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nordestino. Revista Brasileira de Oleaginosas e Fibrosas, Campina Grande, PB. 15: 789-
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Bertozzo, F.; Machado...
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Heiffig, L.S.; Câmara, G.M.S. Potencial da cultura do pinhão-manso como fonte de
matéria-prima para o Programa Nacional...
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Rossetto, M. Petrobras foca aportes em novos projetos. Brasilagro; 12 ago. 2011.
Diponível em: < http://www.brasilagro....
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Stein, V.C. Organogênese Direta em Explantes Caulinares de Ingazeiro (Inga vera Willd.
subsp. affinis (DC.) T.D. Penn.)...
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  1. 1. 0 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS DEPARTAMENTO DE RECURSOS NATURAIS CAMPUS DE BOTUCATU PROJETO DE PESQUISA EM INICIAÇÃO CIENTÍFICA “Micropropagação pela multiplicação de gemas axilares e apicais de pinhão manso (Jatropha curcas Linn.) a partir de germoplasma cultivado em condições ex vitro” Bolsista: Henrique Curi Penna Orientador: Prof. Dr. Isaac Stringueta Machado BOTUCATU – SP Junho/ 2012
  2. 2. 1 1. Resumo A utilização do pinhão-manso na produção de biodiesel é bastante promissora para o setor do agronegócio; as potencialidades da espécie são diversas, tais como adaptação às regiões marginais inaptas a outras culturas, além de seus princípios ativos medicinais de comprovada eficácia. Além disso, contribui também para a conservação do meio ambiente por ser biomassa renovável, sequestradora de CO2 da atmosfera, e tudo aliado à capacidade de proteger os solos contra erosão e lixiviação de nutrientes. Contudo, estima-se que serão necessários entre 2 a 5 anos para que se tenham as primeiras cultivares melhoradas; a micropropagação pode acelerar os métodos convencionais de propagação vegetativa e auxiliar no desenvolvimento e multiplicação dos genótipos elite selecionados nos programas de melhoramento vegetal. Porém, a literatura científica pertinente é escassa e faltam dados de pesquisa com mudas de pinhão-manso produzidas in vitro. Este trabalho tem como objetivo, o desenvolvimento de protocolo laboratorial para a micropropagação de pinhão manso (Jatropha curcas L.), através da multiplicação de brotações por meio da proliferação de gemas axilares e apicais; coletadas de matrizes promissoras selecionadas em banco de germoplasma ex vitro do DRN/FCA/Unesp-Botucatu/SP. Para avaliação da indução da multiplicação de brotações, serão comparados os reguladores vegetais Benzilaminopurina (BAP) e Cinetina (KIN), em diferentes concentrações e balanceamentos, adicionados ao meio nutritivo basal de Murashige & Skoog: 0,50 mg.L-1 de BAP (T1), 1,00 mg.L-1 de BAP (T2), 2,00 mg.L-1 de BAP (T3), 3,00 mg.L-1 de BAP (T4) e 0,5 mg.L-1 de KIN (T5); 1,00 mg.L-1 de KIN (T6), 2,00 mg.L-1 de KIN (T7), 3,00 mg.L-1 de KIN (T8); todos os tratamentos serão suplementados com a auxina Ácido Indolil- butírico (AIB) na concentração de 0,25 mg.L-1 . Após tratamento de desinfestação e proteção antioxidante, gemas axilares e apicais selecionadas serão inoculadas nos diferentes tratamentos, em condições assépticas da câmara de fluxo laminar, e, em seguida, dispostas em sala de crescimento sob condições ambientais controladas. Os resultados poderão permitir elaboração de protocolo laboratorial e fluxograma da produção de mudas com maior rapidez, uniformidade anatômica do estande, fidelidade genética às matrizes selecionadas, e limpeza de possíveis fitopatógenos endógenos (limpeza clonal); características desejáveis para o setor produtivo agroindustrial e possibilidade de inclusão
  3. 3. 2 de pequenos produtores rurais, pela maior acessibilidade gerada pela maior oferta de mudas. 2. Introdução e justificativa – síntese da bibliografia fundamental O Brasil, pela sua extensão territorial e excelentes condições edafoclimáticas, é considerado um dos países mais propícios para a exploração de biomassa para fins alimentícios, químicos e energéticos. Sendo assim, reúne condições ideais para se tornar um grande produtor mundial de biodiesel, pois dispõe de extensas áreas agricultáveis, parte delas não propícias ao cultivo de gêneros alimentícios, mas com solo e clima favoráveis ao plantio de inúmeras espécies oleaginosas. O uso do biodiesel traz uma série de benefícios associados à redução dos gases de efeito estufa, e de outros poluentes atmosféricos, tais como o enxofre, além da redução do consumo de combustíveis fósseis. O Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB), criado por Decreto Lei em 23 de dezembro, e complementado pela Lei n° 11.097 de 13 de janeiro de 2005, estabelece a obrigatoriedade da mistura de biodiesel ao diesel de petróleo. A antecipação da obrigatoriedade da adição de 5% de biodiesel ao diesel (B-5) de 2013 para 2010 acarreta a intensificação de pesquisas inerentes à cadeia produtiva; tendo em vista que nos próximos quatro anos, o segmento de biodiesel terá investimentos de US$ 600 milhões pela Petrobras (Rossetto, 2011). Diante dessa importância e considerando que o percentual do biodiesel na mistura com diesel poderá passar, em curto tempo, a 7% e posteriormente a 10%, novos processos são frequentemente propostos para obtenção deste biocombustível e enfrentar o desafio da obtenção de matéria-prima (Soares, 2011). A utilização do pinhão-manso, como matéria-prima para a produção de biodiesel, vem sendo amplamente discutida e avaliada, uma vez que representa promissora cultura a ser implantada em áreas que não apresentem características edafoclimáticas favoráveis ao cultivo agronômico, favorecendo a distribuição da cultura por todas as regiões brasileiras, permitindo a melhor execução do Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel – PNPB (Heiffig & Câmara, 2006).
  4. 4. 3 A espécie possui, também, características compatíveis com o perfil da agricultura familiar: é uma espécie perene, não necessita de renovação anual do cultivo, dependente de mão-de-obra e os espaçamentos adotados permitem, nos primeiros anos de cultivo, o consórcio com outras culturas, podendo ser produzidos em uma mesma área energia e alimento. Segundo Ungaro (2006), na escolha da oleaginosa para a produção do biodiesel alguns fatores devem ser levados em conta, como: o preço da matéria-prima deve ser compatível com a necessidade de fornecer biodiesel com preços equivalentes ao diesel mineral; portanto, o custo de produção da biomassa energética deve ser o mais baixo possível para tornar o produto final economicamente viável e a torta ou farelo, subproduto da extração do óleo vegetal, deverá ser aproveitado, sempre que possível, na alimentação humana ou animal. No caso do pinhão-manso, a torta residuária da extração do óleo pode ser usada como um rico fertilizante orgânico, substituto do fertilizante químico. Desintoxicada, a torta pode também ser transformada em ração, como tem sido feito com a torta de mamona, e a casca dos pinhões pode ser usada como carvão vegetal e matéria-prima na fabricação de papel. A torta obtida a partir do albúmen contém em torno de 57% de proteína bruta, acrescida de carboidratos, lipídeos, sais minerais e vitaminas. Ao lado do aspecto puramente quantitativo e importante da qualidade da proteína, determinada por sua composição em aminoácidos, tornando-se, de baixo teor de fibra, de emprego potencial na ração de monogástricos, inclusive o homem (Silva; 2006). A reprodução desta espécie pode ser por via sexuada ou vegetativa, em ambos os casos, contudo, ocorre limitação do cultivo com relação ao longo tempo que a planta leva para produzir frutos em número e teor de óleo significativo; este período pode chegar a 4 anos. Além disto, há a necessidade de se obter sincronização do amadurecimento dos frutos dentro da mesma planta, favorecendo procedimentos de colheita, que onera o custo de produção por ocorrer mais de 4 vezes ao ano. Na área de seleção de variantes genéticos e melhoramento da espécie, tornam-se interessantes quaisquer esforços no sentido de sincronizar e reduzir o período de amadurecimento dos frutos. O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma das culturas em pauta nas reuniões da Embrapa Agroenergia (Brasília/DF), que com pesquisadores e técnicos de outras unidades
  5. 5. 4 da Empresa e instituições parceiras, lançou o projeto BRJATROPHA, ("Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação de Pinhão-Manso para Produção de Biodiesel"). O projeto, iniciado no ano passado, conta com financiamento parcial da Finep, tem término previsto em 2013 e vem sendo estudado para que se firme com o objetivo de, a médio prazo, abastecer com Pinhão Manso o Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel – PNPB (Collares, 2011). Considerando que o pinhão manso é uma cultura perene, estima-se que serão necessários entre 2 a 5 anos para que se tenham as primeiras cultivares melhoradas e informações científicas embasadas sobre o sistema de produção nas diversas regiões do Brasil (Laviola, 2009) A micropropagação é uma das técnicas mais promissoras da cultura de tecidos de plantas in vitro, onde pequenos fragmentos de tecido vegetal, explantes, são isolados, desinfestados e cultivados assepticamente; com o objetivo de produzir plantas idênticas à original ou regenerar plântulas saudáveis, vigorosas e puras (Andrade, 2002). Portanto, é uma excelente ferramenta para clonar plantas em escala comercial, além de colaborar na realização de estudos de transformação genética, conservação de espécies vegetais e introdução de novas variedades. Está clara a existência de grandes desafios para que o pinhão manso possa se tornar viável para a produção de óleo combustível. Embora seja uma espécie de múltiplas potencialidades, existem algumas limitações na propagação in vitro; é o grande conteúdo de látex que a torna recalcitrante para a cultura de tecidos (Sardana et al., 1998, citado por Rajore & Batra, 2005). 2.1. Jatropha curcas Linn. – pinhão manso 2.1.1. A planta e suas utilizações. O pinhão manso (Jatropha curcas L.) pertencente à família Euphorbiaceae (Figura 1), a mesma da mamona e da mandioca, é nativo da América tropical e é conhecido também pelos nomes populares: pinhão-paraguaio, pinhão-de-purga, pinhão-de-cerca, purgante-de-cavalo, manduigaçu, manduibiguaçú, figo-do-inferno, purgueira, mandythygnaco e pinhão croá. É um arbusto/arvoreta, semidecíduo, de crescimento rápido, cuja altura normal é dois a três metros, mas pode alcançar até cinco metros em condições
  6. 6. 5 especiais. O diâmetro do tronco é de aproximadamente 20 cm; possui raízes curtas e pouco ramificadas, caule liso, de lenho mole e medula desenvolvida, mas pouco resistente; floema com longos canais que se estendem até as raízes, nos quais circula o látex, suco leitoso que ocorre com abundância em qualquer ferimento. O tronco ou fuste é dividido desde a base, em numerosos ramos, com numerosas cicatrizes produzidas pela queda das folhas na estação seca, as quais ressurgem logo após a primeira chuva (Cortesão, 1956; Brasil, 1985). Figura 1- Matriz de pinhão manso (Jatropha curcas L.) selecionada em banco de germoplasma da Fazenda Experimental de São Manuel-FCA/UNESP, Botucatu/SP. O pinhão-manso é resistente a um alto grau de aridez, podendo ser cultivado até em desertos. Ainda de acordo com Cortesão (1956) e Brasil (1985), as folhas do pinhão são verdes, esparsas e brilhantes, largas e alternas, em forma de palma com três a cinco lóbulos e pecioladas, com nervuras esbranquiçadas e salientes na face inferior. Floração monóica, apresentando na mesma planta, mas com sexo separado, flores masculinas, em maior número, nas extremidades das ramificações e femininas nas ramificações as quais são amarelo-esverdeadas e diferencia-se pela ausência de pedúnculo articulado nas femininas que são largamente pedunculadas. A florada é longa, sendo a polinização feita por abelhas ou outros insetos, e cada inflorescência, em forma de cacho, dá origem a 10 ou mais frutos (Cáceres, 2007). O fruto é capsular ovóide, achatado nas extremidades, com diâmetro de 1,5 a 3,0 cm. É trilocular com uma semente em cada cavidade, formado por um pericarpo ou casca dura e lenhosa, indeiscente, inicialmente verde, passando a amarelo, castanho e por fim
  7. 7. 6 preto, quando atinge o estágio de maturação. Contém de 53 a 62% de sementes e de 38 a 47% de casca, pesando cada uma de 1,53 a 2,85 g. O início da produção acontece por volta do décimo mês após a plantação, mas a plenitude só é atingida por volta do terceiro ou quarto ano, mantendo-se produtiva durante pelo menos 40 anos (Arruda et al., 2004). A semente é oblonga, elipsóide e relativamente grande; quando secas medem de 1,5 a 2 cm de comprimento e 1,0 a 1,3 cm de largura; tegumento rijo, quebradiço, de fratura resinosa. Debaixo do invólucro da semente existe uma película branca cobrindo a amêndoa, albúmen abundante, branco, oleaginoso, contendo o embrião provido de dois largos cotilédones achatados. A semente do pinhão pesa de 0,551 a 0,797 g, pode ter, dependendo da variedade e dos tratos culturais, etc., de 33,7 a 45%de casca e de 55 a 66% de amêndoa; é constituída, em média, de 75% de embrião e 25% de tegumento, apresenta pequena variação de tamanho e densidade e não apresenta problemas de dormência. Nessas sementes, segundo a literatura, são encontradas ainda 7,2% de água, 37,5% de óleo e 55,3% de açúcar, amido, albuminóides e matérias minerais, sendo 4,8% de cinzas e 4,2% de nitrogênio (Tideman & Hawker, 1982, citado por Rajore & Batra, 2005). Como outros membros da família botânica, o pinhão manso é rico em material hidrocarbonado reduzido que pode ser convertido em compostos similares àqueles produzidos a partir do petróleo. Trata-se de um eficiente combustível substituto dos motores a diesel e também é um ingrediente essencial para a indústria de saboaria e tintas. Também é considerada excelente espécie para programas agroflorestais e ser usada como cerca viva, no controle de erosões do solo, lixiviação de nutrientes e retenção de dunas de areia (Sardana et al., 1998, citado por Rajore & Batra, 2005). Segundo Saleme (2005), a planta de pinhão-manso cresce de forma espontânea em solos secos, pedregosos, pouco férteis e em climas desfavoráveis à maioria das culturas alimentares tradicionais. Apresenta raízes profundas, melhora o microclima, diminui a erosão, fertiliza o solo com a queda de suas folhas, além de poder ser plantado em consorciação com outras oleaginosas ou culturas de subsistência como o milho, o feijão, o algodão e o amendoim, dentre outras. A torta residuária da extração do óleo pode ser usada como um rico fertilizante orgânico, substituto do fertilizante químico. Desintoxicada, a torta pode também ser transformada em ração, como tem sido feito com a torta de mamona; e a casca dos pinhões pode ser usada como carvão vegetal e matéria-prima na fabricação de
  8. 8. 7 papel. Já o óleo produzido destina-se, quase que em sua totalidade, à fabricação de sabão. A torta obtida a partir do albúmen contém em torno de 57% de proteína bruta, acrescida de carboidratos, lipídeos, sais minerais e vitaminas. Ao lado do aspecto puramente quantitativo e importante da qualidade da proteína, determinada por sua composição em aminoácidos, tornando-se, de baixo teor de fibra, de emprego potencial na ração de monogástricos, inclusive o homem (Silva; 2006). 2.1.2. Perspectivas da cultura. Trata-se de uma planta de ciclo perene, que possui ótima produtividade, podendo produzir de 1 a 6 toneladas de óleo por hectare, dependendo da idade da planta (Saleme, 2006). Para regiões onde existem condições edafoclimáticas desfavoráveis, o pinhão- manso vem sendo considerado uma opção agrícola viável devido às suas características fisiológicas como a forte resistência à seca; permitindo um desenvolvimento em solos pouco férteis e arenosos, de modo geral inaptos a outras culturas. O resíduo da extração do óleo pode ser usado para recuperação de solos, pois é rico em NPK e depois de desintoxicado usado como ração animal. Outro aspecto positivo é a fácil conservação da semente após a colheita, podendo ser armazenada por longos períodos sem os inconvenientes da deterioração do óleo como acontece com as sementes de outras oleaginosas. Segundo Peixoto (1973), o pinhão-manso pode ser utilizado na conservação do solo, pois o cobre com uma camada de matéria seca, reduzindo, dessa forma, a erosão e a perda de água por evaporação, evitando enxurradas e enriquecendo o solo com matéria orgânica decomposta. O plantio do pinhão já é tradicionalmente utilizado como cerca viva para pastos no Norte de Minas Gerais, com a vantagem de não ocupar áreas importantes para outras culturas e pastagens e favorecer o consórcio nos primeiros anos, pois o espaçamento entre plantas é grande (Purcino & Drummond, 1986). Além destes usos, o pinhão manso pode ser utilizado para outros fins, tais como: substituição parcial do arame em cercas vivas, já que os animais evitam tocá-lo devido ao látex cáustico que escorre das folhas arrancadas ou feridas; e pode ser usado como suporte para plantas trepadeiras como a baunilha (Vanilla
  9. 9. 8 aromática), visto que o tronco possui casca lisa e macia; atua, ainda, como fixador de dunas na orla marítima (Peixoto, 1973) Na medicina doméstica, aplica-se o látex da planta como cicatrizante, hemostático e também como purgante. As raízes são consideradas diuréticas e antileucêmicas e as folhas são utilizadas para combater doenças de pele, sendo eficazes também contra o reumatismo e atua como anti-sifilítico. As sementes são tradicionalmente utilizadas como purgativo (Arruda, 2004). Nas pequenas propriedades, onde há mão-de-obra familiar disponível, a cultura pode se desenvolver sendo mais uma fonte de renda, não somente pelo baixo custo da sua produção, mas também pelas características físico-químicas do óleo de pinhão-manso para fins carburantes, conforme resumido na Tabela 1. Tabela 1. Caracterização físico-química do óleo de pinhão-manso Características Físico-químicas Teor em ácidos Graxos Livres (como ácido oléico) (%) 0,96 Densidade a 25ºC (g/cm3 ) 0,9069 Índice de Refração a 25ºC 1,4680 Índice de Saponificação 189,0 Índice de Iodo 97,0 Insaponificáveis (%) 1,1 Índice de Peróxido 9,98 Ponto de Solidificação (ºC) <-10,0 Cor ASTN 1,0 Cinzas (%) <0,1 Poder Calorífico Superior (Kcal/kg) 9,350 Peso Molecular Médio (cromatografia gasosa) 866 Viscosidade a 37,8ºC (cSt) 31,5 CHN Carbono 76,89 Hidrogênio 11,44 Oxigênio 11,67
  10. 10. 9 Índice de Hidroxila 76,6 Fonte: CETEC (Heiffig & Câmara, 2006). As avaliações realizadas pela Petrobrás – CENPES no biodiesel produzido a partir da transesterificação etílica, sob 60ºC, utilizando 1% de catalisador e 80% de etanol, consagraram-no como de excelente qualidade, com todos os parâmetros atendendo às normas da Agência Nacional do Petróleo – ANP, notadamente baixa viscosidade (4,8 cSt), densidade, cor, cetano, insaturação e alto grau de pureza (Tabela 2). Tabela 2. Propriedades do biodiesel produzido a partir do óleo vegetal de pinhão-manso Parâmetros Resultados Densidade 0,89 Viscosidade 4,8 cP Umidade 0,08% (KF) Ésteres 100% Cetano 54 Fonte: Petrobras/CENPES (Heiffig & Câmara, 2006). A cultura do pinhão-manso caracteriza-se por cobrir todas as lacunas consideradas pelo Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel e Plano Nacional de Agroenergia, desde a inclusão social, a fixação do homem no campo, a utilização da agricultura familiar, a abrangência de áreas menos favorecidas quanto ao solo e ao clima, até o biodiesel produzido dentro das especificações da ANP. Diversas Unidades Descentralizadas da Embrapa, instituições de pesquisa e universidades do país, contando também com parceria com outros países, já estão trabalhando no desenvolvimento de tecnologia para o pinhão manso, incluindo a criação de bancos de germoplasma, experimentos a campo, estudos em casa-de-vegetação e em laboratório. No entanto, por se tratar de uma planta perene, que só estabelece a produção após o quarto ano, estima-se que serão necessários pelo menos cinco anos para que se tenham informações mais seguras sobre a cultura (Severino, 2007).
  11. 11. 10 Na Tabela 3 são apresentados dados referentes ao percentual de óleo e a necessidade de área de produção do pinhão-manso em comparação às culturas do algodão, da soja e da mamona, reforçando suas características promissoras como matéria-prima para a produção de biodiesel. Tabela 3. Dados comparativos de quatro culturas oleaginosas para a produção de biodiesel Culturas Percentual de óleo Qtde. de grãos necessárias para produzir 40 mil t ano-1 de biodiesel Área necessária para produzir 40 mil t ano-1 de biodiesel Algodão 15% 266.670 126.504 Soja 18% 235.300 86.000 Mamona 48% 83.200 104.000 Pinhão-manso 38% 106.400 26.600 Fonte: Petrobras/CENPES (Heiffig & Câmara, 2006) Considerando-se o risco de investimento baixo, o retorno rápido e o período de vida útil da planta de pinhão-manso, produzindo sementes e, conseqüentemente Biodiesel, que é um produto estratégico em nível mundial, a cultura demonstra ser viável e promissora no Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel – PNPB, do governo federal (Heiffig & Câmara, 2006). 2.2. Micropropagação in vitro do Pinhão Manso Com o advento da biotecnologia, a técnica de micropropagação apresenta um forte impacto sobre a produção de plantas em larga escala e centenas de protocolos foram estabelecidos visando à produção comercial de mudas, como também a preservação de espécies vegetais. Conforme o explante utilizado e sua subseqüente manipulação, a micropropagação pode ser conduzida por três maneiras diversas (Grattapaglia & Machado, 1998), dentre elas, tem se destacado a multiplicação por meio da proliferação de gemas
  12. 12. 11 axilares, em diferentes espécies e cultivares comerciais (Garcia et al., 2010; Bertozzo & Machado, 2010; Machado et al., 2009; Sartori et al., 2005). O ápice caulinar (Figura 2) consiste do meristema apical com primórdios foliares subjacentes e, em algumas situações, inclui as folhas emergentes que pode desenvolver-se diretamente em parte aérea, e em meio de cultura adequado, sem passar pela fase de calo (Grattapaglia & Machado, 1998). Uma das vantagens deste sistema é, na maioria dos casos, a manutenção da identidade do genótipo regenerado, em virtude de as células do meristema manterem mais uniformemente a sua estabilidade genética (Murashige, 1962). A biotecnologia aliada a programas de melhoramento poderá auxiliar no desenvolvimento de cultivares agronômicas e na produção comercial de mudas com alta qualidade fitossanitária em um menor período de tempo. Considerando que o pinhão manso é uma cultura perene, estima-se que serão necessários entre 2 a 5 anos para que se tenham as primeiras cultivares melhoradas e informações científicas embasadas sobre o sistema de produção nas diversas regiões do Brasil. Para o pinhão-manso se tornar viável com a produção de óleo combustível alguns desafios foram lançados, pois não existem cultivares, sendo que a diversidade ainda é desconhecida. A colheita ainda é desuniforme onerando em custos de produção (Laviola, 2009). Segundo Souza (2006), um pequeno número de explantes pode regenerar milhares de plantas. Os clones regenerados são idênticos ou superiores fenotipicamente à planta matriz, requerendo curto período de tempo para produção, reduzido espaço físico de produção e constitui uma porta para eliminar patógenos, entre outros. Figura 2- Ápice caulinar apresentando primórdios foliares
  13. 13. 12 Se a capacidade de multiplicação de brotações a partir de gemas for viável com o pinhão manso, será extremamente interessante para a expansão comercial da cultura, pois auxiliaria na obtenção de um estande homogêneo, a partir de matrizes promissoras selecionadas em campo; colaborando na sincronização do amadurecimento dos frutos e facilitando, assim, a colheita. A Figura 3 ilustra, após 45 dias de estabelecimento in vitro, os pontos meristemáticos iniciais em gema apical inoculada em meio MS suplementado com 2,0 mg.L-1 de BAP. A recalcitrância em responder às técnicas in vitro, ocorrida em muitas espécies da família Euphorbiaceae, implica em uma grande limitação a ser superada. A literatura científica pertinente permanece obscura e os artigos não trazem descrições suficientes acerca da obtenção do explante, composição do meio de cultura ou concentração dos reguladores vegetais; o que torna difícil suas reprodutibilidades. Os reguladores vegetais são substâncias que em concentrações relativamente baixas provocam alterações fisiológicas importantes nos vegetais. Seus mecanismos de ação, em nível molecular, permanecem ainda obscuros. Contudo, os efeitos das auxinas, cinetinas e citocininas são importantes na diferenciação de tecidos e orgãos in vitro (Sartori et al., 2005; Machado et al., 2009; Bertozzo &Machado, 2010; Garcia et al., 2010). As citocininas são reguladores vegetais que participam ativamente dos processos de divisão e diferenciação celular, particularmente em cultura de tecidos. Dentro desta classe, o BAP (6 – Benzilaminopurina), tem se destacado para a multiplicação de partes aéreas e indução de gemas adventícias, além de apresentar custo mais acessível em relação às demais (Gratapaglia & Machado, 1998). Porém a Cinetina não está presente nas plantas, e Figura 3- Ápice caulinar estabelecido in vitro e em fase de multiplicação.
  14. 14. 13 sua interação com auxina, proporciona a diferenciação de tecidos de uma determinada cultura (Castro, 2011). 3. Objetivos O trabalho tem como objetivo principal o desenvolvimento de protocolo laboratorial para a micropropagação de pinhão manso (Jatropha curcas L.) a partir de gemas apicais e axilares selecionadas de plantas promissoras do banco de germoplasma da Fazenda Experimental de São Manuel (FCA/UNESP – São Manuel/SP). O estudo pretende também viabilizar seleção de variantes genéticos mais produtivos, que promovam otimização do tempo de produção das mudas, bem como sincronização do amadurecimento dos frutos, favorecendo procedimentos de colheita. A pesquisa pretende estudar o balanceamento de reguladores vegetais (BAP, KIN e AIB) que poderá contribuir para o estabelecimento de protocolo para a composição de meios de cultura específicos para a indução da micropropagação in vitro; em complementação, serão avaliadas as condições ambientais (luz, temperatura e umidade) ideais para cultivo in vitro e ex vitro. Os resultados poderão permitir maior rapidez na disponibilidade de mudas uniformes do ponto de vista genético e anatômico, assépticas, com alta qualidade nutricional e livre de contaminações endógenas por microrganismos fitopatogênicos; características desejáveis para o setor produtivo. 4. Material e Métodos O trabalho será conduzido nos campos experimentais, casa de vegetação e Laboratório de Biotecnologia de Plantas do Departamento de Recursos Naturais, setor Ciências Ambientais, da Faculdade de Ciências Agronômicas – Fazenda Lageado - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Botucatu/SP. 4.1. Seleção de plantas promissoras, coleta de gemas axilares e apicais e preparação do meio de cultura Explantes serão coletados de matrizes de pinhão-manso selecionados no banco de germoplasma instalado na Fazenda Experimental de São Manuel (FCA/UNESP – São Manuel/SP). Na seleção das plantas matrizes serão considerados os seguintes critérios:
  15. 15. 14 precocidade da frutificação, produtividade, altura, número de ramos e resistência à deiscência. Será empregado o meio nutritivo basal MS (Murashige & Skoog, 1962) , modificado com 0,03g.L-1 de inositol, 15g.L-1 de sacarose (D+), 0,125g.L-1 de PVP (Polivinilpirrolidona). O pH aferido em 5,8, antes da autoclavagem a 120°C e 1atm, por 20 minutos. 4.2. Obtenção de explantes e indução da brotação in vitro. Os explantes coletados passarão pelo seguinte tratamento: 3 imersões consecutivas em água morna e detergente não iônico por 25 minutos; em seguida, na câmara de fluxo laminar, imersão em solução de álcool 70% por 1 minuto e permanência em hipoclorito de sódio 2 a 3% por 15 minutos; e no final, três enxágües em água destilada e deionizada estéril. Após o tratamento de desinfestação, os explantes serão manipulados e inoculados em meio nutritivo basal MS modificado e suplementado com as seguintes concentrações de reguladores vegetais (BAP - 6-benzilaminopurina, KIN e AIB -ácido indolbutírico): 0,50 mg.L-1 de BAP (T1), 1,00 mg.L-1 de BAP (T2), 2,00 mg.L-1 de BAP (T3), 3,00 mg.L-1 de BAP (T4) e 0,5 mg.L-1 de KIN (T5); 1,00 mg.L-1 de KIN (T6), 2,00 mg.L-1 de KIN (T7), 3,00 mg.L-1 de KIN (T8); sendo que em todos os tratamentos será adicionado 0,25 mg.L-1 de AIB, conforme resumido na Tabela 4. Tabela 4. Balanço de reguladores vegetais na pesquisa da indução da micropropagação in vitro de pinhão manso. Concentrações (mg.L-1 ) 0,5 1,0 2,0 3,0 BA T1 T2 T3 T4 KIN T5 T6 T7 T8 As composições assim propostas serão comparadas com meio basal sem a adição de reguladores vegetais (T0). O delineamento experimental é o inteiramente casualizado e o
  16. 16. 15 número de repetições será de 15 por tratamento, sendo cada repetição constituída por um explante por frasco de cultura, contendo 10 ml do meio específico. O pH será ajustado em 5,8 antes da autoclavagem a 120°C e 1atm, por 20 minutos. As culturas serão mantidas em câmara de germinação (B.O.D.), com temperatura constante de 27°C, inicialmente no escuro por 72 horas e, posteriormente com fotoperíodo de 16 horas de luz/8h de escuro e intensidade luminosa de 1000 lux. 4.3. Análise dos resultados - A experimentação será monitorada através de 4 avaliações visuais da taxa de multiplicação de brotações e número de folhas desenvolvidas em cada brotação, numa freqüência de 15 dias, e ao final de 60 dias de cultivo. Os resultados obtidos serão comparados estatisticamente através do programa ASSISTAT Versão 7.6 201.1 (Silva, 2011). 5. Plano de trabalho e cronograma de execução: O plano de trabalho encontra-se resumido no quadro de atividades/período: Atividade/ período Descrição Resultados 1.Levantamento bibliográfico (Julho a Setembro/2012) Complementação da revisão de literatura; manutenção do banco de germoplasma da Fazenda São Manuel; seleção de matrizes e obtenção de explantes. Complementação e atualização das informações deste Projeto.
  17. 17. 16 2.Obtenção e inoculação de explantes para o cultivo in vitro. (Outubro a Dezembro/2012) Testes preliminares da proteção antioxidante e desinfestação de explantes para o estabelecimento do cultivo in vitro, elaboração de meios de cultura e inoculação de explantes segundo o delineamento experimental. Cultura primária (“habituada”) e indução de brotações in vitro. 3.Estudo da indução de brotações in vitro (Janeiro a Março/2012) Repicagem e subcultivos das brotações desenvolvidas in vitro e avaliação dos resultados parciais. Obtenção de protocolos para micropropagação in vitro. 4.Análise dos resultados (Abril a Maio/2012) Obtenção e análise dos resultados finais, discussão dos resultados e conclusões. Avaliação conclusiva do protocolo empregado na pesquisa. 5.Relatório Final e Divulgação (Junho/2012) Elaboração do relatório final e encaminhamento de artigo para divulgação. Relatório final da e divulgação da pesquisa. 6. Bibliografia Andrade, S.R.M. Princípios da cultura de tecidos vegetais. Planaltina: Embrapa Cerrados, 2002, 16p. Arruda, F.P. de; Beltrão, N.E. de M.; Andrade, A.P. de; Pereira, W. E.; Severino, L.S. Cultivo do pinhão manso (Jatropha curcas L.) como alternativa para o semi-árido
  18. 18. 17 nordestino. Revista Brasileira de Oleaginosas e Fibrosas, Campina Grande, PB. 15: 789- 799, 2004. Bertozzo, F.; Machado, I.S. Meios de cultura no desenvolvimento de ápices caulinares de mamoneira (Ricinus communis L.) in vitro. Ciência e Agrotecnologia, Lavras,MG. 34: 1477-1482, 2010. Brasil. Ministério da Indústria e do Comércio. Secretária de Tecnologia Industrial. Produção de combustíveis líquidos a partir de óleos vegetais. Brasília: STI/CIT, 1985. 364p. (Documentos, 16). Cáceres, D.R.; Portas, A.A.; Abramides, J.E. Pinhão-manso. 2007. Artigo em Hypertexto. Disponível em: http://www.infobibos.com/Artigos/2007_3/pinhaomanso/index.htm. Cortesão, M. Culturas tropicais: plantas oleaginosas. Lisboa: Clássica, 1956. 231p. Castro, P.R.C. Hormonios Vegetais. Artigo em Hypertexto. Disponível em: <http://pt.scribd.com/doc/3319812/Hormonios-Vegetais>. Collares, D. Pinhão-manso: cultura para uso como fonte de energia fomenta pesquisa. Embrapa Agroenergia. 19 abril 2011. Disponível em: < http://www.cnpae.embrapa.br/pasta-NoticiasUd/noticiasud.2011-04- 15.6832847869/view?searchterm=brjatropha>. Garcia, C.W; Machado, I.S; Almeida, B.O.; Arcalá, L.F.L. Balanços de fontes nitrogenadas amoniacais e nítricas na micropropagação de curauá. Revista Brasileira de Oleaginosas e Fibrosas, Campina Grande, PB. 14: 125-133, 2010. Grattapaglia, D.; Machado, M. A. Micropropagação. In: Torres, A. C.; Caldas, L. S.; Buso, J. A., Eds., Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa- SPI/Embrapa-CNPH, 1: 183-260, 1998.
  19. 19. 18 Heiffig, L.S.; Câmara, G.M.S. Potencial da cultura do pinhão-manso como fonte de matéria-prima para o Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel. In: Câmara, G.M.S.; Heiffig, L.S. (Coord.) Agronegócio de Plantas Oleaginosas: matérias-primas para biodiesel. Piracicaba: ESALQ/USP/LPV. p. 105 – 121, 2006. Laviola, B. Pesquisa busca melhoramento genético do pinhão manso. Embrapa. 25 mar. 2009. Disponível em: <http://www.embrapa.br/imprensa/noticias/2009/marco/4a- semana/pesquisa-busca-melhoramento-genetico-do-pinhao-manso>. Machado, I.S.; Gomes, A.C.; Bertozzo, F.; Soriano, L.; Arcalá, L.F.L. Indução de calogênese em meristemas de curauá in vitro. Revista Brasileira de Oleaginosas e Fibrosas, Campina Grande, PB. 13: 89-90, 2009. Mishra, M.; Saxena, R. P.; Pathak, R. K.; Srivastava, A. K. Studies on micropropagation of aonla (Emblica officinalis Gaertn). Progressive Horticulture, v. 31: 116-122, 1999. Murashige, T.S.; Skoog, F. A revised medium for rapid growth bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-97, 1962. Peixoto, A.R. Plantas oleaginosas arbóreas. São Paulo: Nobel, 1973. 284p. Pereira, A. M. S.; Bertoni, B. W.; Moraes, R. M.; Franca, S. C. Micropropagation of Salix humboldtiana Hild. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, 2: 17-21, 2000. Purcino, A. A. C.; Drummond, O. A. Pinhão manso. Belo Horizonte: EPAMIG, 1986. 7p. Rajore, S.; Batra, A. Efficient Plant Regeneration via Shoot Tip Explant in Jatropha curcas L.. J. Plant Biochemistry & Biotechnology. 14: 73-75, 2005.
  20. 20. 19 Rossetto, M. Petrobras foca aportes em novos projetos. Brasilagro; 12 ago. 2011. Diponível em: < http://www.brasilagro.com.br/index.php?/noticias/detalhes/12/37840>. Saleme, W.J.L. Potencial do Pinhão-Manso para o Programa Nacional de Biodiesel. Instituto Fênix de Pesquisa e Desenvolvimento Sustentável, Brasília, 2006. 11p. In: Potencial do Pinhão-manso para o Programa Nacional do Biodiesel. Fundação de Estudos e Pesquisas em Administração e Desenvolvimento – FEPAD. Disponível em: <http://www.fepad.org.br/NovoSite/%5Fdinamico/?Link=seminario>. Sartori, A.S.A.; Machado, I.S.; Leão, A.L. & Ramos, A.A. Concentrações de BAP e TDZ na Propagação In Vitro de Curauá (Ananas erectifolius L.B.Smith) / A Influência Das Citocininas Sintéticas na Cultura de Tecidos. Biotecnologia - Ciência & Desenvolvimento, Brasília, 35: 58-61, 2005. Severino, L.S. Pinhão Manso: Verdades e Mentiras; Embrapa Algodão; 5 fev. 2007. Disponível em: <http://www.cnpa.embrapa.br/noticias/2007/noticia_20070205.html>. Silva, A.F.S. Pinhão Manso: Jatropha curcas. Centro de Apoio ao Desenvolvimento Tecnológico ¬ CDT/UnB Campus UnB - Faculdade de Tecnologia. Disponível em: <http://www.cdt.unb.br>. Silva, F.A.S. Programa estatístico ASSISTAT Versão 7.6 – Universidade Federal de Campina Grande, PB. Disponível em mídia eletrônica, 2011. Soares, I.P. Processo de produção de biodiesel por rota supercrítica; Embrapa Agroenergia. Disponível em: <www.cnpae.embrapa.br>. Souza, A. S. Introdução a cultura de tecidos de plantas. In: Souza, A. S.; Junghans, T. G. (Ed.) Introdução a micropropagação de plantas. 1.ed. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura tropical, 2006, cap.1, p.11-37.
  21. 21. 20 Stein, V.C. Organogênese Direta em Explantes Caulinares de Ingazeiro (Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T.D. Penn.). Revista Brasileira de Biociências, v. 5, supl. 2, p. 723- 725, 2007. Ungaro, M.R.G. Potencial da cultura do girassol como fonte de matéria-prima para o Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel. In: Câmara, G.M.S.; Heiffig, L.S. (Coord.) Agronegócio de Plantas Oleaginosas: matérias-primas para biodiesel. Piracicaba: ESALQ/USP/LPV. p. 57-80. 2006. Botucatu, 20 de Março de 2012 ____________________________________________ Henrique Curi Penna (Acadêmico) ____________________________________________ Prof. Dr. Isaac Stringueta Machado (Orientador)

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