Phage display

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TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA DE FAGOS (Phage display)

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Phage display

  1. 1. TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA DE FAGOS Arianna Lanxin Ivson Cassiano Mayla Abrahim Virginia Andrade
  2. 2. TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA DE FAGOS Arianna Lanxin Ivson Cassiano Mayla Abrahim Virginia Andrade
  3. 3. Hibridomas
  4. 4. Anticorpos • São proteínas sintetizadas e excretadas por plasmócitos, derivadas dos linfócitos B, usadas pelo sistema imunológico para identificar e neutralizar corpos estranhos como bactérias, vírus ou células tumorais. Realizando assim a defesa do organismo (imunidade humoral).
  5. 5. Anticorpo monoclonal • Se liga a um determinado epítopo • São imunoglobulinas geradas por uma população geneticamente idêntica de células B • Formam anticorpos idênticos
  6. 6. Mecanismos de transcrição do genoma do bacteriófago na célula hospedeira
  7. 7. Phage display O conceito de exposição em fagos foi introduzido pela primeira vez para fragmentos peptídicos curtos Expressão funcional de polipetídeos de E. coli em bacteriófagos com atividade funcionalde enzimas George P. Smith, Science (1985)
  8. 8. Phage display • Desde a sua descrição por Smith em 1985, a tecnologia de “Phage Display”, exposição de biomoléculas em fagos, tem apresentado uma crescente utilização em diversas áreas das Ciências. • Este autor foi pioneiro a conseguir a expressão da enzima de restrição Eco RI como uma fusão da proteína três (pIII) do capsídeo do fago.
  9. 9. Phage display Métodos de estudos da interação entre biomoléculas • Com o uso desta técnica, é possível selecionar e isolar vetores de clonagem gerados a partir de bibliotecas genômicas, juntamente com seu produto gênico (peptídeo). • Por meio da utilização de fagos infecciosos filamentosos, esta técnica permite o rastreamento dos clones devido a ligação do fenótipo (o peptídeo de interesse) com o genótipo (o vetor de clonagem) que o expressou.
  10. 10. Metodologia Imunização 4 inoculações Monitoramento com imunoensaios RNAs codificantes de imunoglobulinas Baço Medula óssea
  11. 11. Metodologia Inserção de genes no bacteriófago Panning Lavagens Eluição Amplificação dos fagos em cultivo bacteriano - Fagos expondo moléculas específicas para o antigeno (ligação, eluição e amplificação) O processo é monitorado por titulação dos fagos e imunoensaios 3 a 5 x
  12. 12. Metodologia O processo é monitorado por titulação dos fagos e imunoensaios. O material é então isolado, sequenciado, analisad o quanto a afinidade e especificidade. Para então serem obtidos na forma solúvel, sem o fago, e destinadas a suas aplicações. Ligação, eluição e amplificação
  13. 13. Fagos • Bacteriófagos, ou simplesmente fagos. • A palavra “fagos” tem origem grega e mesmo traduzida como “comer”, não possui o significado preciso, pois bacteriófagos não comem bactérias. • Bacteriófagos são vírus muito pequenos da família Inoviridae que infectam bactérias. Podem ser vírus de DNA ou de RNA que infectam somente organismos procariotos. São formados apenas pelo nucleocapsídeo, não existindo formas envelopadas.
  14. 14. Fagos filamentosos Proteínas do capsídeo Permitem a apresentação de moléculas. pVIII – Grande quantidade de moléculas pequenas, até 8 aas pIII – Proteínas grandes como o fragmento Fc Mas usados f1, fd e M13 Infectam enterobactérias, como E. coli. Não causam infecção lítica.
  15. 15. Fagos
  16. 16. Transmissão do genoma A infecção de E. coli pelo fago filamentoso se inicia pela interação de pIII com o pilus sexual da célula e pela despolimerização do capsídeo, processo que é desencadeado pelo complexo bacteriano TolA. O genoma do fago penetra no citoplasma e é convertido em DNA de fita dupla , que serve de molde para a replicação e a produção das proteínas virais
  17. 17. Infecção
  18. 18. Fagomídeos • Fagomídeos são vetores de clonagem constituídos por DNA, os quais apresentam propriedades tanto de bacteriófago quanto de plasmídeo. • Este vetores carregam, além da origem de replicação plasmidial, uma origem de replicação derivada de bacteriófago. Diferem de plasmídeos comuns por terem a capacidade de serem empacotados em capsídeos de fagos, em função de possuírem também uma sequência gênica de sinalização para empacotamento. • Fago HELP – empacota o fagomídeo
  19. 19. Bibliotecas de anticorpos • É possível construir bibliotecas de fagos que expressam o anticorpo integral ou somente as porções Fab e scFv, que interferem minimamente na estabilidade da partícula viral
  20. 20. Aplicações • Mapeamento de epítopos de diversas proteínas antigênicas, constituintes de vários agentes causadores de doenças. • Reagentes para diagnósticos • Desenvolvimento de vacinas • Novas drogas • Ativadores e inibidores enzimaticos • Estudos moleculares na interação patogeno-hospedeiro • Testes de imunogenicidade • Quimioterápicos ou oligonucleotídeos, anti-senso para tumor.
  21. 21. Vantagem • Poucos animais em teste • Alta especificidade; • Alta afinidade; • Determinação de um só epítopo de um antigénio; • Alta homogeneidade; • Ausência de anticorpos não específicos; • Maior facilidade de caracterização; • Reduzida variabilidade de lote para lote
  22. 22. Desvantagem • Normalmente são extremamente caros; • Reconhecimento de um só epítopo de um antigénio. Esse epítopo pode estar destruído (por ex: pela fixação) mesmo que exista a molécula total do antigénio; • Se o soro não foi produzido contra um epítopo específico do antigénio que se quer detectar e se existirem outros antigénios com esse epítopo, a imensa vantagem da alta especificidade será inútil

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