necesario para cualquier ingeniero agricola

1. III.-Capítulo 2 barrera que normalmente impide la fusión
entre ellas. Por ello, la obtención de plantas
híbridas somáticas requiere del previo aisla-
Hibridación somática miento de protoplastos mediante la diges-
tión enzimática de las paredes celulares, para
Polci, Pablo; Friedrich, Pablo luego proceder a la fusión de protoplastos
de distintos tipos parentales (distintos
1 Introducción genotipos) y posterior regeneración de plan-
tas a partir de los productos de fusión. La
La mejora genética de las plantas cultiva- hibridación somática en plantas comenzó a
das en procura de incrementar la producción desarrollarse a principios de 1970 con la apli-
viene siendo practicada por el ser humano cación de métodos químicos de fusión, y se
desde hace miles de años, seguramente des- extendió en los ´80 con el empleo de méto-
de el inicio mismo de la agricultura. Para ello, dos de electrofusión.
el hombre ha empleado los cruzamientos con Es relevante destacar que, a los fines del
el fin de incrementar la variabilidad genética, mejoramiento genético, el sistema de
paso inicial en el proceso de mejoramiento. protoplastos no sólo se emplea para la ob-
De esta manera la hibridación entre especies tención de híbridos somáticos, sino que tam-
diferentes permitió aumentar de modo sig- bién constituye un material apropiado para
nificativo la productividad de diversos culti- la incorporación de ADN exógeno. Asimismo,
vos, como por ejemplo los cereales. Sin em- la fusión de protoplastos tiene un uso mu-
bargo, en otros cultivos esta estrategia no cho más amplio que el estrictamente de in-
resultó exitosa a causa de esterilidad sexual terés agronómico; en tal sentido, es de gran
o incompatibilidad genética. utilidad en estudios de biología celular así
La hibridación somática, es decir, la ob- como para otras aplicaciones biotecnológicas,
tención de plantas híbridas a partir de la fu- por ejemplo, la producción de anticuerpos
sión de células o de protoplastos derivados monoclonales.
de células somáticas, surgió hace unos 30 años
como una herramienta muy promisoria para 2 Hibridación somática vs. hibridación
sortear problemas de incompatibilidad sexual
precigótica.
Con relación a su potencialidad para pro-
Esta técnica, si bien presenta algunas li-
ducir híbridos, existen diferencias importan-
mitaciones, como una elevada esterilidad o
tes entre la fusión de protoplastos somáticos
imposibilidad de regenerar plantas en algu- y el cruzamiento sexual:
nos casos, demostró ser útil en la mejora • La hibridación sexual entre organismos
genética de plantas, principalmente por per- de diferentes especies está limitada por ba-
mitir la introgresión limitada de genes de es- rreras de incompatibilidad. En algunos casos
pecies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por estas barreras son precigóticas, es decir, no
ejemplo, cuando se quiere transferir resisten- permiten que se produzca la fecundación. Tal
cia a enfermedades o tolerancia a estreses. limitación no existe en la fusión de
También permite la obtención de citoplasmas protoplastos, dado que este proceso es no-
híbridos (cíbridos). La hibridación asimétrica específico, permitiendo la fusión de células de
y cibridización sirve como puente para la orígenes muy diversos, incluso de organismos
transferencia de genes individuales muy distanciados filogenéticamente (por
La técnica de fusión de protoplastos se ejemplo, células animales y vegetales). Ello no
desarrolló en la década de 1950-60, a partir significa que pueda regenerarse un organis-
de la observación de que ciertos virus pue- mo viable y fértil a partir de cualquier tipo de
den inducir la fusión de células animales. Sin combinación entre células. De hecho, la bús-
embargo, recién en la década de 1980-90 tuvo queda de híbridos de interés agronómico ha
un mayor auge debido a la aparición de mé- demostrado que el principal aporte de esta
todos químicos y eléctricos más apropiados metodología es la introgresión, en los culti-
para la fusión de células vegetales. La pared vos, de genes provenientes de plantas silves-
presente en estas células representa una tres emparentadas.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 97

2. • ·La hibridación sexual ocurre normal- bridación somática pero no por transforma-
mente por fusión de células haploides (n + ción genética. Sin embargo, en la actualidad,
n), mientras que en la hibridación somática con las nuevas herramientas aportadas por
se fusionan dos protoplastos con sus la genómica se está avanzando en el conoci-
genomas completos (2n + 2n) o con uno de miento de todos los genes involucrados en
ellos conteniendo sólo parte de su genoma. diversas vías metabólicas. Estos podrían ser
• ·Otra diferencia está dada por la heren- transferidos en conjunto vía transgénesis.
cia de los genes extranucleares, esto es,
plastídicos y mitocondriales. Mientras que en 4 Tipos de híbridos somáticos
la reproducción sexual el genoma
citoplasmático es aportado casi exclusiva- Cuando se realiza la fusión de protoplas-
mente por la gameta femenina, en la hibri- tos se obtienen células con el aporte de
dación somática se combinan organelas de cromosomas de dos o más núcleos (Fig.1.) Si
ambos progenitores, produciendo nuevas los protoplastos involucrados en la fusión
proceden de distintos tipos parentales se
combinaciones de genes citoplasmáticos.
originan «heterocariones», y si proceden del
mismo tipo parental se originan «homoca-
3 Hibridación somática vs.
riones». Cuando en el heterocarión ocurre
transformación genética la fusión de los núcleos (cariogamia), se for-
ma una «célula híbrida».
La preponderancia que han tomado las A partir de una célula híbrida, que contie-
técnicas de transformación genética ha rele- ne dos genomas completos, se puede rege-
gado a la hibridación somática a un papel de nerar una planta que, según cual haya sido
menor significación como herramienta el destino del material genético nuclear du-
biotecnológica aplicada al mejoramiento de rante las divisiones celulares que siguen a la
los cultivos. Comparando ambas metodolo- fusión, puede ser de tres tipos:
gías, podemos destacar las siguientes diferen- 1. Híbrido simétrico, que tiene el
cias: genoma nuclear completo de cada tipo
• En la transformación genética se incor- parental.
poran uno o pocos genes exógenos en una 2. Híbrido asimétrico, que tiene el
planta, mientras que en la hibridación genoma nuclear completo de uno de los
somática el número de genes introducidos parentales y sólo una parte del genoma nu-
es mayor dado que se transfieren clear del otro parental.
cromosomas de una especie a
otra o se combinan dos
genomas completos.
• La hibridación somática
permite transferir caracteres sin
necesidad de contar con un co-
nocimiento detallado de los me-
canismos moleculares que deter-
minan la expresión de dichos ca-
racteres. Por el contrario, la trans-
formación genética requiere la
previa identificación y aislamien-
to de los genes que determinan
la expresión del carácter de inte-
rés.
• Caracteres tales como pro-
ductividad, tolerancia a ciertos ti-
pos de estrés, resistencia hori-
zontal a enfermedades y otros
son poligénicos, por lo que su Fig. 1. Destino del material genético nuclear y extranuclear en la fusión
transferencia es factible por hi- de protoplastos.
98 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

3. 3. Cíbrido, que contiene el genoma nu- con un protoplasto enucleado o con su nú-
clear completo de uno de los parentales, re- cleo inviable. Los protoplastos enucleados o
teniendo sólo material genético extranuclear citoplastos pueden obtenerse centrifugando
del otro parental. los mismos a alta velocidad en un gradiente
de densidad isosmótico. Asimismo, el méto-
Es usual que en el proceso de regenera- do de irradiación con rayos X o Gamma pue-
ción de plantas híbridas ocurra una elimina- de generar cíbridos en casos en que se pro-
ción gradual de cromosomas de uno de los duzca la eliminación total de los fragmentos
tipos parentales, produciéndose de este cromosómicos. Los protoplastos que poseen
modo híbridos asimétricos o cíbridos. La prác- su genoma nuclear completo (receptores),
tica de la hibridación somática en plantas pueden ser tratados previamente con
demostró que, en general, los híbridos inhibidores metabólicos. En este caso sólo
asimétricos y cíbridos son más valiosos que pueden sobrevivir, por complementación
los simétricos producidos entre plantas ale- metabólica, los heterocariones conteniendo
jadas filogenéticamente. Por esta razón se el núcleo del receptor y el citoplasma del do-
han desarrollado métodos para inducir la hi- nante enucleado.
bridación asimétrica o cibridación, alterando
el genoma de uno de los protoplastos La segregación de los plástidos y
parentales. En este caso se dice que se trans- mitocondrias de los dos tipos parentales tam-
fiere parte del genoma de un protoplasto bién constituye una fuente importante de
donante a uno receptor. Por lo tanto, tenien- variabilidad en la regeneración de plantas
do en cuenta el material de partida emplea- híbridas. Es frecuente que ocurran
do para la fusión, pueden producirse tres ti- recombinaciones de los genomas mitocon-
pos de células híbridas: driales de ambos tipos parentales, pero ello
es poco común entre plástidos. Dado que las
1. Células híbridas simétricas, por fusión organelas segregan independientemente
de dos protoplastos con sus genomas com- unas de otras, la regla es que al cabo de po-
pletos. cas divisiones mitóticas las células formadas
2. Célula híbrida asimétrica, por fusión contengan plástidos provenientes de uno u
de un protoplasto conteniendo su genoma otro tipo parental. Así, una célula híbrida ori-
completo con otro conteniendo su núcleo gina una colonia de células que exhiben dife-
inviable o sólo una parte de su genoma nu- rentes combinaciones de genes citoplasmá-
clear. Los protoplastos donantes son irradia- ticos, pero con una mayor frecuencia de célu-
dos con rayos X o Gamma, lo que provoca la las que poseen mitocondrias recombinantes
fragmentación de los cromosomas. Una vez y plástidos de uno u otro tipo parental. El
producida la fusión, dichos fragmentos tien- destino que sufre el material genético nuclear
den a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero y extranuclear durante las divisiones celula-
algunos de ellos pueden integrarse con el res determina que, a partir de una población
genoma del receptor produciendo un híbri- de células híbridas similares, se puedan rege-
do asimétrico. El tratamiento de irradiación nerar plantas con diferentes combinaciones
parece no tener efectos deletéreos o de genes nucleares, plastídicos y mitocon-
mutagénicos sobre los genomas de driales.
organelas, probablemente debido a que La Figura 2 muestra un esquema de las
cada célula posee varias copias de ellas. Tam- etapas involucradas en la hibridación
bién puede producirse una célula híbrida somática, las cuales son tratadas a continua-
asimétrica fusionando protoplastos recepto- ción.
res con microprotoplastos, conteniendo uno
o pocos cromosomas. Los microprotoplastos 5 Aislamiento de protoplastos
se obtienen induciendo la formación de
micronúcleos por tratamientos con agentes El desarrollo de métodos enzimáticos de
antimicrotúbulos. aislamiento a partir de 1960 brindó la posibi-
3. Cíbridos, por fusión de un protoplasto lidad de obtener grandes cantidades de
conteniendo su genoma nuclear completo protoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 99

4. establecerse en forma empírica las
condiciones óptimas para un sistema
determinado. Las etapas del aisla-
miento y los factores a considerar en
cada una de ellas se describen a con-
tinuación:
1. Selección del material de
partida. Influye en el resultado del
aislamiento así como en el proceso
de regeneración posterior. General-
mente se emplean hojas y células en
cultivo líquido o sólido. Cuando se
emplean hojas, la edad y las condi-
ciones de cultivo de la planta afectan
el rendimiento. Se obtienen mejores
resultados con hojas jóvenes total-
mente expandidas que con hojas vie-
jas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contac-
to de las enzimas con las células, las
hojas suelen cortarse en trozos pe-
queños, muy finos en el caso de las
monocotiledóneas. Algunas veces se
extrae la epidermis inferior antes de
colocar la hoja en la solución
Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridación enzimática, como sucede con las
somática.
dicotiledoneas. Cuando se emplean
cia en diferentes áreas de la biología y la células en suspensión, se obtienen mejores
biotecnología de plantas, dada la utilidad de resultados si se encuentran en la fase
los protoplastos como sistema experimental exponencial de crecimiento.
para estudios fisiológicos, bioquímicos y 2. Tratamiento enzimático. La concentra-
moleculares, así como para su aplicación al ción de la enzima y el tiempo de incubación
mejoramiento genético. requeridos para lograr la liberación de los
Los protocolos de aislamiento emplean protoplastos dependen del producto comer-
enzimas fúngicas con actividad celulasa y cial utilizado. El pH generalmente se ajusta
pectinasa, siendo necesario en algunos casos en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura en-
el agregado de hemicelulasas. Las celulasas y tre 25 y 30º C. La duración del tratamiento
hemicelulasas degradan la pared celular, en enzimático y la relación volumen de solución/
tanto que las pectinasas digieren la matriz cantidad de tejido influyen en el rendimien-
de pectina que mantiene adheridas a las cé- to. Durante el aislamiento se produce la lisis
lulas. El uso de enzimas disponibles comer- de algunas células, que liberan enzimas
cialmente posibilitó el aislamiento de hidrolíticas y compuestos oxidantes que pue-
protoplastos de prácticamente cualquier te- den dañar los protoplastos, por lo que se
jido vegetal, siempre que el mismo no esté suelen agregar inhibidores de proteasas y
lignificado. Se ha podido aislar protoplastos antioxidantes tales como el Polivinilpirroli-
de una gran cantidad de especies vegetales dona-10. El agregado de un estabilizador
y regenerar plantas a partir de los mismos, osmótico a la solución enzimática es esencial
permitiendo el uso de este sistema para la para evitar la ruptura de los protoplastos a
propagación clonal y la modificación genética medida que son liberados, siendo más esta-
de plantas. bles si la solución es ligeramente hipertónica.
El número de protoplastos aislados, su Para ello se utilizan solutos osmóticamente
viabilidad y la pureza de la suspensión obte- activos, comúnmente manitol o sorbitol, en
nida dependen de varios factores, debiendo concentraciones que varían entre 0,3 a 0,8
100 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

5. 6 Métodos de fusión
6.1 Métodos químicos
Los primeros casos informados de fusión
controlada y reproducible de protoplastos
vegetales y de regeneración de híbridos
somáticos se produjeron a principios de la
década de 1970, empleando nitrato de sodio
como agente fusógeno. La frecuencia de for-
mación de heterocariones en tales casos era
muy baja. Posteriormente, se lograron me-
jores resultados fusionando protoplastos de
células del mesófilo de Nicotiana en un me-
dio conteniendo alta concentración de Ca++
(50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo,
el fusógeno que alcanzó mayor aceptación
Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A. es el polietilenglicol (PEG) debido a que, en
Eliminación de las nervaduras centrales y seccionado de
la hoja en trozos pequeños. B. Digestión enzimática de comparación con los otros agentes químicos,
las paredes celulares. C. Centrifugación y obtención de produce mayor proporción de heteroca-
protoplastos libres de restos de tejidos vegetales. riones y, para muchos tipos celulares, resulta
menos tóxico. Además, el tratamiento con
M según el tipo de protoplasto. La solución PEG genera una mayor proporción de
enzimática es por lo general suplementada heterocariones binucleados, con menor ocu-
con sales, comúnmente CaCl2, que incremen- rrencia de fusiones entre más de dos
tan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B). protoplastos.
3. Limpieza y purificación de los
protoplastos. Una vez lograda la liberación El procedimiento de fusión con PEG más
de los protoplastos, se procede a la remo- ampliamente utilizada es, en lo esencial, una
ción de las enzimas y de los restos de tejido combinación del método original del PEG y
y de células rotas. La suspensión se pasa por el de CA++ y pH elevados. Los protoplastos
un filtro de nylon o metálico con un diáme- de dos tipos parentales se mezclan en una
tro de poro (30-100 mm) que permita el paso solución conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso
de los protoplastos y retenga los restos de molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30
tejido y grupos de células no digeridas. Pos- minutos. La temperatura de incubación óp-
teriormente, se efectúan 3 ó 4 lavados tima para inducir la fusión es de 35 a 37º C
centrifugando la suspensión por 5 minutos a pero, en la práctica, suele ajustarse a 24º C.
baja velocidad (50-100 g). Finalmente, los La densidad de protoplastos adecuada para
protoplastos sedimentados se resuspenden la formación de heterocariones es de 4 a 5 %
en una solución salina que contenga un es- (volumen de protoplastos/volumen de sus-
tabilizador osmótico. De este modo se elimi- pensión). La remoción del PEG se lleva a cabo
nan las enzimas y restos celulares. Para lo- en forma gradual, siendo esto fundamental
grar una mayor pureza de la suspensión es para asegurar una elevada frecuencia de
conveniente centrifugarla en un gradiente de heterocariones. Para ello, la suspensión se
densidad (Fig. 3C). Para el recuento de somete a sucesivos lavados con una solución
protoplastos se emplea un hemocitómetro. alcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, dismi-
La viabilidad se determina generalmente nuyendo progresivamente la concentración
empleando colorantes que son incorporados de PEG con cada lavado.
(rojo neutro, diacetato de fluoresceína) o En la fusión de los protoplastos ocurren,
excluidos (azul de Vean) por las células via- en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1)
bles; también pueden evaluarse la actividad las membranas plasmáticas de protoplastos
fotosintética (emisión de fluorescencia) y la adyacentes entran en íntimo contacto, (2)
respiratoria (consumo de O2). se producen alteraciones en sitios localizados
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 101

6. de las mismas, formándose puentes yendo a las células vecinas. Luego, los
citoplasmáticos entre protoplastos vecinos, protoplastos se aproximan unos a otros y
y (3) las interconexiones citoplasmáticas se forman cadenas paralelas a las líneas de cam-
expanden, provocando la fusión. La carga po aplicadas (Fig. 4A).
negativa neta de la superficie de las mem- La fuerza ejercida sobre la célula bajo con-
branas produce la repulsión entre ellas; el tra- diciones dielectroforéticas depende (1) de la
tamiento con Ca++ y pH elevados neutraliza intensidad de campo eléctrico, (2) del
las cargas superficiales, favoreciendo el con- gradiente del campo, (3) del volumen del
tacto entre protoplastos. El PEG actuaría protoplasto y (4) de la diferencia entre las
como un puente molecular causando altera- constantes dieléctricas de la célula y su am-
ciones en las membranas plasmáticas que biente (así como la correspondiente diferen-
promueven la adhesión y formación de puen- cia entre sus conductividades).
tes citoplasmáticos entre protoplastos veci- 2. El segundo paso consiste en la aplica-
nos, produciéndose finalmente la fusión. ción de uno o más pulsos cortos de corriente
directa de 15 a 100 µseg., con una intensi-
6.2 Electrofusión dad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), sufi-
ciente para causar la ruptura reversible de la
En 1973 se descubrió que pulsos de ele- membrana. Para que esto ocurra es necesa-
vado potencial eléctrico en un rango muy rio que el voltaje crítico de membrana sea
estrecho de intensidad y duración conducen alcanzado en cuestión de nanosegundos a
a un incremento reversible, experimental- microsegundos. Ocurre entonces la fusión de
mente controlable, de la permeabilidad de las dos células cuyas membranas están en
la membrana celular. Este efecto se denomi- estrecho contacto (1 a 2 nanómetros de dis-
nó ruptura eléctrica reversible para enfatizar tancia). El proceso de resellado es principal-
la habilidad de la membrana para reparar mente atribuido a las moléculas lipídicas de-
tales perturbaciones. El voltaje mínimo para bido a que su coeficiente de difusión es dos
un protoplasto (umbral) con el cual se pro- órdenes de magnitud mayor que el de las
duce la formación de poros disminuye a ma- proteínas. Durante este proceso pueden for-
yor duración del pulso eléctrico. Este fenó- marse puentes lipídicos entre las membranas
meno de ruptura reversible también es apli- de las dos células. En otras palabras, las mem-
cado en la técnica de electroporación, con la branas no se vuelven a sellar separadamen-
que se pueden introducir en las células cons- te en la zona de contacto. Los puentes for-
trucciones de ADN y otras moléculas de alto mados de esta manera, con continuidad
peso molecular. citoplasmática entre las dos células, condu-
cen a un radio de curvatura muy pequeño y
El método de electrofusión en esencia a altas tensiones superficiales. Como conse-
involucra dos pasos: cuencia se forma una nueva célula esférica,
ya que el proceso es favorecido energéti-
1. Los protoplastos, colocados en un me- camente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversi-
dio de baja conductividad entre dos electro- ble si el número y el tamaño de los poros
dos, se ponen en contacto al aplicar corrien- son pequeños en relación con el total de la
te alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) superficie de la membrana. Fuerzas de cam-
en un campo eléctrico no uniforme. Las car- po supra críticas, así como también largos
gas se separan dentro de las células forman- períodos de exposición, rompen áreas ma-
do un dipolo y generando, por lo tanto, un yores de membrana y pueden producir la
potencial de membrana. La fuerza del cam- destrucción total de la célula
po a ambos lados de una célula es diferente
(campo no uniforme), dando origen a una La frecuencia de fusión depende de va-
fuerza neta que la empuja a una región de rios factores:
mayor intensidad de campo (hacia uno de • ·El genotipo.
los electrodos). Este proceso se denomina • ·La procedencia de los protoplastos
dielectroforesis. La polaridad de la célula dentro del mismo genotipo. Diferentes po-
incrementa el campo local no uniforme, atra- blaciones de protoplastos exhiben frecuen-
102 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

7. sión. La inclusión de iones en el medio pue-
de incrementar el porcentaje de fusión. Sin
embargo, existe la limitación de que la
dielectroforesis debe realizarse en un medio
de baja conductividad; el medio de fusión
usualmente consiste en manitol (cuya con-
centración se ajusta según los protoplastos
empleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos de
presión osmótica en el medio de suspensión
de los protoplastos pueden favorecer el pro-
ceso de fusión.
• ·La longitud de las cadenas de
protoplastos formadas durante la dielec-
troforesis, que además depende de factores
como la densidad de protoplastos, fuerza del
campo eléctrico y tiempo durante el cual es
Figura 4: Electrofusión de protoplastos de mesófilo de aplicado. Cadenas más largas darán mayor
pasto llorón. A. Dielectroforesis de células. Las diferencias frecuencia de fusión que las cadenas cortas.
en intensidad de campo eléctrico hacen que las células Pulsos de corriente más largos y de mayor
se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B. voltaje producen un aumento de los even-
Aplicación de pulsos cortos de corriente directa, que
inducen la formación de poros en la membrana, tos de fusión múltiple; obviamente, pulsos
generando puentes entre las membranas de las células muy largos y voltajes muy elevados pueden
adyacentes. C. Los puentes con continuidad matar a los protoplastos.
citoplasmática poseen un radio de curvatura muy • ·La composición y propiedades de la
pequeño. Las altas tensiones superficiales generadas en
ese sector conducen a la formación de una nueva célula membrana plasmática pueden ser afectadas
esférica. por la actividad metabólica de los
protoplastos y por el tipo de enzimas em-
cias de fusión diferentes, aun cuando proven- pleadas en el proceso de aislamiento, influ-
gan del mismo genotipo. En general, los yendo en consecuencia en el proceso de fu-
protoplastos obtenidos a partir de hojas se sión.
fusionan más fácilmente que los provenien-
tes de raíz o de cultivos celulares. Las condiciones experimentales deben
• ·El tamaño de los protoplastos. Los ajustarse de modo de obtener la mayor fre-
más grandes se fusionan más fácilmente. cuencia de fusión posible (número de
• ·La densidad de los protoplastos. protoplastos fusionados sobre el total de
• ·El número, la duración y la fuerza de protoplastos), intentando maximizar la pro-
los pulsos de corriente directa. La duración porción de heterocariones (productos de la
del pulso eléctrico es de 15 a 50 µseg. El tiem- fusión de protoplastos diferentes) formados
po requerido para la fusión que sigue a la por sobre la de homocariones (productos de
aplicación de un pulso varía desde pocos se- la fusión de protoplastos del mismo tipo
gundos a varios minutos. Esto probablemen- parental), y minimizando la ocurrencia de
te esté relacionado a la diferencia de fluidez eventos de fusión múltiple (fusión de más de
de la membrana en los distintos tipos celula- dos protoplastos). La proporción de cada uno
res y a las propiedades del citoesqueleto den- de los dos tipos de protoplastos en la sus-
tro de la célula. pensión puede fijarse a fin de incrementar la
• ·El medio de fusión. Un factor de limi- formación de heterocariones por sobre la de
tación en la agregación dielectroforética de homocariones. El tipo de protoplasto con
las células es la conductividad eléctrica del me- mayor tendencia a fusionar se mezcla con el
dio; si ésta es muy alta, hay mucho flujo de de menor tendencia a fusionar en una rela-
corriente en la solución y se producen ción de 1:5 a 1:10. Así, durante la formación
calentamientos y turbulencias que impiden de cadenas, los protoplastos más fusionables
la formación de cadenas. estarán mayoritariamente en contacto con
• ·El potencial osmótico del medio de fu- los menos fusionables, y éstos a su vez esta-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 103

8. rán ligados entre ellos mismos. Seleccionan- Para obtener productos de multifusión de-
do las condiciones –duración y voltaje de los ben emplearse elevadas densidades.
pulsos– que promuevan sólo la fusión de los 3. El proceso de fusión es sincrónico, ya
protoplastos más fusionables, los productos que el pulso provoca la fusión de todas las
serán mayormente heterocariones. células expuestas al campo.
Sin embargo, aun cuando las condiciones 4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80
de fusión puedan fijarse de modo de incre- - 100 %) y cariogamia.
mentar la frecuencia de fusión y la propor- 5. La viabilidad de las células fusionadas
ción de heterocariones formados, la fusión es muy buena.
de protoplastos a gran escala (macrofusión), 6. Este método ofrece ventajas sobre otros
tanto por métodos químicos como eléctricos, como el del PEG, que: -requiere condiciones
resultará en una mezcla de protoplastos no fisiológicas -las frecuencias de formación de
parentales, homocariones y heterocariones. heterocariones binucleados son bajas y varia-
Esto conlleva la necesidad de emplear méto- bles -resultan tóxicos para diversos tipos celu-
dos de selección de los híbridos somáticos lares- el fusógeno debe ser removido antes
obtenidos. Una técnica alternativa que ofre- del cultivo de los protoplastos y tiene bajo
ce la ventaja de no requerir una posterior rendimiento de células fusionadas.
selección de heterocariones, aunque deman-
da mayor manipulación, es la microfusión o 7 Selección de heterocariones
electrofusión de pares de protoplastos. Esta
técnica se basa en los mismos principios que La fusión de protoplastos a gran escala
la electrofusión a gran escala pero está dise- produce una mezcla de tipos parentales y
ñada para inducir la fusión en pares seleccio- productos de fusión. Si no se efectúa una
nados de protoplastos. Este sistema emplea previa selección de las células híbridas, la re-
microelectrodos de platino fijados a un so- generación de plantas y la posterior identifi-
porte montado debajo del condensador de cación de los híbridos demandará mucho tra-
un microscopio invertido. Los pares de bajo y recursos. Dicha selección es particular-
protoplastos seleccionados se colocan en mente necesaria cuando se emplean méto-
microgotas de medio de fusión sobre un so- dos químicos, que producen una baja pro-
porte, recubiertas por aceite mineral. En cada porción (<10%) de células híbridas. Por el con-
evento de fusión, los microelectrodos se trario, los métodos eléctricos no requieren
posicionan a cada lado de una microgota necesariamente del posterior proceso de se-
conteniendo un par de protoplastos, y se lección dado que normalmente producen fre-
aplican los pulsos eléctricos. Después de la cuencias de fusión muy elevadas o porque,
fusión, los heterocariones resultantes son en el caso de la microfusión, no se generan
transferidos a gotas con medio de cultivo mezclas heterogéneas de protoplastos de-
para la posterior regeneración de plantas bido a que se fusionan dos células por vez.
híbridas. La tasa de fusión es de aproxima- Cualquiera que sea el caso, la condición de
damente 30 pares de protoplastos fusiona- híbrido debe verificarse en la planta regene-
dos y transferidos a medio de cultivo por rada mediante diferentes análisis que se ex-
hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fu- plican más adelante.
sión cercanas al 50 %.
La selección de células híbridas puede lle-
Ventajas de la electrofusión: varse a cabo empleando los siguientes mé-
todos:
1. El proceso entero puede ser seguido • Selección sobre la base de caracteres
bajo microscopio por lo que los híbridos pue- morfofisiológicos. En ciertos casos es posi-
den ser fácilmente identificados y transferi- ble diferenciar los callos híbridos de los
dos a un medio nutritivo o selectivo. parentales. Por ejemplo, en algunos cruza-
2. Puede preseleccionarse el número de mientos, los callos híbridos poseen un color
células a ser fusionadas. Las formaciones de intermedio al de los parentales.
dos células son favorecidas por bajas densi- Cuando se produce un cruzamiento en-
dades en la acanaladura entre los electrodos. tre un parental con capacidad para regene-
104 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

9. rar planta con uno recalcitrante, los híbridos heterocariones o células híbridas. Es el sis-
somáticos normalmente regeneran plantas, tema más confiable y de más amplio espec-
ya que este carácter se comporta como do- tro de aplicación. El aislamiento puede reali-
minante. Si los protoplastos del genotipo zarse de dos maneras:
respondedor son tratados con inhibidores a) Selección mecánica directa utilizando
metabólicos irreversibles (iodoacetamida, técnicas de micromanipulación con micro-
dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirán, y pipeta. Puede realizarse cuando los proto-
solamente podrán regenerarse los híbridos. plastos parentales presentan rasgos que los
• Selección por complementación. La se- distinguen al microscopio, permitiendo reco-
lección se produce porque el medio de culti- nocer las células híbridas. Por ejemplo, al fu-
vo resulta restrictivo para el crecimiento de sionar protoplastos del mesófilo (verdes) con
los parentales, pero no para el de los híbridos. protoplastos de suspensiones celulares (inco-
La complementación puede lograrse por las loros). También pueden colorearse las célu-
siguientes vías: las de ambos progenitores con diferentes
a) Empleando dos parentales con defec- colorantes vitales, como el rojo neutro y azul
tos metabólicos o genéticos no alélicos. Si brillante de cresilo.
dichos caracteres son recesivos, la fusión pro- b) Citometría de flujo. Los protoplastos
duce una célula híbrida en la que los defec- parentales se marcan con diferentes coloran-
tos se anulan por complementación. Por tes fluorescentes; por ejemplo, rodamina
ejemplo, la fusión de dos variedades albinas (rojo) y fluoresceína (verde amarillento). El
no alélicas (nucleares) de tabaco, permitió aislamiento de los heterocariones marcados
obtener plantas verdes. con ambos colorantes se realiza utilizando un
citómetro de flujo (FACS, fluorescence-
AAbb (albina) x aaBB (albina) activated cell sorter), que es preciso y muy
↓ rápido. El equipo posee fotocélulas que de-
AAaaBBbb (verde) tectan fluorescencia, pudiendo separar los
protoplastos marcados con un solo fluoro-
Asimismo, a partir de dos líneas mutantes cromo (parentales) de aquéllos doblemente
no alélicas de tabaco deficientes en nitrato marcados (híbridos).
reductasa, se obtuvieron colonias capaces de
crecer en un medio conteniendo nitrato 8 Cultivo de protoplastos
como única fuente de nitrógeno.
b) Fusionando parentales que expresan La habilidad para regenerar plantas a
caracteres dominantes tales como resisten- partir de células y tejidos en cultivo es un com-
cia a antibióticos o herbicidas. Para ello se ponente esencial en la biotecnología para la
emplea una línea resistente a cierta droga, y manipulación genética y el mejoramiento
otra resistente a una segunda droga, efec- vegetal. Esto resulta relativamente fácil para
tuándose la selección de las células híbridas las dicotiledóneas herbáceas, pero ha sido
en un medio conteniendo ambas drogas a bastante difícil para las monocotiledóneas,
concentraciones que resultan letales para las particularmente las gramíneas.
líneas parentales. Los protoplastos se cultivan en cajas de
c) Una línea que presente una mutación Petri en medio líquido o semisólido, rico en
autotrófica (por ejemplo: albinismo, deficien- compuestos orgánicos e inorgánicos, suple-
cia a nitrato reductasa) y un carácter domi- mentado con reguladores del crecimiento, y
nante (por ejemplo, resistencia a antibióticos en presencia de un estabilizador osmótico.
o herbicidas) es de gran utilidad para la se- Suelen ser cultivados en cajas de Petri con me-
lección. Los híbridos producidos por el cruza- dio agarificado, donde se mezcla la solución
miento de estos parentales con cualquier de protoplastos con un medio de cultivo lí-
genotipo silvestre pueden ser seleccionados quido a 40º°C conteniendo 1,2% de agar,
en medio mínimo suplementado con el anti- perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Los
biótico o herbicida, que no permite el creci- protoplastos quedan, así, atrapados en el
miento de los parentales. medio semisólido y, luego de varios días, se
• Selección por aislamiento de los ven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 105

10. bargo, el medio líquido da mejores resulta- dos con vitaminas, azúcares, aminoácidos,
dos por varias razones: (a) los protoplastos reguladores de crecimiento y también con
de varias especies sólo pueden dividirse en aditivos inespecíficos como leche de coco,
medio líquido, (b) la presión osmótica del hidrolizado de caseína, extracto de levadu-
medio puede ser fácilmente reducida a los ra, etcétera.
pocos días en cultivo, (c) la densidad celular · El potencial osmótico del medio de cul-
puede ser modificada agregando medio de tivo: los protoplastos requieren de protec-
cultivo o las células con especial interés pue- ción osmótica antes de regenerar la pared
den ser aisladas y cultivadas a alta densidad, celular. Normalmente se ajusta con el agre-
(d) la degradación de algunos componentes gado al medio de cultivo de manitol o
del medio por la población de protoplastos sorbitol.
puede producir algunas sustancias citotóxicas, · La densidad celular: la densidad inicial
cuya concentración alrededor de las células de protoplastos varía de 104 – 105 proto-
será menor en el medio líquido. Una técnica plastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos
muy eficiente que combina medio sólido y con altas densidades producirán, a partir de
líquido es la de cultivo en perlas de agarosa, cada protoplasto, colonias que deberán se-
donde los bloquecitos con los protoplastos pararse tempranamente para evitar quime-
inmovi-lizados en agarosa son cortados en ras. Si deseamos colonias bien separadas para
cuatro mitades y colocados en medio líqui- asegurar que provengan de un solo
do, donde se cultivan en continua agitación. protoplasto, la densidad inicial debe ser baja,
Los protoplastos regeneran la pared ce- de 100 – 500 protoplastos/ml. Hay proto-
lular luego de uno a cuatro días en cultivo. La plastos de varias especies y tipos que no lo-
presencia de pared es esencial para lograr una gran dividirse a bajas densidades de cultivo.
división regular. Luego de dos a tres sema- Para estos casos se desarrolló la técnica de
nas, producto de mitosis sucesivas, se forman cultivo con células nodrizas o alimentadoras.
microcolonias derivadas cada una de una cé- Esta técnica consiste en exponer una suspen-
lula, que dos semanas después se pueden ver sión de 106 protoplastos/ml a rayos X a do-
a simple vista. Estos callos son transferidos a sis que inhiben la división celular, pero que
un medio de cultivo y a condiciones apropia- quedan metabólicamente activas. Estas cé-
das para regenerar plantas (Fig. 5). lulas se plaquean en un medio agarificado, y
Los principales factores a tener en cuen- luego se colocan por sobre éstas los
ta para el cultivo de protoplastos son: protoplastos sin irradiar, de los cuales se for-
· Los requerimientos nutricionales: se han marán las colonias. También suele utilizarse
utilizado en muchos casos los mismos medios papel de filtro para separarlas de las células
de cultivo que se utilizan en el cultivo de célu- nodrizas. Otra técnica utilizada es el cultivo
las y tejidos, pero en general son enriqueci- en microgota, donde se puede cultivar hasta
un solo protoplasto. Cada microgota
contiene entre 0,25 - 25 µl de medio
de cultivo, logrando densidades de 2 –
4 x 103 proto-plastos/ml. Con ayuda de
un micromani-pulador se coloca la célu-
la y se la cubre con aceite mineral para
evitar la deshidratación del medio.
· Los tratamientos físicos: trata-
mientos de choque eléctrico y térmico
estimulan la división de los protoplas-
tos.
· Las condiciones de cultivo: en ge-
Figura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de neral los protoplastos son sensibles a
mesófilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa
suspendidas en medio líquido. C. Detalle de la formación de la luz, por lo cual durante el cultivo se
callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneración. los mantiene en oscuridad o bajo luz
F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. muy tenue.
Planta regenerada. · El origen de los protoplastos: el
106 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

11. estado fisiológico del tejido del cual provie- el ADN amplificado al azar) o Southern blot,
nen y la calidad de los protoplastos son muy empleando sondas de ADN repetitivo espe-
importantes para obtener una elevada efi- cífico de especie o de genes de ARN
ciencia en la respuesta al cultivo. ribosomal.
9 Identificación de las plantas híbridas 10 Logros y tendencias de la hibridación
somática
La condición de híbrido debe verificarse
en la planta regenerada aun cuando se haya La hibridación somática ha permitido pro-
efectuado algún tipo de selección para el cul- ducir híbridos que no se habían podido ob-
tivo de las células híbridas. A tal fin es conve- tener por cruzamientos sexuales, incremen-
niente efectuar diferentes evaluaciones, lo tando así el flujo de genes en los cultivos. La
que permite una mejor caracterización del tabla 1 muestra algunos ejemplos de híbridos
híbrido. Comúnmente se llevan a cabo los somáticos que presentan algunas ventajas
siguientes estudios: agronómicas.
1. Morfológicos. Los híbridos somáticos En sus inicios, algunos esperaban que la
pueden presentar rasgos morfológicos carac- hibridación somática permitiera producir nue-
terísticos. Los mismos pueden ser interme- vas especies que expresaran las característi-
dios a los de los parentales, la suma de ellos, cas deseadas de ambos progenitores. Por
u otros completamente nuevos. ejemplo, por hibridación entre tomate y
2. Citológicos. El análisis del complemen- papa, se buscó producir plantas que desarro-
to cromosómico permite revelar si el híbrido llaran tomates en la parte aérea y tubérculos
posee el total de cromosomas de cada en la raíz (pomato). La experiencia mostró
parental, si se han fusionado más de dos que difícilmente puedan lograrse estos
protoplastos, el grado de aneuploidía y posi- híbridos espectaculares, debiéndose más bien
bles translocaciones intergenómicas. Median- dirigir la técnica hacia la introgresión de po-
te hibridación in situ empleando sondas de cos genes silvestres en las especies cultivadas
ADN repetitivo específico de especie puede mediante hibridación asimétrica o cibridación,
evaluarse con más profundidad la contribu- manteniendo las características generales del
ción de los genomas parentales y reestructu- cultivo.
raciones cromosómicas en el híbrido. Uno de los factores que dificulta la ob-
3. Isoenzimáticos. El patrón de bandas tención de híbridos simétricos es la progresi-
isoenzimáticas del híbrido debe mostrar ban- va pérdida de cromosomas de uno de los
das de ambos parentales, pudiendo haber parentales, que normalmente ocurre duran-
otras bandas que resultan de nuevas combi- te la regeneración. Si bien la fusión de
naciones de las subunidades enzimáticas. protoplastos permite sortear las barreras
Habitualmente se analizan los patrones de precigóticas, siguen existiendo barreras
glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglu- genómicas que resultan en la eliminación es-
coisomerasas, glutamato oxalacetato pontánea de cromosomas durante las divi-
transaminasas, esterasas, peroxidasas y siones celulares. El mecanismo que determi-
fosfatasas ácidas. Las isoenzimas son extre- na la eliminación de cromosomas no está
madamente variables entre tejidos vegeta- bien comprendido, pero generalmente se
les, por lo que para el análisis se deben em- retienen los cromosomas del parental que
plear los mismos tejidos u órganos, y en el tiene el ciclo celular más corto. Uno de los
mismo estadío fenológico. factores que puede producir incompatibilidad
4. En el ámbito del ADN. La demostra- genómica es el estado de diferenciación de
ción de la presencia de ADN de ambos los tipos celulares involucrados en la fusión.
parentales es la prueba más directa de la hi- Por ejemplo, cuando se fusionan células en
bridación. El análisis de ADN es independien- fase de crecimiento activo con células del
te del tejido empleado y de la edad de la mesófilo, que no se dividen, generalmente
planta. Puede llevarse a cabo por RFLP se pierden los cromosomas de estas últimas.
(polimorfismos en la longitud de los fragmen- Los híbridos somáticos o sexuales entre
tos de restricción), RAPD (polimorfismos en especies silvestres y cultivadas contienen
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 107

12. Tabla 1: Ejemplos de híbridos somáticos que exhiben oryzicola, Triticum
algún carácter de interés agronómico monococcum (+)
Pennisetum ameri-
canum, Festuca
arundinacea (+)
Lolium multiflo-
rum. El primer caso
de regeneración de
plantas maduras de
híbridos interge-
néricos (simétricos y
asimétricos) en gra-
míneas fue el Festu-
lolium.
A pesar de los
esfuerzos realizados,
la aplicación de esta
estrategia no ha
conducido a la ob-
tención de nuevos
híbridos de especies
importantes, funda-
mentalmente debi-
do a problemas de
baja o nula fertili-
dad. Los métodos
actuales de transfe-
rencia de genes ais-
muchas características no deseadas de la pri- lados han desplazado el interés en la hibri-
mera, además de aquéllas deseadas. El dación somática. Sin embargo son una exce-
retrocruzamiento con la especie cultivada es lente herramienta para estudiar las interac-
requerido para remover los genes no desea- ciones núcleo-citoplasmáticas entre genomas.
dos del parental silvestre, pero ello no siem-
pre es posible debido a que los híbridos sue- 12 Lecturas recomendadas
len ser estériles. La hibridación asimétrica y la
BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Protoplast isolation
cibridación tienen la ventaja de incorporar and culture. Somatic hybridization and cybridization. En:
sólo uno o pocos caracteres provenientes del Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y
parental silvestre en la especie cultivada, y pro- 13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier,
Amsterdam. pp. 337-406.
ducir plantas con mayor fertilidad.
Algunos caracteres deseables están codi- LINDSEY Y JONES, 1992. Biología celular de la ingeniería
ficados por el genoma extranuclear, tales genética. En: Biotecnología vegetal agrícola, Capítulo 6.
como la androesterilidad citoplasmática y Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza. pp.105-142.
ciertos tipos de resistencia a enfermedades MATSUMOTO, K. 2001. Híbridos somáticos. Biotecno-
y a herbicidas. Para estos casos es de particu- logía Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: pp.
lar utilidad la cibridación, dado que es un 26-28.
método simple para transferir estos genes. ZIMMERMANN, U. 1983. Electrofusion of cells: principles
and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5:
11 Algunos ejemplos pp. 149-156.
Se han obtenido híbridos intergenéricos
de Panicum maximum (+) Pennisetum
americanum (Ozias-Atkins et al., 1986),
Saccharum officinalis (+) Pennisteum
americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa
108 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo