatividadeporlongosperíodos,armazenadosà
temperaturaambiente oucomrefrigeraçãode rotina.Elesdãopoucaatençãopara a pureza da preparaçãode enzima,
desde que ele nãocontémmateriais(ouenzimas) que nãointerfiramcomoseuprocesso.Osprodutorese os usuários
vão quererteras enzimasemformasque apresentamumriscomínimopara aquelesque manipulam-losouconsumir
seuproduto.
O desenvolvimentode enzimascomerciaisé umaempresaespecializadaque é geralmenterealizadaporumpunhado
de empresasque têmaltashabilidadesem
o rastreiode enzimasnovase melhoradas,
de fermentaçãoparaa produçãoda enzima,
purificaçõesgrandesenzimaescala,
formulaçãode enzimasparavenda,
ligaçãodo cliente,e
lidandocomas autoridadesreguladoras.
Triagem para novas enzimas
Se a reacção é termodinamicamente possível, é provável que exista uma enzima que é
capaz de catalisar ele. Uma das principais habilidades de empresas de enzimas e
laboratórios acadêmicos devidamente financiados é a triagem rápida e eficaz em termos
de custos de culturas microbianas para atividades enzimáticas. Amostras naturais,
geralmente solo ou material de composto encontrado perto altas concentrações de
substratos susceptíveis, são usados como fontes de culturas. Não é incomum em
congressos internacionais de tecnólogos de enzimas para ver representantes de
empresas de enzimas coletando amostras de solo a ser exibido mais tarde, quando eles
retornam para seus laboratórios.
A primeira fase do processo de triagem para as enzimas comerciais é o despiste de
ideias, isto é, para determinar a necessidade comercial potencial para uma nova
enzima, para estimar a dimensão do mercado e decidir, aproximadamente, a quantidade
de potenciais utilizadores do enzima será capaz para dar ao luxo de pagar por isso. Em
alguns casos, a determinação do valor potencial de uma enzima não é fácil, por
exemplo, quando pode ser utilizado para produzir uma substância totalmente
inovadora. Em outros casos, por exemplo quando a nova enzima poderia ser usado
para melhorar um processo existente, o seu valor potencial podem ser avaliadas em

56
termos de forma muito precisa. Em ambos os casos, um fluxo de caixa acumulado deve
ser estimado, equilibrando a triagem e de capitais de investimento custos iniciais
incluindo juros, responsabilidade fiscal e depreciação, contra os lucros esperados a
longo prazo.Conta total deve ser feita de inflação, da variação de preço de matéria-
prima e fonte, publicidade e outros custos projetados. Além disso, a probabilidade de
concorrência de mercado potencial e as mudanças nos fatores políticos ou legais devem
ser considerados. Normalmente, a sensibilidade do projecto para mudanças em todas
estes factores devem ser estimado, por conjecturas informado, a fim de avaliar o factor
de risco envolvido. Re-avaliação financeira deve ser frequentemente realizadas durante
o processo de desenvolvimento para verificar se ele ainda constitui uma utilização
eficiente dos recursos.
Se o acordo for alcançado, provavelmente depois de discussões com potenciais
utilizadores, que o trabalho experimental seria comercialmente justificável, a próxima
etapa envolve a localização de uma fonte da enzima necessária. O trabalho do
laboratório é caro em mão de obra de forma tão clara, vale a pena usar todas as bases
de dados disponíveis para procurar menção da enzima na literatura acadêmica e
patentes. As culturas podem então ser procurada de todas as fontes de modo
reveladas. Algumas preparações de enzimas comerciais são fontes muito ricas de
outros do que a enzima que está sendo oferecido para venda, revelando tais
preparações como potenciais fontes de baixo custo que vale a pena investigar enzimas.
Se essas primeiras pesquisas não forem bem sucedidos, é provável que seja
necessário para triagem de novas estirpes de microrganismos capazes de realizar a
transformação necessária. Isso não deve ser uma tela de "cega": normalmente haverá
alguma fonte de micróbios que poderiam ter sido expostas por incontáveis gerações
com as condições que a nova enzima deve suportar ou a produtos químicos que é
obrigada a modificar. Assim, thermophiles são procurados em fontes termais,
osmophiles em fábricas de açúcar, organismos capazes de metabolizar conservantes de
madeira nos pátios de madeira e assim por diante. Um exemplo clássico de detecção de
uma enzima por rastreio inteligente foi a descoberta de uma enzima degradadora de
cianeto comercialmente útil nos micróbios patogénicos de plantas que contêm glicósidos
cianogénicos.
A identificação de uma fonte microbiana de uma enzima é de modo algum o fim da
história. As propriedades da enzima deve ser determinada; ou seja, a temperatura
óptima para a produtividade, o perfil de estabilidade da temperatura, pH óptimo e
estabilidade, constantes cinéticas (K m , V max ), se houver substrato ou a inibição do
produto, e a capacidade para resistir a componentes de matéria-prima esperado, além
do substrato. Uma equipe de cientistas, engenheiros e contabilistas devem então
considerar os próximos passos. Se qualquer um desses parâmetros é insatisfatório, a
tela deve continuar até que as enzimas melhoradas estão localizados. Agora que a
engenharia de proteínas (ver Capítulo 8) pode ser seriamente contemplada, uma
enzima com valor potencial suficiente poderia ser melhorado "desde a concepção" para
superar uma ou duas falhas. No entanto, isso levaria muito tempo, no nível atual de

57
conhecimento e habilidade, de modo ainda mais a triagem de micróbios a partir de
fontes selecionadas provavelmente seria considerado mais vantajoso.
Uma vez que uma enzima com propriedades adequadas tenha sido localizada, várias
decisões devem ser feitas em relação à aceitabilidade do organismo para as
autoridades reguladoras, a produtividade do organismo, e o modo pelo qual a enzima é
para ser isolado, utilizado (livre ou imobilizada) e, se necessário, purificado. Se o
organismo é inaceitável do ponto de vista regulatório existem duas opções;para eliminar
esse organismo completo e continuar a operação de crivação, ou para clonar a enzima
num organismo aceitável. A última abordagem é cada vez mais atraente, especialmente
como a clonagem também pode ser utilizado para aumentar a produtividade do
processo de fermentação. A clonagem também pode ser atraente quando o organismo
originalmente produzir a enzima é aceitável do ponto de vista da saúde e segurança,
mas cuja produtividade é inaceitável (ver Capítulo 8). No entanto, ainda não é a
clonagem de rotina e bem-sucedidos por isso ainda é uma excelente caso a ser feito por
aplicação de técnicas de mutação e de isolamento convencionais para a selecção das
estirpes melhoradas. Deve notar-se que, embora a tecnologia para a clonagem de
isomerase de glucose em organismos de rotina '' é conhecido, que ainda não tenha sido
aplicada. Várias das preparações isomerase de glicose utilizados comercialmente
consistem de células inteiras, ou fragmentos de células, das estirpes seleccionadas de
espécies detectada originalmente por despistagem.
O uso de enzimas imobilizadas (ver Capítulo 3 ) já está familiarizado com a indústria e
as suas vantagens são bem reconhecidos por isso a praticidade de usar as novas
enzimas de forma imobilizado será determinada no início do procedimento de
triagem. Se o enzima é produzido intracelularmente, a viabilidade do uso sem
isolamento e purificação serão seriamente considerada e estirpes seleccionadas pela
sua receptividade para usar neste modo.
Ressalta-se que haverá um diálogo constante entre os cientistas de laboratório e
engenheiros de processos bioquímicos desde as primeiras fases do processo de
seleção. Uma vez que os engenheiros bioquímicos estão convencidos de que os seus
critérios iniciais de produtividade, atividade e estabilidade podem ser cumpridas, a cepa
selecionada (s) de micróbio serão cultivadas em condições de planta piloto.É somente
através da aplicação do tipo de equipamento utilizado em plantas em escala real que
precisa custeio de processos podem ser alcançados. Estudos-piloto provavelmente irá
revelar as imperfeições, ou pelo menos as áreas de ignorância, que deve ser corrigido
na escala de laboratório. Se isso for possível, a planta piloto irá produzir amostras da
preparação de enzima a ser utilizada por clientes que pode muito bem ser também na
fase de instalação piloto para o desenvolvimento do processo de utilização de enzima. A
planta piloto enzima também produz amostras para estudos toxicológicos e de
segurança, desde que o processo de piloto é exactamente similar ao da operação em
grande escala.

58
Triagem para novas enzimas é caro para que a propriedade intelectual gerados devem
ser protegidos contra cópia pelos concorrentes. Isto é geralmente feito por patentear a
enzima ou o seu método de produção ou, de forma mais útil, o processo no qual é para
ser utilizado. Patenteamento será iniciada logo que há evidências de que uma
descoberta inovadora foi feita.
Mídia para a produção da enzima
Descrição detalhada do desenvolvimento e utilização de fermentadores para o cultivo
em grande escala de microrganismos para a produção da enzima está fora do âmbito
deste volume, mas o uso de meios de comunicação menção é apropriado porque este
tem uma influência sobre o custo da enzima e porque os componentes dos meios
frequentemente encontrar seu caminho em preparações de enzimas
comerciais.Detalhes de componentes utilizados em caldos de fermentação à escala
industrial para a produção da enzima não são prontamente obtidos. Isso não é
inesperado, pois os fabricantes não têm nenhum desejo de revelar informações que
possam ser de valor técnico ou comercial para os seus concorrentes. Além disso,
alguns componentes de suporte pode ser alterada de lote para lote quanto a
disponibilidade e custo de, por exemplo, matérias-primas de hidrato de carbono
alterado. Tais mudanças se revelam em diferenças muitas vezes bastante profundas na
aparência de lote para lote de uma única enzima de um único produtor. Os efeitos das
variações de matérias-primas deve ser considerado em relação ao tratamento a
jusante. Se esta variabilidade é susceptível de reduzir significativamente a eficiência da
metodologia padrão, pode ser económico utilizar um meio definido mais caros da
composição facilmente reprodutível.
Media claramente definidos geralmente estão fora de questão para o uso em larga
escala por razões de custos, mas pode ser perfeitamente aceitável quando as enzimas
são produzidas para fins de alto valor, tais como análise ou terapia médica onde
preparações muito puras são essenciais. Meios complexos menos definidos são
compostos de ingredientes seleccionados com base no custo e disponibilidade, bem
como a composição. Os resíduos e subprodutos das indústrias alimentares e agrícolas
são muitas vezes os principais ingredientes. Assim, melaço, licor de milho, destilados
solúveis e farelo de trigo são importantes componentes de meios de fermentação que
fornecem carboidratos, minerais, nitrogênio e algumas vitaminas. Hidratos de carbono
extra é normalmente fornecido como amido, por vezes, refinado, mas muitas vezes
simplesmente como grãos de cereais chão. Sais de farelo de soja e de amônio são
frequentemente utilizadas fontes de nitrogênio adicional. A maior parte destes materiais
variam em qualidade e composição de lote para lote, causando alterações na
produtividade enzima.
Preparação de enzimas

59
Os leitores de trabalhos relacionados com a preparação de enzimas para fins de
investigação estarão familiarizados com as tabelas que detalham as etapas de
purificação. Muitas vezes, a enzima pode ser purificada a várias centenas de vezes mas
o rendimento da enzima pode ser muito fraca, muitas vezes abaixo de 10% da
actividade do material inicial ( Tabela 2.2 ). Em contraste, as enzimas industriais será
purificado tão pouco quanto possível, as únicas outras enzimas e materiais que possam
interferir com o processo a que a enzima é o de catalisar, vai ser removido. Purificação
desnecessário será evitado como cada etapa adicional é dispendiosa em termos de
equipamentos, mão de obra e perda de atividade enzimática. Como resultado, algumas
preparações enzimáticas comerciais consistem essencialmente de caldo concentrado
da fermentação, além de aditivos para estabilizar a actividade da enzima.
Tabela 2.2 . O efeito do número de passos na produção e custos de um processo de
purificação típico enzima. As hipóteses realistas são feitos que os rendimentos da etapa
são de 75%, purificações passo são os custos de três vezes e step são 10% dos custos
iniciais (mais tarde etapas de purificação geralmente são intrinsecamente mais caros,
mas são necessariamente de menor escala).
Passo
Peso
relativo
Rendimento
(%)
A actividade
específica
Custo
total
Custo por
peso
Custo por
atividade
1.000 100 1 1.00 1 1.00
1 0.250 75 3 1.10 4 1,47
2 0,063 56 9 1.20 19 2.13
3 0,016 42 27 1.30 83 3.08
4 0,004 32 81 1,40 358 4,92
5 0,001 24 243 1.50 1536 6,32
O teor de enzima necessária deve ser tão alta quanto possível (por exemplo, 10% w / w
da proteína), a fim de facilitar a tarefa de processamento a jusante. Isto pode ser
conseguido através do desenvolvimento das condições de fermentação ou, muitas
vezes, mais dramaticamente, por engenharia genética. Pode muito bem ser
economicamente viável para passar algum tempo clonagem cópias extras do gene
necessário juntamente com um poderoso promotor de volta para o organismo produzir a
fim de obter 'over-produtores "(ver Capítulo 8).
É importante que a actividade máxima é retido durante a preparação de
enzimas. Inactivação do enzima pode ser causada pelo calor, de proteólise, o pH sub-
óptimo, oxidação, desnaturantes, inibidores irreversíveis e perda de cofactores ou
coenzimas. Destes inactivação pelo calor, que, em conjunto com os efeitos de pH
associados, é provavelmente a mais significativa. É provável que ocorra durante a
extração e purificação da enzima se refrigeração insuficiente está disponível

60
(ver Capítulo 1 ), mas o problema é menor quando se prepara enzimas termófilas. A
proteólise é mais provável de ocorrer nas primeiras fases de extracção e purificação em
que as proteases responsáveis para o volume de proteína em células vivas ainda estão
presentes. É também a razão principal para a inactivação da enzima por contaminação
microbiana. Nas suas conformações nativas, enzimas têm domínios altamente
estruturadas, que são resistentes ao ataque por proteases, porque muitos dos ligações
peptídicas são inacessíveis mecanicamente e porque muitas proteases são altamente
específicos. As chances de uma ligação peptídica suscetíveis em um domínio
estruturado estar disponível para o ataque protease são baixos. '' Entalhes individuais
por proteases nestas circunstâncias podem ter pouco efeito imediato sobre a
conformação da proteína e, por conseguinte, a actividade. O efeito, no entanto, podem
reduzir severamente a estabilidade conformacional da enzima ao calor ou a variação do
pH o que reduz grandemente a sua estabilidade operacional. Se o domínio é
desdobrada sob estas condições alteradas, toda a cadeia de polipéptido pode estar
disponível para a digestão enzimática e o mesmo, específico, a protease pode destruí-
lo. É evidente que a melhor maneira de prevenir a proteólise é remover rapidamente, ou
inibir, a atividade da protease. Antes isto pode ser conseguido é importante para manter
as preparações enzimáticas frio para manter a sua conformação nativa e retardar
qualquer acção de proteases que podem ocorrer.
Algumas enzimas intracelulares são utilizados comercialmente, sem isolamento e
purificação, mas a maioria das enzimas comerciais são produzidos extracelularmente
pelo micróbio ou planta ou devem ser libertados a partir das células em solução e
posteriormente tratados ( Figura 2.1 ). Separação sólido / líquido é geralmente
necessário para a separação inicial da massa celular, a remoção de detritos celulares
após a ruptura das células e a recolha dos precipitados. Isto pode ser conseguido por
filtração, centrifugação ou partição bifásica aquosa. Em geral, a filtração e sistemas
bifásicos aquosos são usadas para remover as células não desejadas ou detritos
celulares enquanto que a centrifugação é o método preferido para a recolha de material
sólido necessário.
Figura 2.1. Diagrama de fluxo para a preparação de enzimas.

61
Centrifugação
A centrifugação separa com base no tamanho de partícula e a diferença de densidades
entre as fases líquida e sólida. A sedimentação do material num campo centrífugo pode
ser descrito pela
(2,1)
em que v é a taxa de sedimentação, d é o diâmetro da partícula, ρ s é a densidade da
partícula, ρ l é a densidade da solução,  é a velocidade angular em radianos s -1
, r é o
raio de rotação,  é a dinâmica viscosidade, F s é um fator de correção para a interação
de partículas durante a colonização dificultado e é um fator de forma (= 1 para

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