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Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
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incluindo os multi-resíduos.
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A análise quantitativa é feita por meio da curva-padrão, por comparação de área, levan-
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Cloreto estanoso di-hidratado
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  1. 1. IAL - 687 RESÍDUOS DE PESTICIDAS XXCAPÍTULO Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  2. 2. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 688 - IAL
  3. 3. IAL - 689 XXRESÍDUOS DE PESTICIDAS P esticidas ou agrotóxicos e afins são definidos no Decreto nº 4074, de 04 de janeiro de 2002, do Ministério da Agricultura como: produtos e agentes de pro- cessos físicos, químicos e biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-la da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de cresci- mento. Podem ser classificados quanto à sua ação como inseticidas, fungicidas, herbicidas, raticidas, acaricidas e outros e quanto ao grupo químico a que pertencem como organoclo- rados, organofosforados, carbamatos, ditiocarbamatos, piretróides e outros. Cronologicamente, segundo seu aparecimento e desenvolvimento, os pesticidas podem ser classificados de acordo com uma sucessão de gerações, sendo que na primeira geração temos os inorgânicos, orgânicos vegetais, minerais e na segunda geração, os orgâ- nicos sintéticos: organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides. Na terceira geração, temos os microbianos e os feromônios sexuais, na quarta, temos os hormônios juvenis e na quinta, os anti-hormônios vegetais e microrganismos. Do ponto de vista toxicológico, os pesticidas podem ser classificados em extrema- mente, altamente, moderadamente ou pouco tóxicos, de acordo com a dose letal (DL50 ) oral e dérmica para ratos e outros indicadores relacionados a danos na córnea, lesões na pele e concentração letal inalatória (CL50 ) para ratos, segundo a Portaria nº 3 do Ministério da Saúde, de 16 de janeiro de 1992. Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  4. 4. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 690 - IAL Durante o registro de pesticidas, são estabelecidos os limites máximos de resíduos, conhecidos como LMR. A resolução n° 165, de 29 de agosto de 2003, do Ministério da Saúde, contém os índices das monografias dos ingredientes ativos dos agrotóxicos com emprego autorizado, com os respectivos LMR para cada binômio pesticida/cultura. As atualizações são publicadas pela ANVISA/MS. O uso de pesticidas em lavouras cujos produtos são destinados ao consumo huma- no ou animal pode conduzir a resíduos após a colheita. Os alimentos ainda podem conter resíduos remanescentes de utilização durante o armazenamento e transporte. Por outro lado, os pesticidas podem se mover do local de aplicação e se transportar para outro lugar no meio ambiente e podem ser transferidos para a cadeia alimentar. A capacidade de um pesticida persistir por um certo período de tempo pode ser desejável e tem sido reconhecido como importante em algumas situações para o controle bem sucedido de pestes e doenças.Todavia, a presença de resíduos de pesticidas nos alimen- tos e no meio ambiente preocupa o consumidor e as autoridades competentes, já que pode oferecer riscos para a saúde humana e ambiental. A população rural corre risco de exposição aguda, se não forem tomados os devidos cuidados na aplicação dos produtos e o consu- midor pode estar sob risco de exposição crônica a pesticidas se estiver ingerindo alimentos contendo resíduos de pesticidas acima dos LMR. Devido à possibilidade da presença de vários pesticidas ou seus metabólitos, ou outros componentes contaminantes sejam de ori- gem sintética ou natural, torna-se impossível especificar um único procedimento analítico que determine satisfatoriamente o resíduo de um pesticida particular em qualquer substra- to. É necessário usar um procedimento validado para a situação ou adaptar e validar um procedimento aceitável para circunstâncias particulares envolvidas, tais como a natureza da amostra e do resíduo e as interferências a serem encontradas. Além disso, algum método de confirmação da identificação do resíduo do pesticida é necessário como, a utilização de fase estacionária de diferente polaridade ou detector seletivo de massa. Os sistemas de análise de multi-detecção, baseados no uso da cromatografia a gás, cromatografia a líquido de alta eficiência com detectores específicos, têm a grande vanta- gem de proporcionarem evidências de identidade e meios de medir um ou mais pesticidas de uma ampla gama de resíduos. O controle de resíduos de pesticidas em alimentos é necessário, tanto para a prote- ção direta do consumidor como em relação à aceitabilidade da mercadoria no comércio. Seus resultados podem ser usados para introduzir medidas corretivas de prevenção de risco à saúde.
  5. 5. IAL - 691 Devido ao grande número de métodos, apresentamos nesse capítulo os principais, incluindo os multi-resíduos. 370/IV Método multi-resíduo para determinação de pesticidas em frutas e vegetais As amostras são trituradas em blender e homogeneizadas e os pesticidas são extraí- dos com acetona e uma mistura de diclorometano e n-hexano. A determinação é feita por cromatografia a gás com detectores de captura de elétrons, fotométrico de chama ou de nitrogênio e fósforo e cromatografia a líquido de alta eficiência com detector ultravioleta ou fluorescência ou CG/MS. A determinação de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais está distribuída con- forme a Tabela 1. Tabela 1 -- Distribuição de pesticidas para finalidade analítica (a) (b) (c) Aldrin Acefato Aldicarbe Aletrina Azinfós-etílico Carbaril Azoxistrobina Azinfós-metílico Carbendazim Bifentrina Carbofenotiona Carbofurano Bioaletrina Clorfenvinfós Tiabendazol Captana Clorpirifós Clorotalonil Clorpirifós-metilico Ciflutrina Diazinona Lambda-cialotrina Diclorvos Cipermetrina Dimetoato DDT total (op’DDT, pp’DDT, op’ DDE pp’DDE, op’DDD, pp’DDD) Disulfotona Deltametrina Etiona Dicofol Etoprofós Dieldrin Etrinfós Dodecacloro Fenamifós Endosulfam (alfa, beta e sulfato) Fenitrotiona Endrin Fentiona Esfenvalerato Fentoato Fenpropatrina Folpete Fenvalerato Forato HCH total (alfa, beta, gama) Fosfamidona Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  6. 6. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 692 - IAL (a) (b) (c) Heptacloro Malationa Heptacloro epóxido Metamidofós Hexaclorobenzeno Metidationa Imazalil Mevinfós Iprodiona Ometoato Permetrina Parationa-etílica Procimidona Parationa-metílica Procloraz Pirimifós-etílico Propargito Pirimifós-metílico Tetradifona Profenofós Trifluralina Pirazofós Vinclozolina Terbufós Triazofós Triclorfom a) Cromatografia a gás com detector de captura de elétrons (ECD). b) Cromatografia a gás com detector fotométrico de chama (FPD) ou de nitrogênio e fósforo (NPD). c) Cromatografia a líquido de alta eficiência com detector UV ou fluorescência. Material Cromatógrafo a gás com detectores: ECD, FPD ou NPD, cromatógrafo a líquido de alta eficiência com detector UV ou fluorescência, capela de exaustão para solventes, centrífuga, rotavapor, blender, balança analítica, balança semi-analítica, estufa, refrige- rador, freezer, bomba de vácuo, ultra-turrax, sistema de purificação de água para CLAE, balões volumétricos de diferentes capacidades, balões de fundo chato de 125 e 300 mL com boca esmerilhada 24/40, frascos de nalgene, pipetas volumétricas de diferentes capacidades, pipetas graduadas de diferentes capacidades, pipetas Pasteur, funis de Büchner, kitassatos, funis analíticos, béqueres, provetas, tubos graduados com tampa de 10 mL, seringas hipodérmicas de vidro de 5 mL, frascos de vidro com tampa de 100 mL com tampa e batoque de teflon, tubos graduados com tampa e septo de teflon para injetor automático, coluna de extração em fase sólida (SPE-diol de 500 mg, 3 mL) e coluna de extração em fase sólida (SPE-silica amino propil de 500 mg, 3 mL). Reagentes Acetona grau resíduo Acetonitrila para CLAE
  7. 7. IAL - 693 Água purificada para CLAE Diclorometano grau resíduo Dihidrogenofosfato de Potássio Ácido fosfórico Algodão tratado n-Hexano grau resíduo Álcool metílico para CLAE Hidróxido de sódio Isooctano Padrões analíticos de pesticidas de alta pureza com certificado Tolueno grau resíduo Nota: faça, previamente, brancos de cada reagente para certificar-se de que não pos- suem interferentes para a análise. Soluções-padrão estoque – Pese, com precisão, 0,01 g (ou conforme requerido pelo método), do padrão de pesticida em pesa-filtro ou béquer de 10 mL. Dissolva com uma pequena quantidade de isooctano (padrões de pesticidas item a e b da Tabela 1), aceto- nitrila (aldicarbe, carbofurano e carbaril) ou álcool metílico (carbendazim e tiabenda- zol). Transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com isooctano, acetonitrila ou álcool metílico, conforme a classe do princípio ativo preparado. Transfira para frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Todo frasco deve conter uma etiqueta com dados de procedência, identidade, concentração, estabilidade, data de preparação, prazo de validade, temperatura de armazenamento. Armazene em freezer. Esta é a solução a partir da qual serão preparadas as soluções- padrão intermediárias. Soluções-padrão intermediárias – A partir da solução-padrão estoque, prepare misturas de padrões de pesticidas e pipete 0,1 mL, 0,2 mL ou a quantidade necessária para obter a concentração desejada de cada princípio ativo, para um balão volumétrico de 10 mL. Complete o volume com n-hexano (pesticidas do item a e b da Tabela 1) ou acetoni- trila (aldicarbe, carbaril, carbofurano) ou álcool metílico (carbendazim e tiabendazol). Transfira para um frasco, cole etiqueta e armazene em refrigerador. Soluções-padrão de trabalho – A partir das soluções intermediárias, pipete 0,1 mL e/ou a quantidade necessária para obter a concentração desejada, para um balão volumétrico de 10 mL. Adicione solvente apropriado e complete o volume. Transfira para um frasco de armazenamento, cole etiqueta e guarde em congelador. Para os pesticidas dos itens a e b da Tabela 1, as diluições são feitas com n-hexano. Para aldicarbe, carbofurano, carbaril, carbendazim e tiabendazol, as diluições são feitas na fase móvel. A concentração deve ser adequada à faixa de linearidade do detector do cromatógrafo e metodologia utilizada. Prepare as soluções de trabalho em cinco níveis de concentração (1/2 LQ, 1 LQ, 2 LQ, 5 LQ, 10 LQ) para a construção da curva- padrão. Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  8. 8. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 694 - IAL Nota: Limite de quantificação (LQ) – Menor concentração do analito na amostra que pode ser quantificada com precisão e exatidão aceitáveis, sob determinadas condições experimentais adotadas. Diclorometano-n-hexano 1:1 (v:v) – Transfira 500 mL de diclorometano para um ba- lão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com n-hexano. Fase móvel para análise de resíduos de aldicarbe, carbofurano e carbaril – Água purifi- cada para CLAE e acetonitrila 65:35 (v:v) – Transfira 350 mL de acetonitrila para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água purificada para CLAE. Fase móvel para análise de resíduos de carbendazim e tiabendazol (solução de KH2 PO4 a 0,1% e álcool metílico 30:70) – Transfira 300 mL da solução KH2 PO4 a 0,1% para balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com álcool metílico. Misture bem, homogeneíze em ultra-som e filtre em membrana de 0,45 µm Isoctano-tolueno 9:1(v/v) – Transfira 90 mL de isoctano para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com tolueno. Solução KH2 PO4 0,1% – Pese 1 g de KH2 PO4 em béquer de 10 mL e dissolva com água purificada para CLAE. Transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL, lavando o béquer com pequenas quantidades de água purificada para CLAE. Tratamento do algodão – Coloque, em frasco de Soxhlet, o algodãoeextraiacom200mL de n-hexano por pelo menos cinco horas. Coloque em béquer e seque em estufa. Armazene em frasco de vidro com tampa. Procedimentos A seleção das partes de um material vegetal que devem ser analisadas depende do objetivo da análise e da natureza de amostra. Deve-se amostrar o produto de acordo com as normas do Joint FAO/WHO Food Standards Programme Codex Alimentarius Commission. Preparação da amostra Materiais moídos, grãos e pequenas frutas – Simples mistura. Frutas, legumes e outros produtos vegetais – A redução das amostras deve ser realizada por corte manual. Quarteie antes de misturar. Pique, triture, moa em liqüidificador com copo de vidro ou aço inox.
  9. 9. IAL - 695 Verduras – Retire as folhas aleatoriamente. Porções selecionadas – Quarteie e misture a quantidade total das porções selecionadas a fim de obter um material homogêneo. Coloque aproximadamente 1 kg em frasco de vidro com tampa de vidro ou com batoque de teflon. Armazene em geladeira para análise imediata ou em freezer caso não seja realizada imediatamente. Extração – Pese 30 g da amostra em frasco de nalgene. Adicione 30 mL de ace- tona e agite no ultra-turrax por 30 segundos. Adicione 60 mL de uma mistura de diclorometano-n-hexano 1:1 (v/v) e agite novamente em ultra-turrax por 30 se- gundos. Centrifugue por 20 minutos ou filtre em funil de vidro com algodão trata- do para uma proveta de 100 mL. Para analisar resíduos de pesticidas do item a da Tabela 1, prossiga a partir do extrato orgânico como indicado no item 1. Para analisar os resíduos de pesticidas do item b da Tabela 1 prosiga como indicado no item 2. Para analisar resíduos de aldicarbe, carbofurano e carbaril prossiga como indicado no item 3. Para analisar resíduos de carbendazim e tiabendazol prossiga como indicado no item 4. 1. Resíduos dos pesticidas do item a – Pipete 0,2 mL do extrato orgânico para vial. Concentre até quase à secura, ressuspendendo em n-hexano, completando o volume a 1 mL. Injete 2 μL em cromatógrafo a gás. 2. Resíduos dos pesticidas do item b – Pipete 5 mL do extrato orgânico para um tubo graduado. Concentre até quase à secura e ressuspenda em isoctano-tolueno 9:1 (v/v), a 1 mL. Injete 2 μL em cromatógrafo a gás. 3. Resíduos de aldicarbe, carbofurano e carbaril – Do extrato, transfira uma alíquota de 10 mL para um balão de 25 mL, concentre em rotavapor até quase à secura e ressus- penda em diclometano, completando o volume a 2 mL. Condicione uma coluna de extração em fase sólida (SPE– sílica aminopropil de 500 mg, 3 mL).Transfira a amostra. Elua com 4 mL de diclorometano com 1% de álcool metílico em tubo de vidro. Con- centre à secura e ressuspenda na fase móvel. Filtre em membrana de 0,45 µm através de uma seringa de vidro de 5 mL. Recolha em tubo de vidro com tampa. Transfira para o vial e injete 40 µL em cromatógrafo a líquido de alta eficiência. 4. Resíduos de carbendazim e tiabendazol – Do extrato, transfira uma alíquota de 10 mL para um balão de 25 mL e concentre em rotavapor até quase a secura e ressuspen- da em álcool metílico, completando o volume a 2 mL. Condicione uma coluna de extração em fase sólida (SPE – diol de 500 mg, 3 mL) com 5 mL de álcool metílico. Transfira a amostra. Lave com 2 mL de álcool metílico e descarte o eluato. Elua com 4 mL da solução de H3 PO4 0,1 M/L e recolha em tubo de vidro. Adicione 100 µL de NaOH 1 M/L. Filtre em membrana de 0,45 µm através de uma seringa de vidro de 5 mL. Recolha em tubo de vidro com tampa. Transfira para o vial e injete 40 µL em cromatógrafo a líquido de alta eficiência. Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  10. 10. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 696 - IAL Análise da testemunha e estudos de recuperação – Para cada matriz a ser analisada, realize a análise em triplicata da testemunha e estudos de recuperações com 5 repetições em pelo menos dois níveis: 1 LQ e 10 LQ. Condições cromatográficas Pesticidas do item a: cromatógrafo a gás, com ECD, equipado com works- tation, coluna capilar, fase estacionária: 5% de fenil metil siloxano (30 m x 0,32 mm x 0,25 μm de filme), temperatura do detector: 320°C, tempe- ratura do forno: 60°C (1 min), (60 - 220)°C (10°C/min), (220 - 280)°C (3°C/min.), 280°C (17 min) – tempo total: 60 min, fluxo do gás de arraste: nitrogênio: 1 mL/min, temperatura do injetor: 240o C, modo de injeção: splitless. Pesticidas do item b: cromatógrafo a gás, com FPD, coluna megabore: fase estacioná- ria: 5% de fenil metil siloxano (30 m x 0,53 mm x 2,65 μm de filme), temperatura do detector: 280°C, temperatura do forno: (50 - 150)°C (30°C/min), (150 - 240)°C (10°C/min), fluxo do gás de arraste: nitrogênio: 18 mL/min, fluxo de hidrogênio: 75 mL/min, fluxo de ar sintético: 100 mL/min, temperatura do injetor: 240o C, modo de injeção: splitless. Aldicarbe, carbofurano e carbaril: cromatógrafo a líquido de alta eficiên- cia, detector de UV (λ : 195 nm-aldicarbe e carbofurano e 210 nm - car- baril), coluna: aço inox, 125 mm x 4 mm, fase estacionária; Spheri- sorb ODS-2,5 µm, fase móvel: água purificada para CLAE-acetonitrila 65:35 v:v, fluxo da fase móvel: 0,75 mL/min, temperatura: 30°C. Carbendazim e tiabendazol: cromatógrafo a líquido de alta eficiência, detector de UV (λ : 285 nm), coluna: aço inox, 125 mm x 4 mm, fase estacionária: Spherisorb ODS-2,5 µm, fase móvel: solução de KH2 PO4 a 0,1% álcool metílico 30:70 v:v, fluxo da fase móvel: 0,60 mL/min, temperatura: 25°C. Curva-padrão – Injete as soluções de trabalho com no mínimo cinco diferentes con- centrações por duas ou três vezes ou até que haja repetitibilidade dos cromatogramas. Construa a curva–padrão dentro da faixa de linearidade do detector. Quantificação – A quantificação dos pesticidas do item a é feita por cromatografia a gás com detector de captura de elétrons e a dos pesticidas do item b por cromatografia a gás com detector fotométrico de chama (FPD) ou detector de nitrogênio e fósforo. Aldicarbe, carbofurano, carbaril, carbendazim e tiabendazol são quantificados por cro- matografia a líquido de alta eficiência com detector ultravioleta ou de fluorescência. A análise qualitativa é feita por padronização externa, por meio da comparação do tempo de retenção dos respectivos princípios ativos e a confirmação em coluna de diferente polaridade ou por detector seletivo de massa.
  11. 11. IAL - 697 Cálculo A análise quantitativa é feita por meio da curva-padrão, por comparação de área, levan- do em consideração o fator de diluição e a quantidade de amostra. O resultado deve ser expresso em miligrama do princípio ativo por quilograma da amostra (mg/Kg). Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Figura1 - Esquema do método multi-resíduo para determinação de resíduos de pesti- cidas em frutas e vegetais
  12. 12. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 698 - IAL Referências bibliográficas ANALYTICAL METHODS FOR PESTICIDE RESIDUES IN FOODSTUFFS, 6th ed. Inspectorate for Health Protection, Ministry of Public Health, Welfare and Sports, The Hague/Rijswijk, The Netherlands, 1996 (Part 1 – Multiresidue methods) HIEMSTRA, M.; JOOSTEN J.A.; KOK, A. Fully automated Automated solid-phase ex- traction clean-up and on-line liquid chromatographic determination of benzimidazole fungicides in fruit and vegetables. J. A.O.A.C. Int., p. 78, 1267-1274,1995. KOK, A. AND ; HIEMSTRA, M. Optimization, automation, and validation of the solid-phase extraction clean-up and on-line liquid chromatographic determination of N- methylcarbamate pesticides in fruits and vegetables. J. A.O.A.C. Int., 75, 1063-1074, 1992. JOINT FAO/WHO FOOD STANDARDS PROGRAMME CODEX ALIMENTAR- IUS COMMISSION. Portion of commodities to wich Codex Maximum Residue Limits apply and which is analyzed, v .2, Section 4, p. 391-404,1993. 371/IV Método multirresíduo para determinação de pesticidas e bifenilas policlo- radas em produtos gordurosos Este método aplica-se à determinação de resíduos dos pesticidas: lambdacialotrina, cipermetrina, DDT total (op’DDT, pp’DDT, pp’DDE, pp’DDD), dieldrin, deltame- trina, endosulfam total (alfa, beta e sulfato de endosulfan), endrin, HCH total (alfa, beta e gama HCH), heptacloro, heptacloro epóxido, hexaclorobenzeno, mirex, bifenilas policloradas policloradas (PCBs congêneres: 28, 52, 101, 138, 153, 180) em produtos gordurosos como: leite, ovo, manteiga, carnes (frango, peixe), etc. Os pesticidas são extra- ídos com uma mistura de solventes, a purificação é feita em uma única etapa em coluna de sílica gel e a determinação qualitativa e quantitativa é feita por cromatografia a gás com detector de captura de elétrons. Material Cromatógrafo a gás com detector de captura de elétrons, rotavapor, estufa, mufla, apare- lho de Soxhlet, balões volumétricos de diferentes capacidades, pipetas volumétricas, pipe- tas Pasteur, coluna cromatográfica de vidro de 15 mm de diâmetro por 30 cm de altura, com reservatório de 300 mL e torneira de teflon, provetas de diferentes capacidades, balões de fundo chato de 300 mL com boca esmerilhada, tubos graduados de 10 mL, dessecador, frasco Erlenmeyer com tampa, almofariz com pistilo, vials de vidro com tampa e septos de teflon para injetor automático.
  13. 13. IAL - 699 Reagentes n-Hexano grau resíduo Diclorometano grau residuo Sulfato de sódio anidro granulado grau resíduo Sílica Gel 60, 70-230 mesh Nota: faça previamente um branco de cada reagente para certificar-se de que não possuem interferentes para a análise. Solução-padrão – Pese, com precisão, 0,010 g de cada padrão analítico em béquer, trans- fira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com isoctano. Transfira para frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Todo frasco deve conter uma etiqueta com dados de procedência, identidade, concentração, estabilidade, data de preparação, prazo de validade e temperatura de armazenamento. Prepare soluções intermediárias com n-hexano. Faça diluições necessárias com n-hexano em cinco níveis (1/2 LQ, 1 LQ, 2 LQ, 5 LQ e 10 LQ) para construção da curva-padrão dentro da faixa de linearidade do detector. Nota: Limite de quantificação (LQ) – Menor concentração do analito na amostra que pode ser quantificada com precisão e exatidão aceitáveis, sob determinadas condições experimentais adotadas. Diclorometano-n-hexano 1:4 (v/v) – Transfira 200 mL de diclorometano para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione n-hexano. Misture bem e complete o volume com n-hexano. Diclorometano-n-hexano 1:1 (v/v) – Transfira 500 mL de diclorometano para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione n-hexano. Misture bem e complete o volume com n-hexano. Sílica gel ativada – Calcine quantidade suficiente de sílica gel a 450°C durante 4 horas. Deixe em dessecador até temperatura ambiente. Armazene em frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Ative a sílica gel calcinada por 5 horas a 135°C de dois em dois dias. Armazene em dessecador. Sílica gel desativada a 10% – Pese 13,5 g de sílica gel ativada em frasco Erlenmeyer com tampa. Adicione 1,5 g de água tratada e homogeneíze. Água tratada – Transfira água para um funil de separação de 1000 mL e extraia três ve- zes com 60 mL da mistura diclorometano-n-hexano 1:1 v/v. Despreze a fase orgânica e armazene a água. Algodão tratado – Coloque, em frasco de Soxhlet, o algodão e extraia com 200 mL de n-hexano por pelo menos cinco horas. Coloque em béquer e seque em estufa. Armazene em frasco de vidro com tampa. Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  14. 14. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 700 - IAL Preparação da Amostra Leite – Homogeneíze a amostra, pese 10 g, transfira para um almofariz contendo 15 g de sílica gel calcinada e macere até resultar em pó. Ovos – Homogeneíze a amostra (claras e gemas). Pese 5 g desta mistura e 5 g de água tratada, transfira para um almofariz contendo 15 g de sílica gel calcinada e macere até resultar em pó. Manteiga, carnes e outros produtos gordurosos – Homogeneíze a amostra, extraia a gordura por refluxo em Soxhlet com 200 mL de n-hexano. Pese 2 g de gordura e dilua com n- hexano em balão volumétrico de 25 mL. Procedimento – Transfira para uma coluna cromatográfica 15 g de sílica gel de- sativada a 10%. Adicione aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro e pos- teriormente a mistura com a sílica de leite ou ovo ou uma alíquota de 5 mL da so- lução de gordura diluída, equivalente a 0,4 g. Empacote muito bem. Elua com 200 mL da mistura de n-hexano-diclorometano na proporção de 4:1 (v/v) e em seguida, com 200 mL da mistura de n-hexano-diclorometano na proporção de 1:1 (v/v). Recolha os dois eluatos em balões de fundo chato de 350 mL e concen- tre em rotavapor à 40ºC, até quase a secura. Adicione aproximadamente 5 mL de n-hexano e concentre novamente até que todo o diclorometano seja evaporado. Transfira quantitativamente para um tubo graduado, completando o volume para 5 mL com n-hexano. Identifique e quantifique em cromatógrafo a gás com detector de captura de elétrons. Condições cromatográficas – Cromatógrafo a gás com ECD equipado com workstation, coluna capilar (30 m x 0,32 mm x 0,25 μm de filme) : fase estacionária: 5% de fenil metil siloxano, temperatura do detector: 320°C, temperatura do forno: 60°C (1min ); (60- 220)°C (10°C/min.), 220-280°C (3°C/min), 280°C (17 min) – tempo total: 60 min.; fluxo do gás de arraste: nitrogênio: 1 mL/min, temperatura do injetor: 240°C, modo de injeção: splitless. Curva-padrão – Injete as soluções de trabalho com diferentes concentrações por duas ou três vezes ou até que haja repetitibilidade dos cromatogramas. Construa a curva-padrão dentro da faixa de linearidade do detector. Análise da testemunha e estudos de recuperação – Para cada matriz a ser analisada, realize análise da testemunha e estudos de recuperações com 5 repetições em pelo menos dois níveis: 1 LQ e 10 LQ.
  15. 15. IAL - 701 Cálculo A análise quantitativa é feita por meio da curva-padrão com padronização externa, por comparação de área, levando em consideração o fator de diluição e quantidade de amos- tra. A análise qualitativa é feita por padronização externa, por meio da comparação do tempo de retenção dos princípios ativos e a confirmação em coluna de diferente polari- dade ou por detector seletivo de massa. O resultado deve ser expresso em miligramas do princípio ativo por quilograma da amostra (mg/Kg). Referência bibliográfica STEIWANDTER, H. – Contributions to sílica gel application in pesticide residue analy- sis. III. An on-line method for extracting and isolating chlorinated hidrocarbon pesticides and polychlorinated biphenyls (PCBs) from milk and dairy products. Fresenius Z. Anal. Chem., 312: 342-345, 1982. 372/IV Método para determinação de ditiocarbamatos em frutas e vegetais Este método aplica-se à determinação de resíduos de ditiocarbamatos em frutas e vegetais. Consiste na decomposição de ditiocarbamatos em meio de solução de cloreto estanoso e ácido clorídrico, gerando o CS2, que, após purificação, é coletado em uma solução de acetato de cobre e dietanolamina. Dois complexos cúpricos [cúprico-N-N- bis(2-hidroxietil)] são formados e medidos em conjunto por espectrofotometria na região de absorção no visível, no comprimento de onda de 435 nm, usando como referência um branco dos reagentes. Material Espectrofotômetro UV/VIS com cubetas de 1 cm; balança analítica; balança semi-analíti- ca; manta de aquecimento para balão de 1000 mL com 3 bocas; sistema de purificação de água; aparelho de destilação e decomposição constituído de: um balão de 1000 mL com 3 bocas, um destilador, um funil de separação, condensador, tubos lavadores de gases e conexões apropriadas (Figura 1); pipetas volumétricas de diferentes capacidades, balões volumétricos de diferentes capacidades, béqueres e provetas. Reagentes Álcool Dissulfeto de carbono com alto teor de pureza (D = 1,266 g/mL) Hidróxido de sódio Ácido clorídrico Acetato de chumbo Acetato de cobre Dietanolamina Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  16. 16. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 702 - IAL Cloreto estanoso di-hidratado Lactose Mancozebe - padrão analítico certificado Nitrogênio comum Água destilada e desmineralizada Nota: faça previamente brancos de cada reagente para certificar-se de que não possuem interferentes na análise. Solução R1 - acetato de chumbo – Dissolva 30 g de acetato de chumbo em água com aquecimento. Esfrie e transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução R2 - acetato de cobre – Dissolva 0,4 g de acetato de cobre mono-hidratado [Cu(CH3 COO)2 .H2 O] em 200 mL de álcool etílico com leve aquecimento. Esfrie e transfira para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com álcool. Solução R3 – Dilua 25 mL da solução R2 em um balão volumétrico de 100 mL com álcool. Solução R4 - reagente de cor – Adicione 100 mL de álcool, 30 mL da solução R3 e 25 g de dietanolamina em balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com álcool. Solução R5 - cloreto estanoso – Dissolva 40 g de cloreto estanoso dihidratado (SnCl2 . 2H2 O) em ácido clorídrico e transfira para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com ácido clorídrico. Solução R6 – Transfira cuidadosamente 20 mL da solução R5 e 20 mL de ácido clorídrico concentrado para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Solução R7 - Hidróxido de sódio – Pese 10 g de hidróxido de sódio e dissolva em água. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução-padrão em lactose para estudos de recuperação – Pese, em balão de rotavapor, quantidade suficiente de padrão para a realização das recuperações, adicione lactose, de maneira a obter a concentração desejada. Misture com cuidado até perfeita homogenei- zação, girando o balão durante 4 horas em rotavapor. Solução-padrão mãe CL1 – Em um balão de 50 mL contendo 40 mL de álcool, pese 1 mL de dissulfeto de carbono (D = 1,266 g/mL) e complete o volume com álcool.
  17. 17. IAL - 703 Solução-padrão intermediária CL2 – Dilua 5 mL da solução CL1 em um balão volumé- trico de 50 mL e complete o volume com álcool . Solução-padrão intermediária CL3 – Transfira 5 mL da solução CL2 para um balão volu- métrico de 250 mL e complete o volume com álcool, obtendo-se assim uma concentra- ção de 50,64 µg/mL de dissulfeto de carbono. Soluções-padrão de trabalho – Em um balão volumétrico de 25 mL, contendo 15 mL da solução R4 (reagente de cor), pipete 0,2; 0,4; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0 mL da solução-padrão intermediária CL3 e complete o volume com álcool etílico, resultando, respectivamente, nas concentrações de 0,4; 0,8; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0; 14,0 e 16,0 µg, CS2 por mL. Solução-branco de reagentes – Transfira 15 mL da solução R4 para um balão volumétrico de 25 mL e complete o volume com álcool. Procedimento – Quarteie e corte a amostra em pedaços pequenos. Homogeneíze e ar- mazene em frasco de vidro com tampa, no freezer. Monte o aparelho de destilação e de- composição, conforme Figura 1. Transfira 300 g da amostra para o frasco com três bocas do conjunto de destilação. Conecte o condensador na boca central e nas laterais, o tubo de nitrogênio e o funil de separação contendo 240 mL da solução R6 . No condensador (boca central do balão de 3 bocas) conecte, em seqüência, três tubos lavadores de gases, adicionando a cada tubo respectivamente: 10 mL da solução R1 , 10 mL da solução R7 e 15 mL da solução R3 . Abra o fluxo de nitrogênio brandamente. Aqueça o frasco rapida- mente até a ebulição por 60 minutos. Após o término, desligue o fluxo de nitrogênio e desconecte o terceiro tubo. Transfira para um balão volumétrico de 25 mL, completando o volume com álcool. Meça a absorbância a 435 nm em espectrofotômetro, contra o branco de reagentes. Análise da testemunha e estudos de recuperação – Para cada matriz a ser analisada, realize análise da testemunha e estudos de recuperação com 5 repetições em pelo menos dois níveis: 1 LQ e 10 LQ. Nota: Limite de quantificação (LQ) – Menor concentração do analito na amostra que pode ser quantificada com precisão e exatidão aceitáveis, sob determinadas condições experimentais adotadas. Curva-padrão – Meça a absorbância de todas as soluções de trabalho em espectrofotômetro, a 435 nm contra o branco de reagentes.Trace a curva absorbância versus concentração de CS2 . Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas
  18. 18. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 704 - IAL Figura 1 – Aparelho de destilação e decomposição para determinação de ditiocarbamatos em frutas e vegetais. Cálculo O resíduo, em mg/kg, de CS2 é calculado por padronização externa com a curva de cali- bração, levando em consideração o fator de diluição e a quantidade de amostra. Fatores de conversão do CS2 para alguns ditiocarbamatos: Ditiocarbamatos Fator de conversão Mancozebe 1,776 Manebe 1,742 Zinebe 1,810 Tiram 1,578 O resultado deve ser expresso em miligramas do princípio ativo ou de CS2 por quilograma da amostra (mg/Kg).
  19. 19. IAL - 705 Referências bibliográficas KEPPEL, G.E. Modification of the carbon dissulfide evolution method for dithiocarba- mate residues. J. Assoc. Off. Anal. Chem. v. 52, p. 162-169, 1969. KEPPEL, G.E. Collaborative study of the determination of dithiocarbamate residues by a modified carbon dissulfide evolution method. J. Assoc. Off. Anal. Chem. v. 54, p. 528-532, 1971. THEIR H.; ZEUMER, H. editors. Multiresidue method SIS. Ditiocarbamate and thiu- ram disulfide fungicides photometric determination. In: Manual of Pesticide Residue Analysis. Deutsche. Forschungsgemeinschaft, Pesticides Comm. Weinhein; Verlag, 1987. v. 1 p. 353-360. Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Colaboradores Heloísa Helena Barretto de Toledo, Sônia Bio Rocha, Tereza Atsuko Kussumi e Vera Regina Rossi Lemes

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