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Obtenção de calos a partir de explantes foliares de

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Obtenção de calos a partir de explantes foliares de

  1. 1. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 OBTENÇÃO DE CALOS A PARTIR DE EXPLANTES FOLIARES DE CULTIVARES DE Coffea arabica L. PARA PRODUÇÃO DE CAFÉS ESPECIAIS ELIZÂNGELA ALMEIDA ROCHA1, LILIAN MAYUMI KURIBAYASHI2, LUCIANO VILELA PAIVA3, GUILHERME ARAÚJO LACERDA4, FABIANA BARBOSA DE PAULA5RESUMOA melhora da qualidade do café deveu-se a uma série de procedimentos tanto na condução dacultura quanto no processamento do grão, principalmente durante as fases de colheita, seca earmazenamento. O objetivo deste trabalho foi a comparação entre os diferentes meios deindução de calos descritos sobre os explantes foliares de 4 cultivares relacionados com aprodução de cafés especiais no sul de Minas Gerais. Explantes foliares de aproximadamente1cm2 foram plaqueados com a face adaxial em contato com os diferentes meios de cultura,denominados de MIT1 e PM, e cultivados sob escuro durante 3 e 4 semanasconsecutivamente. Em ambos os meios de indução os calos se apresentam com aspectovitrificado, portanto friáveis nas bordas dos explantes, sendo estas as regiões que sofreraminjúrias. A taxa de formação de calos primários nos 4 cultivares testados foi em torno de 50 –93%. Podemos avaliar as diferentes respostas obtidas pela indução de calos, mostrando que opercentual de calos induzidos foi maior nos cultivares Catiguá MG2, Catuaí Amarelo 62 eCatucaí Amarelo no meio de indução PM. Já o cultivar Bourbon Amarelo apresentou o maiorpotencial de indução de calos no meio MIT1. A quantidade de calos primários variou deexplante para explante e destes pelo cultivar. A capacidade de um explante foliar formar umcalo primário (células reativas) depende do genótipo e da condição e estádios fisiológicos daplanta.Palavras-chave: calos primários, proliferação celular, indução de calos, 2iP, 2,4-D.INTRODUÇÃO A melhora da qualidade do café deveu-se a uma série de procedimentos tanto nacondução da cultura quanto no processamento do grão, principalmente durante as fases decolheita, seca e armazenamento. Atualmente, em várias regiões do país, cafés com qualidadeigual a dos melhores cafés colombianos vêm sendo produzidos e exportados (SOUZA et al.,2002). Com a globalização da economia, dois fatores são essenciais para que o Brasilcontinue competitivo em relação aos concorrentes produtores de café. O primeiro deles refere-se à qualidade da bebida e o segundo, ao custo de produção. Quanto à primeira condição, atecnologia disponível associada a condições edafo-climáticas permitem produzir cafés dealtíssima qualidade. Entretanto, no que se referem, ao custo de produção, vários fatoresdevem ser trabalhados no sentido de tornar a cultura menos vulnerável à variação sazonal depreços, o que é típico para esta cultura (TEIXEIRA et al., 2004).1 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail:almeida.elizangela@gmail.com2 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Ciência dos Alimentos, E-mail: lilinhamk@gmail.com3 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: luciano@ufla.br4 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:guilherme.lacerda@posgrad.ufla.br5 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular. 305
  2. 2. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 Neste aspecto diversos trabalhos foram realizados utilizando cultura de tecidos para apropagação de variedades comercias de café, regenerando plantas através de neoformação degemas, de entrenós verdes, de ramos ortotrópicos e por indução de embriogênese somática apartir de explantes foliares (DUBLIN, 1981; HERMAN & HAAS, 1975; PIERSON et al.,1983; SÖNDAHL & SHARP, 1977). Os primeiros trabalhos de micropropagação de café via embriogênese somática forampublicados por Staritsky (1970) para Coffea canephora e por Herman & Haas (1975) paraCoffea arabica. Posteriormente, Söndahl & Sharp (1977) ampliaram o trabalho de Herman &Haas (1975) e apresentaram em definitivo os fundamentos básicos para a multiplicação clonalde plantas de Coffea arabica via embriogênese somática. Embriões somáticos de café podem ser produzidos via direta ou indireta. No primeirocaso, os embriões são produzidos diretamente do tecido foliar em cultivo in vitro, enquantoque no segundo, inicialmente observa-se uma proliferação de calos, nos quais ocorre aformação de um segundo tipo de calos de características embriogênicas (TEIXEIRA et al.,2004). Este tipo de calos pode ser subcultivado por um período de tempo relativamentelongo, durante o qual pode ser transferido para meios apropriados à formação de grandenúmero de embriões somáticos (SONDAHL & SHARP, 1977; SONDAHL et al., 1979;BOXTEL & BERTHOULY, 1996). Os calos embriogênicos podem ser cultivados em meio líquido em frascos deErlenmeyer (BOXTEL & BERTHOULY, 1996), em biorreatores de imersão contínua(NORIEGA & SONDAHL, 1993) e biorreatores de imersão temporária (TEISSON et al.,1995). Os biorreatores permitem o cultivo tanto de gemas nodais como calos embriogênicosde café, o que constitui um dos meios mais promissores no sentido de aumentar a eficiênciado processo. Em meio líquido tanto a gema nodal quanto os calos embriogênicos podem sercultivados em condições ótimas desde que alguns parâmetros sejam ajustados, como tipo deexplante, meio de cultivo, sobretudo quanto à qualidade e quantidade de reguladores decrescimento, ciclos de imersão/emersão, temperatura e luminosidade (TEIXEIRA et al.,2004). Esta alternativa de cultivo permite uma melhor uniformidade dos embriões produzidos,uma vez que é possível induzir a sincronização do processo embriogênico (NORIEGA &SONDAHL, 1993). Da mesma forma, a diferenciação do embrião pode ser conduzida deforma mais adequada, além de oferecer a oportunidade de encapsulamento do embriãodiferenciado em larga escala. Estas vantagens comparativas poderão contribuir para umasubstancial redução de custo da muda final de café (TEIXEIRA et al., 2004). O objetivo deste trabalho foi a comparação entre os diferentes meios de indução decalos descritos por Boxtel & Berthouly (1996) e Teixeira et al. (2004) sobre os explantesfoliares de 4 cultivares relacionados com a produção de cafés especiais no sul de MinasGerais.MATERIAL E MÉTODOS Mudas dos 4 cultivares foram transplantadas para vaso de 5 L em substrato padrãodo Setor de Cafeicultura do Departamento de Agricultura e cultivadas em casa de vegetaçãono Departamento de Solos, ambos na Universidade Federal de Lavras. As plantas foramsemanalmente pulverizadas com fungicida e regadas com adubo. Folhas jovens foram coletadas e levadas ao Laboratório Central de BiologiaMolecular onde foram desinfestadas utilizando hipoclorito de cálcio a 6% por 20 minutos e 3lavagens com água destilada autoclavada por 5 minutos. 306
  3. 3. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 O protocolo descrito por Boxtel & Berthouly (1996) foi inicialmente avaliado noLaboratório de Cultura de Tecidos II da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.Posteriormente, uma série de adaptações foram conduzidas nesta metodologia, visandomelhorar a eficiência do processo para produção de mudas de café de vários genótipos(TEIXEIRA et al., 2004). Logo, buscou-se a comparação entre esses dois protocolos e suaadaptação para os cultivares elite do Sul de Minas Gerais no Laboratório Central de BiologiaMolecular da Universidade Federal de Lavras. De acordo com protocolo adaptado de Teixeira et al. (2004) inicialmente explantesfoliares de aproximadamente 1cm2 foram plaqueados com a face adaxial em contato com ummeio de cultura, denominado de PM (meio primário), e cultivados durante um mês. O meioPM é formado por metade dos sais MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), vitaminas MS, 100mg L-1 de caseína hidrolisada, 400 mg L-1 de extrato de malte, 20 µM de ácido 2,4diclofenoxiacético (2,4-D), 9,84 µM de ácido indol-3-butírico (AIB), 9,84 µM deisopenteniladenina (2iP), solidificado com 6 g.L-1 de ágar e acrescido de 20 g.L-1 de sacarose.O pH dos meios foram ajustados em 5,7 e os meios de cultura foram autoclavados a 121 ºCpor 20 min. Após inoculados, os explantes foram mantidos em sala de crescimento a 27 ± 2ºC em condições de obscuridade. Após 4 semanas em meio PM os explantes foramtransferidos para meio SM, no qual a concentração de 2,4-D é reduzida para 10 µM sendoavaliados a percentagem de explantes com calos induzidos. De acordo com protocolo adaptado de Boxtel & Berthouly (1996) o meio MIT1(meio de indução de calos) é formado por sais MS, vitaminas VT1, caseína hidrolisada (100mg L-1), extrato de malte (400 mg L-1), 2,4-D (2,26 µM), AIB (4,92 µM), 2iP (9,84 µM),sacarose (30 g L-1) e ágar (6 g L-1). O pH dos meios foram ajustados em 5,6 e os meios decultura foram autoclavados a 121 ºC por 20 min. Após inoculados, os explantes forammantidos em sala de crescimento a 27 ± 2 ºC em condições de obscuridade. Após 3 semanasem meio MIT1 os explantes foram transferidos para meio MET2, no qual a concentração de2,4-D é aumentada para 4,52 µM e o AIB é substituído pelo BAP (17,76 µM) sendo avaliadosa percentagem de explantes com calos induzidos. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo software Sisvar(FERREIRA, 2000). Sendo os efeitos dos 2 meios de indução do calos e dos 4 cultivarescomparados pelo Teste Scott-Knott ao nível nominal de 5%.RESULTADOS E DISCUSSÃO Depois de um mês de cultivo, observou-se intensa proliferação celular nas bordasdos explantes. Segundo Quiroz-Figueroa et al. (2002), esta proliferação ocorre nas células docâmbio vascular, o que leva a formação de calos primários (Figura 1). Em ambos os meios de indução os calos se apresentam com aspecto vitrificado,portanto friáveis nas bordas dos explantes, sendo estas as regiões que sofreram injúrias, sendoassim denominados de calos primários (TEIXEIRA et al., 2004). A taxa de formação de calos primários nos 4 cultivares testados foi em torno de 50 –93%. Os cultivares abordados no trabalho, bem como o percentual de explantes com calos sãovisualizados na Tabela 1. 307
  4. 4. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008Figura 1. Calos oriundos de explantes foliares de mudas de Coffea arabica L. de acordo com protocolo de Boxtel & Berthouly (1996) com 2 semanas de cultivo. A) Bourbon Amarelo; B) Catiguá MG2; C) Catuaí Amarelo 62; D) Catucaí amarelo. Barra = 1 mmTabela 1. Valores das percentagens de calos induzidos para os diferentes meios de indução MIT1 (BOXTEL & BERTHOULY, 1996) e PM (TEIXEIRA et al, 2004). Cultivar Meio de indução Percentual de explantes com calos Catiguá MG2 MIT1 75,00 a PM 90,00 a Catuaí Amarelo 62 MIT1 66,07 a PM 93,75 a Catucaí Amarelo MIT1 57,81 a PM 59,72 a Bourbon Amarelo MIT1 63,89 a PM 59,38 a * Médias seguidas de letra e número distintas entre si pelo Teste Scott-Knott, a 5% de probabilidade Observa-se que o teste estatístico Scott-Knott, a 5% de probabilidade, nãodemonstrou diferença significativa entre os cultivares ou na interação destes com os 2 meiosde indução. Apesar disso, no gráfico (Figura 2) podemos avaliar as diferentes respostasobtidas pela indução de calos, mostrando que o percentual de calos induzidos foi maior noscultivares Catiguá MG2, Catuaí Amarelo 62 e Catucaí Amarelo no meio de indução PM(TEIXEIRA et al, 2004). Já o cultivar Bourbon Amarelo apresentou o maior potencial deindução de calos no meio MIT1 (BOXTEL & BERTHOULY, 1996). 308
  5. 5. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 % de calos induzidos 100 80 60 40 20 0 MIT1 PM MIT1 PM MIT1 PM MIT1 PM Catiguá Catiguá Catuaí Catuaí Catucaí Catucaí Bourbon Bourbon MG2 MG2 amarelo amarelo amarelo amarelo amarelo amarelo 62 62Figura 2. Gráfico ilustrando as percentagens de calos induzidos nos diferentes meios MIT1 (BOXTEL & BERTHOULY, 1996) e PM (TEIXEIRA et al, 2004) testados para estes cultivares. De acordo com Teixeira et al. (2004) ao contrário do esperado, quanto mais vigorosoo calo primário, menor era a freqüência de formação de setores embriogênicos. Parece haveruma competição entre o crescimento de calos primários e a indução de formação de setoresembriogênicos.CONCLUSÃO A quantidade de calos primários variou de explante para explante e destes pelocultivar. A capacidade de um explante foliar formar um calo primário (células reativas)depende do genótipo e da condição e estádios fisiológicos da planta.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASBOXTEL, J.; BERTHOULY, M. High frequency somatic embryogenesis from coffee leaves.Factors influencing embryogenesis, and subsequent proliferation and regeneration on liquidmedium. Plant cell, Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 44, p. 7-17, 1996.DUBLIN, P. Multiplication vegetative “in vitro” de l’arabusta. Café, Cação, Thé, Paris, v.24, n. 4, p. 181-190, oct./dec. 1980.FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. In...45aReunião Anual da Região Brasileira da Sociedade internacional de Biometria. UFSCar,São Carlos, SP, Julho de 2000. p. 255-258.HERMAN, E. B.; HAAS, G. J. Clonal propagation of Coffea arabica L. from callus culture.HortScience, Alexandria, VA, v. 10, n. 6, p. 588-589, 1975.MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassay withtobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p. 473-497, 1962.NORIEGA, C.; SONDAHL, M. R. Arabica coffee micropropagation trought somaticembryogenesis via bioreactors. In: Biotechnologie Asic Colloque, 15, 1993, Montpellier.[Anais…]. [S.I: s.n.], [1993]. p. 73-80.PIERSON, E. S; VAN LAMMENRN, A.; SCHEL, J. H.; STARITSKY, G. In vitrodevelopment of embryoids from punched leaf disc of Coffea canephora. Protoplasma,Vienne, v. 115, n. 2/3, p. 208-216, 1983. 309
  6. 6. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008QUIROZ-FIGUEROA, E. R.; FUENTES-CERDAS, C. F. J.; ROJAS-HERRERA, R.;LOYOLA-VARGAS, V. M. Histological studies on the development stages anddifferentiation of two different somatic embryogenesis system of Coffea arabica. Plant CellReports, Berlin, v. 20, p. 1114-1149, 2002.SONDHAL, M. R.; SALISBURY, J. L.; SHARP, W. R. SEM characterization ofembryogenic tissue and globular embryos during high frequency somatic embryogenesis incoffee callus cells. Zeistschrift fur Pflanzenphysiologie, Stuttgart, v.94, p.185-188, 1979.SONDHAL, M. R.; SHARP, W. R. High frequency indution of somatic embryos in culturaleaf explant of Coffea arabica L. Zeistschrift fuer pflenzen physiologie, Zurik, v. 8, n. 4, p.395-408, 1977.SOUZA, M. C. M.; SAES, M. S. M.; OTANI, M. N. Pequenos Agricultores Familiares e suaPossibilidade de Inserção no Mercado de Cafés Especiais: uma abordagem preliminar. In: VIESA - Simpósio Latino-Americano sobre Investigação e Extensão em SistemasAgrpecuários e V Encontro da SBSP - Sociedade Brasileira de Sistemas de Produção,2002, Florianópolis - SC: EPAGRI, 2002.STARITSKY, G. Embryoid formation in callus tissues of coffee. Acta BotanicaNeerlandica, Amsterdam, v.18, p.509-514, 1970.TEISSON, C.; ALVARD, D.; BERTHOULY, M.; COTE, F.; ESCALANTE, J. V.;ETIENNE, H. Culture in vitro par immersion temporaire: un nouveau recipient. Plantations,Recherche, Dévelopment, Paris, v. 2, n. 5, p. 29-31, 1995.TEIXEIRA, J. B. ; JUNQUEIRA, C. S. ; PEREIRA, A. J. da COSTA ; MELLO, R. I. S.;SILVA, A. P. D. ; MUNDIM, D. A. Multiplicação clonal de café (Coffea arabica L.) viaembriogênese somática. Brasília: EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2004.39p. (EMBRAPA, Documentos, 121). 310

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