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Expressão in silico de genes candidatos para a ru bisco ativase

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Expressão in silico de genes candidatos para a ru bisco ativase

  1. 1. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 EXPRESSÃO in silico DE GENES CANDIDATOS PARA A RuBisCO ATIVASE EM Coffea arabica L. GUILHERME ARAÚJO LACERDA1, LUCIANO VILELA PAIVA2, ANTONIO CHALFUN-JUNIOR3, HUMBERTO HENRIQUE DE CARVALHO4RESUMOA enzima cloroplastidial ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RuBisCO, EC4.1.1.39) possui 8 subunidades maiores (LSU) e 8 subunidades menores (SSU) e controla aprodutividade das plantas por catalisar a primeira reação de assimilação do CO2 nafotossíntese e de oxidação do carbono na fotorrespiração. A ligação de açúcares fosfato, taiscomo ribulose-1,5-bifosfato, à RuBisCO evita a carbamilação. Os açúcares fosfato podem serremovidos pela enzima RuBisCO ativase (RAC, EC 6.3.4.-), em uma reação que requer o usode ATP. A principal função da RAC é acelerar a liberação dos açúcares fosfato ligados,preparando assim, a RuBisCO para a carbamilação. O objetivo deste trabalho foi realizar umabusca por prováveis genes dentro do banco de dados CAFEST, baseados em similaridadesentre as seqüências para RuBisCO ativase. Após o processo de busca e seleção de readsrelacionados às seqüências, foi realizada a montagem dos EST-contigs e alinhamento entreseqüências relacionadas publicadas. A análise filogenética foi realizada em comparação comseqüências similares de acordo com o BLAST de outras espécies vegetais como Pachysandraterminalis, Gossypium hirsutum, Acer rubrum e Zantedeschia aethiopica. A análise de motifsde agrupamento pelo MEME revelou 4 seqüências contendo 50 aminoácidos relacionados aRuBisCO ativase. O perfil de expressão obtido pelo Northern Eletrônico revelou uma maiorexpressão das seqüências na biblioteca de folhas jovens e adultas, e um considerável aumentona biblioteca de estresse hídrico (pool de tecidos). Desta forma, foi possível identificar 21seqüências (09 contigs e 12 singlets) relacionadas à RuBisCO ativase no banco de dados doCAFEST.Palavras-chave: Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase, CAFEST, bioinformática,biotecnologiaINTRODUÇÃO A enzima de atuação cloroplastidial, ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase(RuBisCO), possui 8 subunidades maiores (LSU) e 8 subunidades menores (SSU) (JENSEN& BAHR, 1977). Ela controla a produtividade das plantas por catalisar a primeira reação deassimilação do CO2 na fotossíntese e de oxidação do carbono na fotorrespiração. A baixaafinidade para o CO2 e o uso do O2 como um alternativo substrato torna a RuBisCO um fatorlimitante da fotossíntese e um alvo para aumentar a produtividade agrícola. A RuBisCO éfreqüentemente citada como a proteína mais abundante do planeta. Ela é definitivamente amais abundante proteína das folhas de plantas de sol (DEAN et al., 1989). De acordo com Araújo (2006), o cafeeiro é originado de ambientes sombreados,exibindo baixas taxas fotossintéticas, mesmo sob condições ótimas de cultivo. No entanto,muito pouco se sabe, em Coffea arabica, acerca das oscilações espaciais e temporais da1 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:guilherme.lacerda@posgrad.ufla.br2 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: luciano@ufla.br3 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:chalfunjunior@ufla.br4 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail:humberto_henriquec@hotmail.com 1165
  2. 2. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008fotossíntese, bem como das causas de suas baixas taxas fotossintéticas. Este mesmo autoravaliou variáveis interferentes no processo fotossintético do cafeeiro, como o metabolismo docarbono em diferentes posições da copa da planta, e constatou que as atividades inicial e totalda RuBisCO, bem como seu estado de ativação, pouco variaram entre faces e estratos. Estesresultados sugerem que o aparelho fotossintético do cafeeiro exibe uma plasticidaderelativamente baixa às variações da radiação fotossinteticamente ativa (RFA). A ligação de açúcares fosfato, tais como ribulose-1,5-bifosfato, à RuBisCO evita acarbamilação. Os açúcares fosfato podem ser removidos pela enzima RuBisCO ativase(RCA), em uma reação que requer o uso de ATP. A principal função da RuBisCO ativase éacelerar a liberação dos açúcares fosfato ligados, preparando assim, a RuBisCO para acarbamilação (TAIZ & ZEIGER, 2004). Logo, estudos que envolvam a manipulação genética da RuBisCO e de outras enzimastambém associadas ao metabolismo do carbono e ao aparelho fotossintético tornam-se objetosde estudo para aumentar a produtividade agrícola. O presente trabalho teve como objetivo identificar in silico seqüências da RuBisCOativase expressas principalmente em órgãos vegetativos, proporcionando um estudopreliminar de possíveis genes alvo visando futuros trabalhos na área de manipulação genéticado processo de fotossíntese em Coffea arabica.MATERIAL E MÉTODOSIdentificação de seqüências para RuBisCO ativase As seqüências identificadas como RuBisCO ativase tiveram como fonte de dados obanco de ESTs gerado pelo projeto Genoma Brasileiro Café (VIEIRA et al., 2006). Por meioda interface Gene Project (www.lge.ibi.unicamp.br/cafe), foi possível procurar por reads,montar clusters e analisar os prováveis genes para RuBisCO ativase. Inicialmente realizou-seuma busca por palavra-chave, no caso ribulose, tendo-se em vista que todos os reads haviamsido previamente anotados automaticamente por comparação com o banco de genes do NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Um segundotipo de busca foi realizado por meio da ferramenta BLAST (Basic Local Alignament Search),utilizando-se uma fita consenso gerada pelo programa COBBLER (COnsensus Biasing ByLocally Embedding Residues, http://blocks.fhcrc.org/blocks/cobbler.html), de todas asproteínas RuBisCO ativase já identificadas e publicadas. Assim, por meio da ferramentatBLASTN (Altschul et al., 1997), foram comparados os aminoácidos da fita consensoRuBisCO ativase com os nucleotídeos traduzidos do banco de dados, e selecionados todos osreads que apresentaram alinhamento significante (e-value > 10-5). Dessa forma, os mais de 800 reads encontrados foram agrupados em clusters,formando os 38 EST-contigs e 155 singlets sendo submetidos à anotação manual. Paraverificação da similaridade por BLAST com a RuBisCO ativase, inspecionou-se asseqüências montadas com o programa InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/).Todos os EST-contigs identificados como RuBisCO ativase após a anotação, foram usadospara uma terceira busca no banco CAFEST utilizando-se a ferramenta BLASTN, visando-seencontrar novas seqüências de genes para RuBisCO ativase, bem como corrigir clustersincompletos. Esse processo, também chamado de saturação, foi repetido até que não seencontrasse mais nenhum novo read significante. Aquelas que apresentavam baixo e-value,não contendo nenhum domínio conservado completo foram desconsideradas.Análise Filogenética O alinhamento entre os EST-contigs do CAFEST com seqüências SSU E LSU doNCBI, foi feito pelo programa ClustalW (THOMPSON et al., 1994) com os parâmetrospadrões (default) e utilizando-se as seqüências de nucleotídeos traduzidas em aminoácidos. 1166
  3. 3. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 A árvore filogenética foi feita pelo programa MEGA 4 (TAMURA et al., 2007), como modelo de comparação Neighbor-joining (SAITOU & NEI, 1987), método de p distance esupressão pair-wise. A validade da árvore quanto à distância filogenética dos clusters, pôdeser medida pelo teste probabilístico de bootstraps (SITNIKOVA et al., 1995).Identificação de Motifs Comuns de Agrupamento Para descobrir motifs de agrupamento entre as seqüências para RuBisCO ativaseselecionadas no CAFEST, utilizou-se o programa MEME (Multiple Expectation Minimizationfor Motif Elicitation, http://meme.sdsc.edu/meme/meme.html/) versão 3.5.4 (BAILEY et al.2006) utilizando-se os parâmetros: qualquer número de repetições de motifs, máximo de 20motifs por seqüência e tamanho para cada um deles entre 6 e 200 aminoácidos.Northern Eletrônico Primeiramente, foram calculadas as freqüências de reads formadores de cada EST-contigs que apareciam expressos nas bibliotecas. Esse procedimento exigiu que os dados deexpressão dos reads nas bibliotecas (VIEIRA et al., 2006) fossem previamente normalizados,já que as bibliotecas formadas não possuíam o mesmo tamanho. O procedimento para anormalização consistiu em multiplicar cada read pela razão entre o número total de reads detodas as bibliotecas e o número de reads da biblioteca na qual aparecia expresso. Com osdados foi feita uma matriz, relacionando clusters e bibliotecas, posteriormente lançada nosprogramas Cluster e TreeView (EISEN et al., 1998). Os EST-contigs e bibliotecas foramagrupados por hierachical clustering e os resultados de expressão foram apresentados em umaescala cinza, onde expressão zero ou negativa foi representada por coloração mais clara sendoaumentada gradativamente até atingir o preto, que representava o grau máximo de expressãopositiva.RESULTADOS E DISCUSSÃO Ao final do processo obteve-se 07 EST-contigs e 01 EST-singlet para RuBisCOativase, que depois de anotados foram corrigidos quanto a problemas de seqüenciamento emontagens errôneas. Das 09 seqüências, todas demonstraram certa similaridade com aRuBisCO ativase quando comparadas à banco de dados públicos. Após o alinhamento das 12seqüências foi construída uma árvore filogenética contendo proteínas relacionadas à RuBisCOativase já estudadas e publicadas de acordo com o BLAST. As plantas com maiorsimilaridade com os ESTs consideradas na análise foram: Pachysandra terminalis (acesso n°.Q19RP2), Gossypium hirsutum (acesso n°. Q9AXG1), Acer rubrum (acesso n°. Q06B50) eZantedeschia aethiopica (acesso n°. Q9ATC2) afim de se visualizar um melhor agrupamentono dendograma. Analisando-se as relações filogenéticas encontradas, observou-se 2 grupos iniciaisdistintos no dendograma, onde as candidatas obtidas no CAFEST e caracterizadas in silico seagruparam com os polipeptídios para RuBisCO ativase de Coffea arabica (Figura 1). Os motifs de agrupamento dentro das seqüências para RuBisCO ativase sãomostrados na Figura 2, onde os possíveis domínios conservados aparecem em todos os EST-contigs e a maiorias dos EST-singlets, exceto naqueles incompletos, sendo seguido pelosdemais motifs característicos de cada seqüência (OLIVEIRA et al., 2007). A análise de motifsde agrupamento pelo MEME revelou 2 seqüências contendo 159 e 57 aminoácidos,respectivamente, relacionados as seqüências conservadas para RuBisCO ativase (RA). Essesmotifs maiores foram anotados pelo SMART (Simple Motif Architecture Research Tool,http://smart.embl-heidelberg.de/), confirmando a homologia com fragmentos de seqüências dobanco de dados para RCA. O perfil de expressão obtido pelo Northern Eletrônico (Figura 3) revelou uma maiorexpressão das seqüências na biblioteca (VIEIRA et al., 2006) de folhas jovens e adultas como 1167
  4. 4. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008se esperava, devido a atividade no aparato fotossintético do cafeeiro. Um considerávelaumento na biblioteca de estresse hídrico (pool de tecidos) também pode ser notado,expressando-se como mecanismo resposta ao estresse. A compreensão do controle da expressão gênica da RuBisCO ativase em condiçõesnormais de diferentes tecidos vegetativos e destes sob estresses bióticos e abióticos, assumemuma grande importância fisiológica devido às características próprias desta enzima. Logo,futuros estudos que envolvam a manipulação genética da RAC e de outras enzimas tambémassociadas ao metabolismo do carbono e ao aparelho fotossintético tornam-se objetos deestudo para aumentar a produtividade agrícola. 83 C1RCA 60 C27RCA 88 S1RCA C17RCA 61 Q06B50 Acer rubrum Q9ATC2 Zantedeschia aethiopica C16RCA 100 C18RCA Q19RP2 Pachysandra terminalis Q9AXG1 Gossypium hirsutum 91 C3RCA 100 C13RCAFigura 1. Árvore filogenética relacionando seqüências para RuBisCO ativase. As seqüências foram encontradas no CAFEST, foram representados por (♦) EST-contigs e (◊) EST- singlets. As demais seqüências são representadas por seus acessos no NCBI seguidas pelo nome científico. Utilizou-se o modelo de comparação Neighorbor-joining com o método de p distance e pair-wise deletion. Valores de bootstrap menores que 50% foram omitidos.Figura 2. MEME (Multiple Expectation Minimization for Motif Elicitation, http://meme.sdsc.edu/meme/meme.html) para prováveis seqüências para RuBisCO ativase. Os parâmetros utilizados foram: número de repetições qualquer, máximo número de motifs 10 e amplitude ótima entre 6 e 200. 1168
  5. 5. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 C27 RCA C1 RCA C17 RCA C16 RCA C18 RCA C3 RCA C13 RCA S1 RCAFigura 3. Northen eletrônico representando, por meio de escala de cinza, os níveis de expressão dos EST-contigs nas diferentes bibliotecas (Vieira et al., 2006): Plântulas e folhas tratadas com ácido araquidônico (AR1, LP1); Folhas jovens de ramos ortotrópicos (LV4, LV5); Folhas maduras de ramos plagiotrópicos (LV8, LV9); Talos infectados com Xylella spp. (RX1); Plantas estressadas por déficit hídrico (Pool de tecidos) (SH2); Suspensão de células tratadas com acibenzolar-S-methyl (BP1); Sementes germinando (EM1, SI3); Gemas florais e frutos (FR1, FR2); não descrita (LM3); Folhas infectadas com bicho mineiro e com ferrugem (RM1); Sementes em germinação (EM1, SI3); Calos não embriogênicos (IC1, CA1, PC1). Não foram encontrados trabalhos na literatura que discorram sobre a caracterizaçãomolecular da RCA em Coffea arabica L..CONCLUSÃO Desta forma, foi possível identificar neste trabalho 09 seqüências candidatas (07contigs e 01 singlet) relacionadas à RuBisCO ativase no banco de dados do CAFEST paraCoffea arabica L., com alta similaridade a seqüências já descritas para outras plantas.AGRADECIMENTOS A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais pela concessão dabolsa de estudos ao primeiro autor.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASARAÚJO, W. L. Limitações da fotossíntese e metabolismo do carbono em folhas dediferentes posições da copa do cafeeiro (Coffea arabica L.). Viçosa: UFV, 2006, 43 f.Dissertação (Mestrado em Agronomia/Fisiologia Vegetal) - Universidade Federal de Viçosa,MG.BAILEY, T. L.; WILLIAMS, N.; MISLEH, C.; LI1, W. W. MEME: discovering andanalyzing DNA and protein sequence motifs. Nucleic Acids Research, Oxford, v. 34, p.W369-W373, 2006. 1169
  6. 6. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008DEAN, C.; PICHERSKY, E.; DUNSMUIR, P. Structure, evolution, and regulation of RbcSgenes in higher plants. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology,Palo Alto, v. 40, p. 415–439, 1989.EISEN, M. B.; SPELLMAN, P. T.; BROWN, P. O.; BOTSTEIN, D. Cluster analysis anddisplay of genome-wide expression patterns. Proceedings of the National Academy ofSciences (USA), Washington, v. 95, p. 14863-8, 1998.JENSEN, R. G.; BAHR, J. T. Ribulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase-Oxygenase. AnnualReview of Plant Physiology, Palo Alto, v. 28, p. 379-400, 1977.OLIVEIRA, R. R. de. Identificação e análise da expressão in silico de genes MADS-BOXno banco de dados de ESTs CAFEST (Coffea arabica, C. canephora e C. racemosa)Lavras: UFLA, 2007, 30p. Monografia (Ciências Biológicas - Bacharelado) - UniversidadeFederal de Lavras, MG.SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructingphylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, Oxford, v. 4, p. 406-425, 1987.SITNIKOVA, T.; RZHETSKY, A.; NEI, M. Interior-branch and bootstrap tests ofphylogenetics trees. Molecular Biology and Evolution, Oxford, v. 12, p. 319-33, 1995.TAIZ, L. E; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. Porto Alegre: Artmed, 559 p. 2004.TAMURA, K.; DUDLEY, J.; NEI, M.; KUMAR, S. MEGA4: Molecular EvolutionaryGenetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, Oxford,v. 24, n. 8, p. 1596-1599, 2007.THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G.; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, Oxford, v. 22, p.4673–4680, 1994.TUMER, N.E.; CLARK, W.G.; TABOR, G.J.; HIRONAKA, C.M.; FRALEY, R.T.; SHAH,D.M. The genes encoding the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase areexpressed differentially in petunia leaves. Nucleic Acids Research, Oxford, v. 14, n. 8, p.3325-3342, 1996.VIEIRA, L.G.E.; ANDRADE, A.C.; COLOMBO, C.A.; MORAES, A.H.A.; MEHTA, A.;OLIVEIRA, A.C.; LABATE, C.A.; MARINO, C.L.; MONTEIRO-VITORELLO, C.B.Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource. Brazilian Journal ofPlant Physiology, Campinas, v. 18, n. 1, p. 95-108, 2006. 1170

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