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Transformação genética de eucalyptus camaldulensis por

  1. 1. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE Eucalyptus camaldulensis POR AGROBIOBALÍSTICA E EFICIÊNCIA DO GENE GUS EVÂNIA GALVÃO MENDONÇA1, LUCIANO VILELA PAIVA2, CAROLINA DELFIM FERNANDES LIMA3, HUMBERTO HENRIQUE CARVALHO4, GUILHERME ARAÚJO LACERDA5, BRENO RÉGIS SANTOS6RESUMOO presente trabalho teve como objetivo otimizar a metodologia de transformação de plantasde Eucalyptus camaldulensis, uma importante espécie florestal amplamente cultivada noBrasil. Foi estudada a transformação por agrobiobalística de explantes foliares, a técnicacausa microferimentos nos explantes aumentando a penetração da Agrobacterium nos tecidosvegetais. Na agrobiobalística o explante é submetido ao bombardeamento commicropartículas seguida por inoculação com a bactéria. O experimento de transformação foiavaliado pela análise da expressão transitória do gene repórter gus. O parâmetro estudado natransformação por agrobiobalística foi tempo de infecção, sendo que, a freqüência maiselevada da expressão da β-glucuronidase foi observada utilizando tempo de infecção de 8minutos, onde, a pressão utilizada foi de 1350 PSI de gás hélio, 9,5 cm de distância de vôodos microprojéteis. Apesar do maior tempo de infecção apresentar maior número de pintasazuis, pela análise estatística foi possível observar que não houve diferença significativa entreos tempos de infecção analisados (4, 6 e 8 minutos). Os resultados demonstraram que o uso datécnica de agrobiobalística é viável e que um menor tempo de infecção é capaz de promover atransformação de eucalipto com Agrobacterium.Palavras-chave: eucalipto, β-glucuronidase, bombardeamento, cultura bacteriana.INTRODUÇÃO O gênero Eucalyptus L’Hér. (Myrtaceae) é nativo da Austrália, muitas espécies ehíbridos são cultivados em larga escala em várias regiões de clima tropical e subtropical emtodo o mundo, incluindo Argentina, Austrália, Brasil, Marrocos, Portugal, África do Sul,Espanha, Estados Unidos e Uruguai (Eldridge et al., 1994). Atualmente, o Brasil possui a maior área plantada de eucalipto do mundo (mais de 3milhões de hectares). A produção brasileira concentra-se em Minas Gerais e São Paulo, osquais lideram a produção nacional e, em seguida, com menor produção, nos Estados doParaná e Santa Catarina, devido às restrições climáticas para o gênero (Sociedade Brasileirade Silvicultura, 2007).1 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail:evaniafloresta@hotmail.com2 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: luciano@ufla.br3 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:carolima_bio@hotmail.com4 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail:humberto_henriquec@hotmail.com5 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:guilhermebiologia@hotmail.com6 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:guilhermebiologia@hotmail.com6 Universidade Federal de Alfenas, Departamento de Ciências Biológicas, Setor de Biotecnologia Vegetal, E-mail: brenors@yahoo.com.br 311
  2. 2. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 A alta produtividade em plantios florestais se deve ao melhoramento genético e aspráticas silviculturais que contribuíram significativamente para o ganho genético em espéciesde grande valor econômico. A aplicação de métodos de melhoramento genético, por sua vez,apresenta limitações devido ao longo ciclo reprodutivo das espécies arbóreas e à dificuldadeem conseguir melhorias significativas em caracteres complexos tais como: propriedades damadeira, controle de pragas e doenças, e tolerância a estresses abióticos (Nehra et al., 2005). Desta forma, a biotecnologia através da transformação genética, possibilita aintrodução de genes de interesse em uma única geração podendo alterar características comoconteúdo de lignina, resistência a insetos, resistência à herbicida e alteração de rotasmetabólicas. A aplicação desta nova tecnologia no melhoramento do Eucalyptus pode levar aum aumento de produtividade, atendendo a uma demanda crescente de produtos florestais dequalidade com baixo custo de produção (Andrade, 2001). O E. camaldulensis foi a primeira espécie utilizada para estudos de transformaçãogenética via Agrobacterium tumefaciens e atualmente, é a espécie mais pesquisada devido àrelevância econômica e facilidade de regeneração (Kawazu et al., 1990; Mullins et al., 1997;Ho et al., 1998; Chen et al., 2003). O processo de transformação genética de plantas tem sido aprimorado desde a décadade 80, quando Stachel & Zambryski (1986) relataram o uso de Agrobacterium tumefaciens,modificada geneticamente, para introdução de genes exógenos em plantas. Entretanto, apesardos progressos alcançados nos últimos anos, muitos ainda são os desafios encontrados natransformação de algumas espécies lenhosas, atribuídos principalmente à baixa eficiência nainserção estável de um gene no genoma da planta e na habilidade para regenerar uma planta apartir da(s) célula(s) transformada(s) (De Bondt et al., 1994). O método de transformação por biobalística, também conhecida como método debombardeamento com micropartículas ou aceleração de partículas é um processo que empregamicroprojéteis com alta velocidade para inserir ácidos nucléicos e outras substâncias emdiferentes órgãos, tecidos que em geral não dependem do genótipo usado. Uma variação desta tecnologia é a utilização dessa técnica em associação com atransformação via Agrobacterium. Nesse caso o bombardeamento é utilizado para provocar aindução de macro e microferimentos no tecido vegetal, que libera compostos fenólicos e porsua vez, mobiliza a transferência do T-DNA para a célula hospedeira. A técnica tem avantagem de aumentar a freqüência de transformantes, uma vez que os microferimentos nãoprejudicam a célula vegetal e são suficientes para a indução da transferência do T-DNA.Atualmente este novo método de transformação é conhecido como Agrobiobalística (Bidneyet al., 1992; Brasileiro et al., 1996). Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver umsistema de transformação genética por agrobiobalística através de explantes foliares de E.camaldulensis via co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens em diferentes tempos deinfecção e avaliar a expressão do gene repórter gus.MATERIAL E MÉTODOSMaterial O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório Central de Biologia Molecular(LCBM), vinculado a Pró-Reitoria de Pesquisa, Universidade Federal de Lavras, Lavras,Minas Gerais. Foram utilizados explantes (foliares) oriundos de plantas de Eucalyptuscamaldulensis germinadas in vitro, cultivadas em sala de crescimento pertencente ao LCBM.As plantas foram mantidas em sala de crescimento, sob fluorescente branca fria com 312
  3. 3. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008densidade de fluxo fotossintético de 40 µmol.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 h e temperatura de 27± 2°C. As culturas foram realizadas em placas de Petri de 10 cm de diâmetro e 2 cm dealtura, contendo 50 mL de meio de cultura e vedadas com filme PVC, ou em frascos de vidrode 6 cm de diâmetro e 9 cm de altura, contendo 50 mL de meio de cultura cada um e vedadoscom tampa de polipropileno rígido. Todos os meios de cultura tiveram o pH ajustado em 5,8 e foram autoclavadosdurante 20 min a 120°C.MétodosCultura bacteriana No experimento de transformação utilizou-se a linhagem de Agrobacteriumtumefaciens, EHA 105 contendo o plasmídio com a construção 35S::GUS::NOS. Aagrobactéria foi inoculada em meio YEP líquido com o antibiótico kanamicina (50mg/L) a28ºC overnight sob agitação constante (200 RPM). Após este período, 100µL da culturaacima foi colocada em tubo Falcom contendo 3mL de meio YEP (sem antibiótico) a 28ºCovernight, sob agitação constante (200 RPM). Posteriormente a Densidade Óptica (D.O.) foimedida.Transformação por biobalística O acelerador de partículas utilizado para realizar o bombardeamento foi oPDS1000/HeTM (BioRad) descrito por Sanford et al. (1991). Emprega gás hélio à alta pressãopara gerar a onda de choque que acelera as micropartículas. Os parâmetros pressão de hélio e a distância de vôo das micropartículas utilizadasforam os mesmos estabelecidos por Andrade em 2001. As micropartículas utilizadas nos experimentos de bombardeamento foram as detungstênio M10 (GTE Sylvania Chemicals/Metals), sendo que, o preparo das mesmas baseou-se no sistema desenvolvido no laboratório Biobalística do CENARGEN-EMBRAPA (Aragãoet al., 1996).Infecção dos explantes e expressão de atividade da β-glucuronidase Os explantes foliares para inoculação e co-cultura foram cortados em discos deaproximadamente 0,5cm2, bombardeados com partícula nula e colocados em contato com acultura bacteriana (4, 6 e 8 minutos) sobre agitação. Após o contato com a bactéria osexplantes foram lavados em água destilada estéril e levemente secos em papel toalha estéril.Os explantes foram co-cultivados com a bactéria por 2 dias sendo colocados em meioMS(Murashige & Skoogs, 1962) suplementado com 1 mg.L-1 de BAP, 0,5 mg.L-1 de ANA,3% de sacarose, 0,6 % de agar e 2,5g.L-1 de carvão ativado. A eficiência da transformação foi avaliada após os 2 dias de co-cultivo dos explantescom a agrobactéria através do ensaio histoquímico de expressão da β-glucoronidase (gus).Para a análise foram retirados 2 explantes aleatoriamente de cada placa de Petri, totalizando10 explantes por tratamento, sendo estes incubados em tampão de reação contendo: 10mMNa2EDTA.H2O, 0,1% Triton X-100, 0,1M NaH2PO4, 0,5M K3Fe(CN)6, e 250 µg.mL-1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-glucuronic acid (X-GLUC, Inalco-USA). A reação foi incubadapor 16 horas a 37°C. Depois de decorrido o tempo de reação, as amostras foram transferidaspara etanol 70%, para retirar a clorofila de tecidos verdes e permitir uma melhor visualizaçãoda coloração azul. A avaliação da expressão gus foi feita com o auxilio do estereoscópioOLYMPUS SZH10 com máquina fotográfica CANON POWER SHOT A620 acoplada.Foram contados os números de pontos azuis referentes aos ferimentos realizados pelobombardeamento com partícula de tungstênio. As imagens foram registradas digitalmente egravadas sendo contado o número de pontos azuis por explante. 313
  4. 4. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008Análise dos dados Os dados foram expressos na forma de média e desvio padrão. A análise doexperimento foi realizada pelo teste Scott-Knott (Ferreira, 2000) o delineamento experimentalfoi totalmente casualizado com 5 repetições totalizando 50 explantes por tratamento.RESULTADOS E DISCUSSÃO A influência de diferentes tempos de inoculação na transformação genética de E.camaldulensis via A. tumefaciens foi avaliada por meio de expressão transiente da enzimaβ-glucuronidase em explantes foliares, onde se considerou resultado positivo pintas comcoloração azul (Figura 1).Figura 1 – Expressão transiente do gene gus em folhas de E. camaldulensis, após co-culturaem OD600nm= 0,95 . (A) Folha não inoculada; (B) Folha exibindo expressão do gene gus –inoculação 4 minutos; (C) Folha exibindo expressão do gene gus – inoculação 6 minutos; (D)Folha exibindo expressão do gene gus – inoculação 8 minutos. Barras = 1mm. Quando considerado a eficiência da técnica de agrobiobalística, onde a pressão dedisparo utilizada foi de 1350 PSI, os resultados demonstraram uma maior expressão transientedo gene gus quando os explantes foram submetidos à infecção por 8 minutos. Entretanto nãohouve diferença significativa entre os tempos de inoculação 4, 6 e 8 minutos (Figura 2).Sendo este resultado de acordo com o observado por Andrade 2001, que encontrou maiorexpressão transiente em pressões de disparo maiores que 1000 PSI. Porém, devido à ausênciade trabalhos publicados considerando a técnica de biobalística associada à influência dotempo de infecção da A. tumefaciens em explantes foliares E. camaldulensis, não foi possívelcomparar as porcentagens aqui observadas com os resultados de outros autores. 314
  5. 5. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 a1 Expressão da β-glucuronidase a1 a1 4 min 6 min 8 minFigura 2 – Avaliação de tempo de infecção. Explantes foliares submetidos a diferentes temposde infecção, bombardeados com uma pressão de disparo de 1350 PSI a uma distância de 9,5cm do alvo. Avaliações realizadas 2 dias após a inoculação. Médias com a mesma letra nãodiferem significativamente ao nível de 5% pelo Teste de Scott-Knott. Visto que, a Agrobacterium tumefaciens é uma espécie altamente virulenta e que asespécies vegetais diferem grandemente em sua susceptibilidade à infecção, quanto maior otempo de contato da bactéria com o explante, maiores são os danos causados no tecidodificultando a regeneração da planta transformada. Sugere-se o tempo de infecção de 4minutos como o tratamento capaz de promover uma transformação eficiente com menoresdanos ao explante.CONCLUSÃO Observou-se expressão transiente do gene gus nos tempos de infecção 4, 6 e 8minutos de infecção. Não houve diferenças significativas entre os tempos analisados.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASANDRADE, A. Avaliação de parâmetros que influenciam a transformação genética doEucalyptus grandis via Agrobacterium. 2001. 81p. Dissertação (Mestrado em Agronomia) –Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2001.ARAGÃO, F.J.L.; BARROS, L.M.G.; BRASILEIRO, A.C.M.; RIBEIRO, S.G.; SMITH,F.D.; SANFORD, J.C.; FARIA, J.C.; RECH, E.L. Inheritance of foreing genes in transgenicbean (Phaseolus vulgaris L) co-transformed via particle bombardment. Theoretical andApplied Genetics, v.93, n.1-2, p.142-150, 1996.BIDNEY, D.; SCELONGE, C.; MARTICH, J.; BURRUS, M.; SIMS, L.; HUFFMAN, G.Microprojectile bombardment of plant-tissues increases transformation frequency byAgrobacterium-tumefaciens. Plant Molecular Biology, v.18, n.2, p.301-313, 1992.BRASILEIRO, A.C.M.; ARAGÃO, F.J.L.; ROSSI, S.; DUSI, D.M.A.; BARROS, L.M.G.;RECH, E.L. Susceptibility of common and tepary beans to Agrobacterium-mediatedtransformation using microprojectile bombardment. Journal of American Society forHorticultural Science, v.121, n.5, p.801-815, 1996.CHEN, Z. Z.; CHANG, S. H.; HO, C. K.; CHEN, Y. C.; TSAI, J. B.; CHIANG, V. L. Plantproduction of transgenic Eucalyptus camaldulensis carrying the Populus tremuloidescinnamate 4-hydroxylase gene. Journal Forestry Science, v. 16, p.249-258, 2003. 315
  6. 6. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008DE BONDT, A.; EGGERMONT, K.; DRUART, P.; DE VIL, M.; GODERIS, I.; VANDERLEYDEN, J.; BROEKAERT, W.F. Agrobacterium-mediated transformation. TaiwamJournal of Forest Sciences, v.11, n.1, p.43-52, 1994.ELDRIDGE, K.; DAVIDSON, J.; HARDWIID, C.; WYK, G. V. Eucalypt domesticationand breeding. Oxford Clarendon, p. 228-246, 1994.FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. In...45aReunião Anual da Região Brasileira da Sociedade internacional de Biometria. UFSCar, SãoCarlos, SP, Julho de 2000. p. 255-258.HO, C. K.; CHANG, S. H.; TSAY, J. Y.; TSAI, C. J.; CHIANG, V. L.; CHEN, Z. Z.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Eucalyptus camaldulensis andproduction of transgenic plantlets. Plant Cell Reports, v.17, p. 675-680, 1998.KAWAZU, T.; DOI, K.; OHTA, T.; SHINOHARA, Y.; ITO, K.; SHIBATA, M.Transformation of Eucalyptus saligna using electroporation. Abstracts: VII InternationalCongress on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, Netherlands, p. 24-29, 1990.MULLINS, K. V.; LLEWELLYN, D. J.; HARTNEY, V.J.; STRAUSS, S.; DENNIS, E. S.Regeneration and transformation of Eucalyptus camaldulensis. Plant Cell Reports, v.16, p.787-791, 1997.MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassay withtobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p. 473-497, 1962.NEHRA, N.S.; BECWAR, M.R.; ROTTMANN, W.H.; PEARSON, L.; CHOWDHURY, K.;CHANG, S.; WILDE, H.D.; KODRZYCKI, R.J.; ZANG, C.; GAUSE, K.C.; PARKS, D.W.;HINCHEE, M.A. Forest biotechnology: innovative methods, emerging opportunities. InVitro Cellular and developmental Biology – Plant, v.41, p.701-717, 2005.SANFORD, J.C.; DEVIT, M.J.; RUSSELL, J.A.; SMITH, F.D.; HARPENDING, P.R.; ROY,M.K.; JOHNSTON, S.A. An improved, helium-driven biolistics device. Technique, v.3, n.1,p.3-16, 1991.SOCIEDADE BRASILEIRA DE SILVICULTURA SBS. O balanço do setor florestal.<http://www.sbs.org.br>. Acesso em: 10 abr. 2007.STACHEL, S.E.; ZAMBRYSKI, P.C. virA and virG control the plant-induced activation ofthe T-DNA transfer process of A .tumefaciens. Cell, v.46, p.325-333. 316

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