metodos-de-diagnostico- viral - MICRO.pptx

1. UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO
FACULTAD DE CIENCIA DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL ENFERMERÍA
INTEGRANTES:
- Chiquez Lujan, Karen Alexandra.
- Solsol Leveau, Estefani Prisila.
ASIGNATURA: Microbiologia y Parasitologia.
DOCENTE: Agustin Padilla Zuñiga.

2. Pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS :
DETECTAN
ANTICUERPOS
FORMADOS
POR ACCIÓN
VIRAL
DETECTAN A
LA PARTÍCULA
VIRAL , Ag
VIRAL O
GENOMA DEL
VIRUS

3. Ingreso del
virus
Métodos directos
Concentración
viral
MÉTODO
S
DIRECTOS

4. TOMA DE
MUESTRA
Consideraciones generales para la toma
de muestra para diagnǫstico directo de la
infecciǫn viral
❏ Precoz
❏ Adecuada (raspados, lavados, …) ↝ ¡Células!
❏ Localización primaria de la infección y
otras posibles
❏ Transporte y conservación
❏ Decontaminación
❏ infección ³ enfermedad (viremia)

5. Tipo de Muestras

7. MÉTODOS DIRECTOS
EI virus como
partícuIa viraI:
Microscopía
EIectrónica
EI virus como
agente infeccioso:
Aislamiento ViraI -
CuItivos CeIuIares
Detección de
Antígenos viraIes:
Técnicas
InmunoIógicas (IF,
EIA, etc.)
Deteccion de
Ácidos nucleicos
viraIes:
Técnicas
de BioIogía
Molecular (PCR…)

8. 9
Se necesitan más de 10 partículas
virales por ml.
Es muy específica pero poco sensible. Sirve para
muestras con mayor
contenido de virus, por ejemplo: Líquidos
vesiculares (herpes, varicela,
viruela, etc.); verrugas (papiloma,etc.)

10. Sin embargo, existen algunas desventajas en
el aislamiento del virus: El proceso suele ser
lento, ya que demanda días a semanas para la
identificación, y en consecuencia puede no
estar disponible a tiempo para influir en la
atención del paciente.
El aislamiento del virus es la técnica “gold
standard” a pesar de las técnicas
moleculares, este tiene una sensibilidad y una
especificidad muy alta.

11. El aislamiento viral se basa en la capacidad infectiva del agente infeccioso presente en la muestra, se puede
realizar en:
❏ Huevos embrionados: Lesiones de membrana, estudio de líquidos y tejidos.
❑ Animales de laboratorio: Enfermedad o muerte.
❑ CULTIVOS CELULARES (primarios, línea continua): Efecto citopático, producción de hemaglutininas,
Interferencia.
El aislamiento viral no es un mȩtodo de diagnǫstico rápido en la rutina de laboratorio, ya que necesita de cierta
infraestructura y condiciones (tiempos de cultivo, pasajes en ciego, condiciones de la muestra) para su realizaciǫn.
Inoculación intracraneal Inoculación intraperitoneal
Parálisis flácida
de
las
extremidades posteriores como
se ve con la infección por el virus
Coxsackie A
Parálisis espástica secundaria a
infección por Coxsackie virus B

12. Herpes simplex virus
Poxvirus
Rous sarcoma virus
Influenza virus
Mumps virus
Influenza virus
Mumps virus
Newcastle disease virus
Avian adenovirus
Aislamiento viral en
huevos embrionados

13. Un cultivo celular es obtenido de explantes de órganos o de embriones de
animales, ademásexisten comercialmente las llamadas líneas
celulares, por técnicas adecuadas se obtienen MONOCAPAS
CELULARES donde se “siembra “ al virus.
Luego de incubación correspondiente se detecta al
virus por sus efectos CITOPÁTICOS o por técnicas como la
hemadsorción u otras.

15. Detección de Antígenos
viraIes:
Técnicas
InmunoIógicas
INMUNOFLUORESCENCI
A DIRECTA (ID)
RIA DIRECTO
EIA (ELISA DIRECTO)
TEST DE
AGLUTINACIÓN
INMUNOCROMATOGRÁFICA
Detección de Ácidos
nucIeicos virales
,Tecnicas de Biología
Molecular
SONDAS DE
ÁCIDOS
NUCLEICOS
DETERMINACION DE
ACIDOS NUCLEICOS
VIRALES POR SONDA
SINTÉTICA
AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS VIRALES
MEDIANTE UNA REACCIÓN
EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

17. FASE SÓLIDA
(ANTICUERPO ESPECÍFICO) ANTICUERPO MARCADO
CON ISÓTOPO
RADIOACTIVO
MUESTRA
(Ag viraI)
RIA DIRECTO
Se detecta por emisión de
radiación cuando es positivo

18. EIA DIRECTO
ANTICUERPO ESPECÍFICO EN
FASE SÓLIDA
MUESTRA
ANTÍGENO VIRAL
ANTICUERPO MARCADO
(CONJUGADO)
ENZIMA

26. Tȩcnicas de aglutinaciǫn.- Sobre una tarjeta de reacción se mezclan la muestra clínica que alberga al antígeno con el
reactivo que contiene a los anticuerpos específicos. Al entrar en contacto los anticuerpos mediante los dos puntos de
unión con el antígeno establecen entramados de muchas moléculas de antígeno y de anticuerpos. Esta aglutinación de
partículas antigénicas forma grumos (Figuras 2a y 2b). Para que estos grumos sean fácilmente visibles
macroscópicamente, los anticuerpos están unidos por el fragmento Fc a partículas inertes de mayor tamaño, tales como
partículas de látex.

27. Aspecto del
fondo del tubo
Resultad
o
positivo
Resultad
o
negativ
o

29. La PCR es una amplificación de secuencias específicas del DNA. Se basa en la utilización de secuencias
cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma específica con
cada una de las cadenas de DNA (muestra donde existirían ácidos nucIeicos viraIes), previamente
desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reacción tenga lugar se usa una enzima,
Taq pol (ADN Polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucleótidos.
trifosfatos (dNTPs). La función natural de la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los
deoxinucleótidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construcción. El nucleótido al cual se
una la polimerasa será complementario de la base en la posición correspondiente de la cadena templado
.Se sintetiza así una cadena simple de DNA, complementaria y alineada a cada “ primer “

30. • Se realiza una serie repetida de ciclos cada uno compuesto por 3 pasos básicos:
•
•
a. Desnaturalización del ADN doble cadena por la elevada temperatura (95ºC).
• b. Acoplamiento de los primeros, desciende la temperatura (entre 55ºC-72ºC).
c. Elongación del primers, aquí se eleva la temperatura a 72ºC permitiendo la incorporación de los
deoxinucleótidos.
•
Mientras tanto se van deplecionando los primers y los deoxinucleótidos, y se van sintetizando nuevas
cadenas de DNA. Al final se consiguen miles de copias de DNA del fragmento de DNA limitado por los
"primers ". Los fragmentos de DNA así obtenidos se pueden identificar por varias técnicas:
visualización en geles de agarosa o poliacrilamida mediante tinción con bromuro de etidio y examen
con luz ultravioleta, o hibridación con una sonda marcada. La combinación de la PCR y las sondas de
ácidos nucleicos marcadas promete ser el método más sensible para la detección e identificación de
los virus.

31. MÉTODOS INDIRECTOS
IMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA (IFI)
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
INDIRECTO (EIA )
WESTERN BLOT

32. Métodos Indirectos
•
• Detección de IgM
•
Infección aguda
• Infección congénita
FR: f+
• ↓ IgG: f-
• IgM Captura
• Detección de IgG
• Seroconversió
n
• Recién Nacidos

33. La IFI, es un método rápido y confiable
para la determinación de anticuerpos
antivirales en el suero del paciente.
Posibilidad de determinar las clases de
anticuerpos mediante el empleo de
conjugados.
Se basa en la unión de anticuerpos
antivirales presentes en el suero del
paciente a los antígenos virales
expresados en la superficie y
citoplasma de células infectadas, que
han sido fijadas a un portaobjeto de
vidrio.

34. objetiva (instrumentaI).
ANTÍGENO VIRAL EN FASE
SÓLIDA .
ANTI IgG marcado
ANTICUERPO EN LA MUESTRA (IgG)
ENZIMA
Luego se agrega sustrato
que reacciona con enzima
dando color .

35. MUESTRA
Conjubado

37. La técnica de WB se basa en
la separación electroforética
de proteínas virales que son
posteriormente inmovilizadas
en papel de nitrocelulosa con
el objeto de determinar la
presencia de anticuerpos
específicos contra cada una
de esas proteínas .

38. WESTERN BLOT (WB)

39. •
Muy
específica
• Método
confirmatorio

40. 1
2

41. 3
4