FUNDAÇÃO COMUNITÁRIA TRICORDIANA DE EDUCAÇÃO
Decretos Estaduais n.º 9.843/66 e n.º 16.719/74 e Parecer CEE/MG n.º 99/93
UN...
GUILHERME ARAÚJO LACERDA

CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS,
MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE
VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS...
634.772
L131c

Lacerda, Guilherme Araújo
Características citogenéticas, moleculares e
morfológicas
de
variantes
somaclonai...
“A felicidade se define como atividade de alma que
age conforme a virtude, a visão do bem individual e
social”
Aristóteles
AGRADECIMENTOS
À Deus, fonte de tudo, ao digníssimo Padre Libério, santo homem do Pai, que mesmo sem
conhecer, sempre agiu...
Aos colegas do Laboratório Central de Biologia Molecular da UFLA, Janaina, Marcela,
Monalisa, Carol, Luca, Rafael, Rodrigo...
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ILUSTRAÇÕES .........................................................................................
3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................................ 33
4 RESULTADOS...
7

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1

Página
Bananeiras com 3 meses de idade, em casa de vegetação no Setor de
Paisagismo do D...
8
anã não-variante in vitro (A) e in vivo (B) e ‘Prata-anã’ variante in vitro
(C) in vivo (D) ...............................
9

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Página
RAPD Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso ......................................
10
dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato ………………………………………….. 33
Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano ……………………………………... 33
CIEN ...
11

RESUMO
LACERDA, Guilherme Araújo. Características citogenéticas, moleculares e morfológicas
de variantes somaclonais d...
12

ABSTRACT
LACERDA, Guilherme Araújo. Characteristics cytogenetics, moleculars and
morphologicals of the somaclonal vari...
13

1 INTRODUÇÃO
A banana (Musa spp.), atualmente é cultivada nas regiões localizadas nos trópicos e
sub-trópicos, abrange...
14
corresponde ao aparecimento de plantas anormais durante o processo de multiplicação,
principalmente relacionada à estat...
15

2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Taxonomia e descrição botânica do gênero Musa
As bananeiras compreendem plantas gigantes, he...
16
vigor da planta, dispensa o uso de escoramento. Apresenta bom potencial de produtividade
sob condições de irrigação, po...
17
polifenólica e (3) Variação somaclonal, pelo aparecimento de plantas anormais, as quais não
correspondem geneticamente ...
18
Guimarães (2005) trabalhou com plantas variantes somaclonais da cultivar Prata Anã
identificadas em um bananal na cidad...
19
QUADRO 1 Seções do gênero Musa. Fonte: Adaptado de SOUZA, 2002.
Seções

2n = 2x

Importância

Callimusa

20

Interesse ...
20
cultivares do subgrupo “Cavendish” (AAA) “Nanica” e “Nanicão” (21%), sendo os demais
cultivares totalizando 4%.
TABELA ...
21
morfologicamente, e entre os cultivares do grupo AA, que apresentam uma diversidade
morfológica muito grande (SHEPHERD ...
22
dentro da membrana externa do núcleo, estando aptos a receber alguns corantes especiais.
Nessa fase a contagem precisa ...
23
De acordo com Israeli et al. (1991), as anormalidades mais freqüentemente
encontradas em bananeiras dizem respeito à es...
24
contornando os problemas que envolvam a lenta propagação da planta, o longo ciclo da
cultura (18-24 meses) e o grande e...
25

3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Genético
Foram utilizadas bananeiras micropropagadas cedidas pela empresa Multiplant...
26

FIGURA 3 Radícula de ‘Prata-anã’ variante somaclonal, explante I (PI), com
aproximadamente 2 cm, em meio de enraizamen...
27
3.2 Caracterização Citogenética em ‘Prata-anã’ e suas variantes somaclonais
3.2.1 Análise do Ciclo Celular
Foram coleta...
28
3.2.2 Sincronização do ciclo celular
Segundo protocolo adaptado de Barbosa et al. (2003), as plântulas foram retiradas ...
29
3.2.3 Contagem numérica e morfometria das placas metafásicas
Para cada planta estudada, foram avaliadas 10 metáfases pa...
30
A lavagem do sobrenadante com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) foi realizada
novamente, seguindo os mesmos volumes...
31
A corrida ocorreu a 100 V em tampão TAE (0,001 mol/L; EDTA pH 8,0; 0,04 mol/L
Tris pH 8,0; 0,02 mol/L ácido acético) po...
32
Continuação...
OPN-17

CATTGGGGAG

3108

4894

15

OPN-19

GTCCGTACTG

3019

5656

17

OPN-20

GGTGCTCCGT

3035

5876

...
33
pH 8,0; 0,02 mol/L ácido acético) por 2 horas. Após a eletroforese em solução de brometo de
etídio (0,5 µg/mL) por 20 m...
34

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 O Ciclo Celular da Bananeira ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais
Os resultados do es...
35
Algumas metáfases C (metáfases que somente poderiam ser observadas com a
utilização de um antimitótico como a colchicin...
36
O delineamento do citoplasma em relação aos cromossomos, constitui um fato que
corrobora a adequação da técnica de colo...
37

A

B

FIGURA 8 Micrografia digital do meristema radicular de bananeiras Prata-anã (in vitro): (A)
PA - não variante on...
38
definição dos cromossomos. Ainda assim, a contagem e as tentativas de elaboração de um
cariótipo não foram possíveis.
4...
39
é necessário. Martina, Adeleke e Bosa (2002), concordam que os estudos individuais dos
cromossomos em bananeiras não es...
40
médio de estômatos é relativamente menor nas plantas variantes somaclonais, porém sem
diferenças significantes.
Tanto a...
41
Na micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã nãovariante (Figura 11A), observa-se...
42

A

B

C

FIGURA 12 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã
não-variante (A) e ...
43
conseqüentemente, na entrada de água via osmose. Estes mesmos autores demonstram
algumas possibilidades envolvidas na a...
44
orgânicos cíclicos. Estes concordam com outros autores ao afirmar uma correlação indicando
que o aumento da cera reduzi...
45
Continuação...
OPN-07

CAGCCCAGAG

07

OPN-13

AGCGTCACTC

04

OPN-17

CATTGGGGAG

06

OPN-19

GTCCGTACTG

05

OPN-20

...
46
PA

PI

PII

PIII

PA

in vitro

PI

PII

PIII

C

in vivo

OPJ-04
1

2

3

4

5

6

7

8

9

Figura 13: Eletroforese h...
47
13 (5’-GACGCCACAC-3’), apresentaram bandas polimórficas que diferenciassem também a
procedência dessa cultivar em (Figu...
48
variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in
vivo).
Sendo que as condições de amo...
49
Esta distinção ocorreu em estimativas de dissimilaridade genética proposta por estes autores e
comprovou a pequena dist...
50

5 CONCLUSÕES
Os resultados do estudo do ciclo celular não revelaram quaisquer alterações
significativas que pudessem c...
51

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERT, L. H. B. FILHO, R. V. Características morfológicas da cutícula foliar e efeitos de
...
52
CROUCH, J. H. VUYLSTEKE, D. ORTIZ, R. Perspectives on the application of
biotechnology to assist the genetic enhancemen...
53
DREW, R. A. SMITH, M. K. Field evaluation of tissue-cultured bananas in South-Eastern
Queensland. Australian Journal of...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN...
Próximos SlideShares
Carregando em…5
×

CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN VITRO

802 visualizações

Publicada em

Dissertação - Guilherme Araújo Lacerda

Publicada em: Educação
0 comentários
0 gostaram
Estatísticas
Notas
  • Seja o primeiro a comentar

  • Seja a primeira pessoa a gostar disto

Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
802
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
2
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
7
Comentários
0
Gostaram
0
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN VITRO

  1. 1. FUNDAÇÃO COMUNITÁRIA TRICORDIANA DE EDUCAÇÃO Decretos Estaduais n.º 9.843/66 e n.º 16.719/74 e Parecer CEE/MG n.º 99/93 UNIVERSIDADE VALE DO RIO VERDE DE TRÊS CORAÇÕES Decreto Estadual n.º 40.229, de 29/12/1998 Pró-Reitoria de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN VITRO Três Corações 2006
  2. 2. GUILHERME ARAÚJO LACERDA CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN VITRO Dissertação apresentada à Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR como parte das exigências do Programa de Mestrado em Biotecnologia, área de concentração Biotecnologia Vegetal e Ambiental, para obtenção do título de mestre. Orientador: Prof. Dr. Luciano Vilela Paiva Co-orientador: Prof. Dr. Juscélio Clemente de Abreu Três Corações 2006
  3. 3. 634.772 L131c Lacerda, Guilherme Araújo Características citogenéticas, moleculares e morfológicas de variantes somaclonais de bananeiras ‘prata-anã’ cultivadas in vitro / Guilherme Araújo Lacerda; orientação de Luciano Vilela Paiva -- Três Corações : Universidade Vale do Rio Verde de Três Corações, 2006. 62 p. Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Biotecnologia, para obtenção do título de Mestre. 1. Banana - cultivo. 2. Banana prata-anã. 3. Estômato. I. Lacerda, Guilherme Araújo, orient. II. Abreu, Juscélio Clemente de, Co-orient. III. Título. Claudete de Oliveira Luiz CRB - 6 / 2176
  4. 4. “A felicidade se define como atividade de alma que age conforme a virtude, a visão do bem individual e social” Aristóteles
  5. 5. AGRADECIMENTOS À Deus, fonte de tudo, ao digníssimo Padre Libério, santo homem do Pai, que mesmo sem conhecer, sempre agiu positivamente em minha vida. À Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR, pela colaboração na execução do projeto, e aos professores e funcionários da mesma que direta ou indiretamente auxiliaram. À Multiplanta Tecnologia Vegetal, pelo fornecimento do material biológico. Ao meu orientador professor Dr. Luciano Paiva Vilela, pelas oportunidades e crença no potencial daqueles que buscam. Ao professor Dr. Juscélio Clemente de Abreu, por sempre acreditar na capacidade dos alunos e professores do curso de mestrado em Biotecnologia da UNINCOR, meu eterno reconhecimento pelo seu trabalho. Ao professor Dr. Sandro Barbosa, pelas orientações e apoio nos momentos desesperadores e congratulantes do processo de aprendizado no curso. Ao professor Dr. Nelson Delú Filho, entre aulas e cobranças, um amigo, que mostrou caminhos e possibilidades para progredir. Aos colegas e amigos de curso, Antônio Carlos, Cidinha, Romário, Daliane, Fabiano, Vitor, Érika, em especial a Darlê, Gilmar e Iara... estarão para sempre marcados em meu coração. Aos alunos de iniciação científica da UNINCOR, Éder, Vander, Andréia, Silvana e Giane, que sempre reconheceram meu esforço em crescer sendo meus braços quando não os tive. Ao pesquisador Dr. Eduardo Alves, pelas análise em microscopia eletrônica de varredura, e a laboratorista Helô, obrigado pelo carinho e receptividade. Ao pesquisador Dr. Antônio Chalfun Júnior, pelas orientações e conselhos, sobretudo o bom humor e o respeito com que me recebeu.
  6. 6. Aos colegas do Laboratório Central de Biologia Molecular da UFLA, Janaina, Marcela, Monalisa, Carol, Luca, Rafael, Rodrigo(s), Geraldo(s), Zé Renato, Paula Cabral, Marcus e Pedro. Em especial a Paula Torga pelo ensino de técnicas e metodologias e ao Anderson, que mesmo bravo sempre foi um companheiro de pesquisa e descobertas. A amiga Maiana, a qual eu redigiria livros para descrever o sentimento que tenho, sendo minha companheira de pesquisa nas vitórias e derrotas deste processo, saiba que nunca te esquecerei... es minha Musa laboratorial... A Dona Cidinha, pelo aconchego e carinho para quem está longe do lar e da família. A meu irmão Gustavo, lembro hoje de tantas brigas, sendo que no final nós sempre fomos um só... Ao meu papai, que me ensinou sobre a capacidade de mudança das pessoas, ao descobrir seus defeitos, supera-los e ainda ser capaz de transmitir a paz que todos deveríamos possuir. A minha mamãe, coluna, base de nossa pequena-grande família, fonte de amor, respeito, dignidade, confiança... através de sua garra e coragem, sempre me espelhei, obrigado por acreditar em mim...
  7. 7. SUMÁRIO Página LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................................... 07 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .................................................................. 09 RESUMO .............................................................................................................................. 11 ABSTRACT ......................................................................................................................... 12 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 13 2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................ 15 2.1 Taxonomia e descrição botânica do gênero Musa ...................................................... 15 2.1.1 Cultivar ‘Prata-anã’ .................................................................................................... 15 2.2 Origem e evolução das bananeiras cultivadas ............................................................. 16 2.3 Micropropagação em Musa .......................................................................................... 16 2.4 Variação Somaclonal em Musa .................................................................................... 17 2.5 Melhoramento genético de bananeiras ........................................................................ 18 2.6 Citogenética do gênero Musa ........................................................................................ 21 2.7 Marcadores Morfológicos em Plantas com Variação Somaclonal ............................ 22 2.8 Marcadores Moleculares RAPD em Musa .................................................................. 23 3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 25 3.1 Material Genético .......................................................................................................... 25 3.2 Caracterização Citogenética em ‘Prata-anã’ e suas variantes somaclonais ............ 27 3.2.1 Análise do Ciclo Celular ............................................................................................ 27 3.2.2 Sincronização do Ciclo Celular ................................................................................. 28 3.2.3 Contagem numérica e morfometria das placas metafásicas ................................... 29 3.3 Extração e quantificação do DNA ................................................................................ 29 3.4 Oligonucleotídeos (“primers”) utilizados...................................................................... 31 3.5 Amplificação via RAPD ................................................................................................ 32
  8. 8. 3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................................ 33 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 34 4.1 O Ciclo Celular da Bananeira ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais ............... 34 4.2 Sincronização do Ciclo Celular da ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais ........ 36 4.3 Morfometria dos Cromossomos de ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais ....... 38 4.4 Características Morfológicas ao Microscópio Eletrônico de Varredura................... 39 4.5 Marcadores RAPD na diferenciação de Variantes Somaclonais .............................. 44 5 CONCLUSÕES ................................................................................................................. 50 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 51 APÊNDICE .......................................................................................................................... 60
  9. 9. 7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 Página Bananeiras com 3 meses de idade, em casa de vegetação no Setor de Paisagismo do Departamento de Agricultura. À esquerda, uma planta ‘Prata Anã’ normal e à direita ‘Prata Anã’ variante ..................................... 18 QUADRO 1 Seções do gênero Musa (Fonte: Adaptado de SOUZA, 2002) ..................... 19 TABELA 1 Exemplos de alguns cultivares segundo seu grupo genômico e sua ploidia 20 FIGURA 2 Meio de multiplicação – B2, explantes de bananeira ‘Prata-anã’ cultivadas in vitro. Sala de Crescimento do Laboratório Central de Biologia Molecular da Universidade Federal de Lavras ............................................. 25 FIGURA 3 Radícula com aproximadamente 2 cm, explante I (PI) ‘Prata-anã’ variante somaclonal em meio de enraizamento – B3. Laboratório de Pesquisa I da Universidade Vale do Rio Verde, campus de Três Corações – MG ............ 26 FIGURA 4 Plântulas de bananeira ‘Prata-anã’ in vivo, normais (PA) e variantes somaclonais (PI, PII e PIII). Sala de crescimento do Setor de Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras ..... 26 FIGURA 5 Quantificação do DNA das amostras, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) caneletas 9 marcador de peso (5 ng/µL). Eletroforese horizontal em gel de agarose 1,2%, corrida a 100 volts por 25 minutos ........................................ 30 TABELA 2 Dados do primers utilizados (Oligonucleotideos Data Sheet, QIAGEN®) .. 31 FIGURA 6 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã não-variante (in vitro): (A) Placa metafásica normal, ao centro; (B) Placa metafásica com cromossomo desprendido, ao centro; (C) Anáfase; (D) Ponte anafásica, como cromossomos prendidos ........................................... 34 FIGURA 7 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã variantes (in vitro): (A) PI - Placa metafásica normal, acima e anáfase, abaixo; (B) PI – Metáfase C, ao centro; (C) PII – Metáfase C, ao centro; (D) PII – Placa metafásica, ao centro; (E) PIII - Placas metafásicas; (F) PIII – Metáfase C .......................................................................................... 35 FIGURA 8 Meristemas radiculares de bananeiras Prata-anã (in vitro): (A) PA - não variante onde observamos um bom espalhamento dos cromossomos; (B) PI – variante, notam-se ainda algumas sobreposições de cromátides .......... 37 FIGURA 9 Meristema radicular de bananeira Prata-anã (in vitro), PII variante, notamse claramente a organização metafásica dos cromossomos .......................... 38 TABELA 3 Valores médios da freqüência estomática e medidas de diâmetro polar e equatorial de estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’ ................................................................ 39 FIGURA 10 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-
  10. 10. 8 anã não-variante in vitro (A) e in vivo (B) e ‘Prata-anã’ variante in vitro (C) in vivo (D) ............................................................................................... 40 FIGURA 11 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prataanã não-variante (A) e variante (B) ambas in vivo ....................................... 41 FIGURA 12 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prataanã não-variante (A) e variantes (B) e (C) todas in vitro ............................. 42 TABELA 4 Relação do número de produtos amplificados por cada oligonucleotídeo utilizado (Oligonucleotídeos Data Sheet, QIAGEN®) ................................. 44 FIGURA 13 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1% (1g agarose + 1µL de brometo de etídeo + 100mL de TAE 1X), corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:20 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPJ-04, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro), 5-8 (in vivo) e caneleta 9 controle negativo (H2O) ....................................... 46 FIGURA 14 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPM-13, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo)................................................................................. 46 FIGURA 15 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPH-13, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) ................................................................................ 47 FIGURA 16 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPN-05, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) ................................................................................ 47
  11. 11. 9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Página RAPD Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso ......................................... 14 OPJ Primer Operon Tec série J ...................................................................... 24 OPW Primer Operon Tec série W .................................................................... 24 PA Cultivar ‘Prata-anã’ não variante ............................................................ 25 PI Cultivar ‘Prata-anã’ variante somaclonal – Explante 1 .......................... 25 PII Cultivar ‘Prata-anã’ variante somaclonal – Explante 2 .......................... 25 PIII Cultivar ‘Prata-anã’ variante somaclonal – Explante 3 .......................... 25 B2 Meio de multiplicação ............................................................................ 25 MS Murashige e Skoog (1962) ....…………………………………………. 25 BAP 6-benzilaminopurina ………………………………………………… 25 B3 Meio de enraizamento ………………………………………………… 25 NAA Ácido naftaleno acético ……………………………………………….. 25 ® Marca registrada ..................................................................................... 25 BOD Demanda bioquímica por oxigênio ......................................................... 27 TE Tampão de extração ................................................................................ 30 RNAse Ribonuclease …………………………………………………………... 30 EDTA Ácido etileno diamono tetracético .......................................................... 32
  12. 12. 10 dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato ………………………………………….. 33 Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano ……………………………………... 33 CIEN BTA-03 Bananeira variante somaclonal resistente a Sigatoka Amarela .............. 37 HU Hidroxiuréia ………………………………………………………….... 38 TAE Tampão de corrida (Tris + ácido acético + EDTA) ………………........ 46 PCR Reação em cadeia da polimerase ……………………………………… 49
  13. 13. 11 RESUMO LACERDA, Guilherme Araújo. Características citogenéticas, moleculares e morfológicas de variantes somaclonais de bananeiras ‘Prata-anã’ cultivadas in vitro. 2006. 62 p. (Dissertação – Mestrado em Biotecnologia). Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR – Três Corações – MG * A maior parte da produção de banana no Brasil é destinada ao mercado interno, o que ressalta a grande importância econômica e o elevado alcance social do cultivo, que é explorado, principalmente, por pequenos produtores. A variação somaclonal corresponde ao aparecimento de plantas anormais durante o processo de multiplicação, principalmente relacionada à estatura (no caso o gigantismo), cor, forma e arquitetura das folhas e má formação dos cachos. O objetivo deste trabalho foi averiguar os caracteres morfológicos da epiderme foliar, o comportamento citogenético, e a presença de marcadores moleculares tipo RAPD na tentativa de caracterizar os cultivares micropropagados de ‘Prata-anã’ em relação aos seus variantes somaclonais. O material in vivo foi oriundo do material in vitro, propagado a partir de plantas sabidamente normais e variantes, estando aclimatado em sala de crescimento em condições controladas de luz e temperatura. Houve diferença significativa entre o diâmetro polar dos estômatos da ‘Prata-anã’ não variante e suas variantes, ambas em condições in vitro, observando-se que o mesmo não ocorre para as plantas in vivo. Ambas as amostras apresentaram estômatos do tipo anomocítico. Foi observado também um processo evaginativo da abertura estomática nas bananeiras ‘Prata-anã’ variantes em relação às não variantes in vitro. A maior quantidade de cera presente nas plantas variantes tanto in vitro como in vivo, demonstram também a possibilidade de serem marcadores morfoanatômicos. Porém, tornam-se necessários estudos fisiológicos que expliquem o processo de evaginação da abertura estomática observada nas plantas variantes in vitro. O ciclo celular não revelou alterações significativas que pudessem comprometer a divisão celular dessas plantas. Porém, algumas células em divisão demonstraram cromossomos desprendidos da placa metafásica e anáfases em pontes. Alguns primers se comportaram diferentemente entre as plantas in vitro e in vivo apesar de ambos serem oriundos da micropropagação. Os primers OPJ-04 e OPM-13 apresentaram bandas polimórficas que diferenciaram a planta não variante material in vivo. Já o primer OPN-05 diferiu todas as plantas variantes in vitro da não variante. Sendo que as condições de amostragem do material in vitro e in vivo ocorreram em dias diferentes, apresentamos os resultados aqui obtidos como possíveis localizadores de diferenças genotípicas. * Comitê Orientador: Dr. Luciano Vilela Paiva – UFLA (Orientador), Dr. Juscélio Clemente de Abreu – UNINCOR (Co-orientador).
  14. 14. 12 ABSTRACT LACERDA, Guilherme Araújo. Characteristics cytogenetics, moleculars and morphologicals of the somaclonal variantions in bananas ‘Prata-anã’ in vitro. 2006. 62 p. (Dissertation – Master in Biotecnology). Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR – Três Corações – MG * Most of the production of banana in Brazil is destined to the domestic market, what it stands out the great economic importance and the raised social reach of the culture, that is explored, mainly, for small producers. The somaclonal variation corresponds to the appearance of abnormal plants during the multiplication process, mainly related to the stature (in this case the gigantism), color, form and architecture of the leaves and harm formation of the clusters. The objective of this work was to inquire the morphologic characters of the foliar epidermis, the cytogenetical behavior, and the presence of molecular markers type RAPD in the attempt to characterize to cultivate spread them of ‘Prata-anã’ in relation to its somaclonais variants. The in vivo material in was deriving of the material in vitro, propagated from normal and variant plants know, being acclimatized in room of growth in controlled conditions of light and temperature. It had significant difference enters the stomatical polar diameter of the not variant ‘Prata-anã’ and its variant, both in conditions in vitro, observing itself that the not occur of the plants in vivo. Both the samples had presented stomates of the anomocitical type. In vitro was also observed a evaginatian process of the stomatical opening in the variant banana plants ‘Prata-anã’ in relation to not variant in. The biggest amount of present wax in the variant plants in such a way in vitro as in vivo, also demonstrates the possibility to be marking morphoanatomical. However, necessary physiological studies become that explain the process of the evagination of the stomatical opening observed in the variant plants in vitro. The cellular cycle did not disclose alterations significant that could compromise the cellular division of these plants. However, some cells in division had demonstrated to unfastened chromosomes of the methafasical plate and anaphasical in bridges. Some primers if had differently held between the plants in vitro and in vivo although both to be deriving of the micropropagation. Primers OPJ-04 and OPM-13 had presented polymorphical bands who had differentiated the plant not variant material in vivo. Already primer OPN-05 differed all the variant plants in vitro from the not variant one. Being that the conditions of sampling of the in vivo and in vitro materials in had occurred in different days, we present the gotten results here as possible localizers of genotypical differences. * Guidance Committee: Dr. Luciano Vilela Paiva – UFLA (Major Professor), Dr. Juscélio Clemente de Abreu – UNINCOR.
  15. 15. 13 1 INTRODUÇÃO A banana (Musa spp.), atualmente é cultivada nas regiões localizadas nos trópicos e sub-trópicos, abrangendo mais de 80 países ao redor do mundo. Os brasileiros produzem milhões de toneladas de bananas por ano, sendo uma espécie cultivada de Norte a Sul, envolvendo desde a faixa litorânea até os planaltos interioranos. De acordo com Vidal e García (2000), a produção de bananas é de vital importância para centenas de milhões de pessoas em países em desenvolvimento, por quais, aproximadamente 90% do total produzido é utilizado como alimento pelo consumo doméstico in natura. O consumo de banana no mundo ocupa a quarta colocação em termos de importância alimentar, após o arroz, trigo e leite (CROUCH et al., 1999). A banana é rica em carboidratos (24%), fibras (6-7%), e ainda em elementos minerais e vitaminas como potássio, magnésio, cálcio, fósforo, sódio, ferro e vitaminas A, B e C (SHARROCK e LUSTY, 1999). O fruto da bananeira é uma das principais fontes de potássio para o corpo humano (ZAIDAN et al., 1999). A maior parte da produção de banana no Brasil é destinada ao mercado interno, o que ressalta a grande importância econômica e o elevado alcance social do cultivo, que é explorado, principalmente, por pequenos produtores. Segundo dados estatísticos, o Brasil exportou, em 2004, 188,087 milhões de toneladas deste fruto, totalizando U$ 26.983.000,00 (FAO, 2006). Há uma grande necessidade de se obter variedades geneticamente melhoradas, garantindo uma produção sustentável e ambientalmente segura, pois, a banana possui notável papel sócio-econômico em países em desenvolvimento como o Brasil. Sua importância garante tanto fonte alimentícia como fonte de divisas comerciais. A micropropagação, mediante a cultura de ápices caulinares in vitro tem sido adotada em muitos países para a produção de mudas de bananeira. No Brasil, este método vem sendo utilizado de maneira crescente nos últimos anos (ÁLVARES e CALDAS, 2002). Uma das principais vantagens das plantas propagadas in vitro, a partir de ápices caulinares, é a obtenção de plantas livres de doenças e pragas, o que reduz a dispersão de organismos fitopatogênicos (DAMASCO et al., 1996). A grande limitação da micropropagação em bananeiras é a ocorrência de variantes somaclonais, que causam grandes perdas aos produtores, como cachos sem valor comercial. Segundo Larkin e Scowcroft (1981), o fenômeno da variação somaclonal pode ser definido como uma variabilidade genética gerada durante a cultura in vitro. A variação somaclonal
  16. 16. 14 corresponde ao aparecimento de plantas anormais durante o processo de multiplicação, principalmente relacionada à estatura, cor, forma e arquitetura das folhas e má formação dos cachos (ISRAELI et al., 1991). Stover e Simmonds (1987), trabalhando com uma população representativa de bananeira cv. Grande Naine, micropropagadas in vitro, verificou que a variação somaclonal mais comumente encontrada foi com relação ao porte, variando de baixo ao gigantismo. O objetivo do presente trabalho foi averiguar o comportamento citogenético, os marcadores moleculares tipo RAPD e caracteres morfológicos da epiderme foliar para caracterizar os cultivares micropropagados de ‘Prata-anã’ em relação aos seus variantes somaclonais que apresentam a característica gigantismo.
  17. 17. 15 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Taxonomia e descrição botânica do gênero Musa As bananeiras compreendem plantas gigantes, herbáceas perenes, pertencentes à classe Liliopsida (Lilitae, Monocotyledoneae), subclasse Zingiberidae, ordem Zingiberales, família Musaceae, gêneros Musa e Ensete, que se desenvolvem em áreas tropicais e subtropicais úmidas (CRONQUIST, 1981 apud CARVALHO, 2001). Sua propagação se dá principalmente por via assexuada ou vegetativa através de mudas e brotos, embora as espécies selvagens sejam propagadas por sementes (SIMMONDS, 1973). A família Musaceae Juss., compreende apenas dois gêneros, Musa com 35 espécies e Ensete com 7 espécies, totalizando-se cerca de 42 espécies. São plantas herbáceas, de grande porte, com rizoma predominando como verdadeiro caule, sendo, em Musa o órgão de propagação mais utilizado. Acima do solo aparece o pseudocaule muito macio, formado pela junção da bainha das folhas, que são muito desenvolvidas. As folhas são convolutas, completas, grandes, inteiras, peninérveas, com nervura central em forma de canaleta, dispostas em espiral (CARVALHO, 2001). 2.1.1 Cultivar ‘Prata-anã’ Uma cultivar é um conjunto de plantas cultivadas o qual se distingue claramente por uma série de caracteres, os quais se mantém nos descendentes, quando estes reproduzem tanto sexuada quanto assexuadamente. Uma cultivar pode ser um clone, um grupo de clones indiferenciados, uma linha ou linhas de indivíduos intercruzados, uma série de indivíduos de fecundação cruzada, ou um conjunto de indivíduos formados em cada descendência, por cruzamento, como um híbrido F1. Algumas cultivares tem-se originado naturalmente, mas a maioria é criada por cultivo, tanto espontaneamente como por hibridação induzida artificialmente. O importante é que elas se mantêm sob cultivo (CARVALHO, 2001). A cultivar ‘Prata-anã’ apresenta pseudocaule vigoroso de cor verde-claro, brilhante, com poucas manchas escuras próximas a roseta foliar. O porte varia de 2,0 a 3,5 m e o diâmetro do pseudocaule é de, aproximadamente, 50 cm. A coloração do pecíolo e das nervuras principais é também verde-claro-brilhante. A roseta é compacta, as pencas são mais juntas e as bananas mais curtas e roliças que as da ‘Prata’. As pontas dos frutos tem formato de gargalo e a ráquis é coberta por flores masculinas e por brácteas, menos nos primeiros 1015 cm. O “coração” é bastante desenvolvido e a cultivar é tolerante ao frio. Devido ao grande
  18. 18. 16 vigor da planta, dispensa o uso de escoramento. Apresenta bom potencial de produtividade sob condições de irrigação, podendo atingir 30-35 t/ha/ciclo (SILVA et al., 1999a). 2.2 Origem e evolução das bananeiras cultivadas Embora o sudeste da Ásia seja considerado o centro da origem das espécies de Musa (SIMMONDS, 1995), uma grande diversidade existe na África sub-Saara, onde diferentes tipos são cultivados em diferentes sub-regiões. A introdução da banana ocorreu nos demais continentes com a expansão do comércio, atingindo toda a costa asiática banhada pelo oceano Índico, posteriormente difundindo-se pela costa africana e atingindo as Américas com as conquistas européias (DE LANGHE, 1995). 2.3 Micropropagação em Musa Por muito tempo (anos), a propagação da bananeira a muito não tem sido somente vegetativa (mediante mudas), decorrente da lentidão do processo e da disseminação de doenças e pragas para novas áreas. Uma alternativa é a micropropagação ou propagação in vitro, que tem aumentado consideravelmente o número de plantas dentro de um curto espaço de tempo. Segundo Souza et al. (1999), a micropropagação consiste-se no cultivo de segmentos muito pequenos de plantas, no caso do rizoma, denominados de explantes, realizado em meio artificial e sob condições de luminosidade, temperatura e fotoperíodos totalmente controlados em laboratório. Um aspecto importante a ser ressaltado é o potencial de propagação que o cultivo de ápices caulinares de bananeira oferece, existindo grande amplitude no número de mudas produzidas por explante em alguns laboratórios. Mencionou-se também as possibilidades para a produção comercial dessas mudas. De acordo com Sandoval Fernández (1985) apud Souza et al., 1999, a partir de um só explante é possível, teoricamente, mediante o subcultivo de gemas laterais, obter em 12 meses mais de um milhão de plântulas. A qualidade da muda é imprescindível para o bom desempenho da cultura da banana. As mudas devem ser provenientes de plantas vigorosas, sadias, produtivas, com cachos bem formados, sistema radicular em desenvolvido, rizoma e raízes sem necrose de broca e isento de nematóides (SOUTO et al., 1997). Porém, existem problemas na micropropagação como: (1) Contaminação das culturas, causada por fungos e bactérias; (2) Escurecimento dos explantes, causada pela oxidação
  19. 19. 17 polifenólica e (3) Variação somaclonal, pelo aparecimento de plantas anormais, as quais não correspondem geneticamente à planta-mãe (SOUZA et al., 1999). 2.4 Variação Somaclonal em Musa A variação somaclonal pode ser uma variação fenotípica de origem genética, ou seja, uma variação cromossômica que se torna herdável nas gerações seguintes, ou epigenética, que é uma variação transitória devido ao estresse fisiológico que o material sofre quando entra na cultura in vitro. Com a utilização da técnica de micropropagação, mudas de bananeiras provenientes de cultura de tecidos são produzidas e colocadas a disposição do agricultor. Ainda hoje, a falta de domínio dessa tecnologia, para alguns cultivares regionais de bananeira, é responsável pela colocação no mercado de mudas de qualidade duvidosa, trazendo prejuízos aos agricultores devido a ocorrência de alta taxa de variação somaclonal (SANTOS e RODRIGUES, 2004). Para Damasco et al. (1994), a ocorrência de variação somaclonal resulta em plantas possuindo fenótipos deletérios, sendo mais freqüentemente, o nanismo. De acordo com Santos e Rodrigues (2004), estudos sobre os fatores que influenciam a taxa de variação somaclonal no processo de micropropagação, descritos por Scowcroft (1984) e George e Sherrington (1984), mostraram que o aparecimento de calos em determinada fase do processo de micropropagação, relacionava-se com a taxa de variação somaclonal, bem como períodos prolongados de cultivo in vitro. Além desses fatores, Smith (1988), inclui a propagação assexuada, a instabilidade genética e a composição do meio de cultura como determinantes da ocorrência de variação somaclonal. Este mesmo autor menciona a característica do gigantismo como ocorrência de variação somaclonal ao tratar-se da altura excessiva da planta devida a longa distância o ponto de emergência da folha (estiolamento). Vários autores relatam que as mudas micropropagadas cresceram mais rapidamente nos estádios iniciais do desenvolvimento, o que pressupõe os resultados esperados por este trabalho. Segundo Drew e Smith (1990) e López e Espinosa (1995), é provável que o melhor desempenho inicial das mudas micropropagadas se deva ao fato de que estas mudas já possuem um sistema radicular ativo e área foliar com maior eficiência fotossintética desde o momento do plantio. Estes mesmos autores mencionam que o desempenho das mudas micropropagadas se deva a sanidade dessas plantas, sendo as mesmas livres de fitopatógenos como fungos, bactérias e nematódeos.
  20. 20. 18 Guimarães (2005) trabalhou com plantas variantes somaclonais da cultivar Prata Anã identificadas em um bananal na cidade de Andradas, MG, segundo parâmetros morfológicos, como folhas lanceoladas, porte mais alto, folhas mais eretas e pseudocaule mais fino que o das plantas normais (Figura 1). FIGURA 1 Bananeiras com 3 meses de idade, em casa de vegetação no Setor de Paisagismo do Departamento de Agricultura. À esquerda, uma planta ‘Prata Anã’ normal e à direita ‘Prata Anã’ variante (GUIMARÃES, 2005). De acordo com Álvares e Caldas (2002), a cultivar Nanicão micropropagada foi significativamente superior à convencional até o oitavo mês pós plantio, enquanto a ‘Prataanã’ micropropagada foi significativamente superior à convencional quanto às variáveis avaliadas até o 15o mês pós plantio (fase de florescimento). Estes mesmos autores averiguaram que 1% das bananeiras ‘Prata-anã’ eram gigantes (110 cm mais altas do que as plantas normais) e 0,5% apresentavam deformações nos cachos. Apenas os variantes somaclonais com folhas variegadas puderam ser identificados nos estádios iniciais de desenvolvimento. 2.5 Melhoramento Genético de Bananeiras O gênero Musa, do qual faz parte a cultivar Prata-anã, se divide em cinco seções: Callimusa, Rhodochlamys, Australimusa, Ingentimusa e Emmusa. De acordo com Vidal e García (2000), bananas e platanos são originados de cruzamentos intra- e inter-específicos de Musa acuminata Colla e Musa balbisiana Colla.
  21. 21. 19 QUADRO 1 Seções do gênero Musa. Fonte: Adaptado de SOUZA, 2002. Seções 2n = 2x Importância Callimusa 20 Interesse ornamental Rhodochlamys 22 Interesse ornamental Australimusa 20 Bananas comestíveis, conhecidas como Fe'is (Musa maclay) e a espécie (Musa textilis), cultivada para a produção de fibras Ingentimusa 14 Possui apenas uma espécie Musa ingens Emmusa 22 Maioria dos cultivares de banana Duas importantes alterações determinaram a domesticação da bananeira: (1) a ocorrência de partenocarpia por mutação em Musa acuminata; (2) existência de esterilidade feminina, resultando no desenvolvimento dos frutos sem a ocorrência de polinização (KAEMMER et al., 1992). Dessa forma as cultivares antigas derivadas de Musa acuminata eram diplóides com genoma AA; 2x=22 cromossomos. Devido às hibridações realizadas com esses cultivares, os mesmos passaram a triplóides e com genoma AAA; 3x=33 cromossomos. Espécies asiáticas selvagens de Musa balbisiana apresentaram compatibilidade genética com M. acuminata, sendo então incorporado ao seu genótipo o genoma B, produzindo cultivares diplóides AB, triplóides AAB, ABB e até mesmo tetraplóides AAAA, AAAB, AABB e ABBB (SOUZA, 2002). Segundo Román et al. (2005), foram comprovados a condição triplóide (2n=3x=33) de todos os clones estudados do subgrupo Cavendish do gênero Musa. O mesmo resultado foi encontrado por Guimarães (2005), porém não sendo possível diferenciar citogeneticamente a ‘Prata-anã’ (2n=3x=33) de sua variante somaclonal (número do complemento cromossômico não determinado) devido a dificuldades com a confecção das lâminas. A produção de bananas visando o mercado de exportação está concentrada em cultivares do subgrupo “Cavendish” de constituição genômica AAA, enquanto um grande número de cultivares de constituição AAA, AAB e ABB são cultivadas para consumo local em diversas regiões no mundo (SOUZA, 2002). Baseado em Silva et al (1997), no Brasil predominam cultivares locais ou “landraces” de constituição genômica AAB como ‘Prata’ ‘Pacovan’ e ‘Maçã’, que juntas correspondem a 75% da área plantada, seguida pelas
  22. 22. 20 cultivares do subgrupo “Cavendish” (AAA) “Nanica” e “Nanicão” (21%), sendo os demais cultivares totalizando 4%. TABELA 1 Exemplos de alguns cultivares segundo seu grupo genômico e sua ploidia. Cultivares/ Grupo Genótipos Genômico ‘Ouro’ ‘Caru’ ‘São Tomé’ ‘Nanica’ ‘Nanicão’ ‘Grand Naine’ ‘Caipira’ ‘Prata’ ‘Prata-anã’ ‘Pacovan’ ‘Maçã’ ‘Mysore’ ‘Terra’ ‘D’angola’ ‘Marmelo’ ‘Figo’ ‘Pioneira’ ‘Ouro da mata’ FH1A 01 FH1A 18 AA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAB AAB AAB AAB AAB AAB AAB AAB ABB AAAB AAAB AAAB AAAB Subgrupo Referência Cavendish Cavendish Cavendish Prata Prata Prata Prata Terra Terra Figo Figo - Silva, 2001 Silva, 2001 Silva, 2001 Silva e Alves, 1999 Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 Silva e Alves, 1999 Silva e Alves, 1999 Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 Silva e Alves, 1999 Silva e Alves, 1999 Silva e Alves, 1999 Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 Silva e Alves, 1999 Gomes, 2002 Silva, 2001; Silva et al., 1999b Silva e Alves, 1999 Silva, 2001 Silva e Alves, 1999 Silva e Alves, 1999 Shepherd et al. (1986 apud SILVA et al., 1999), considera que a ausência de sementes em cultivos comerciais é uma conseqüência da inexistência de pólen viável ou, ainda, de polinizadores naturais eficientes. As cultivares que se apresentam sem sementes, quando polinizadas, ou que as que produzem em quantidade pequena, podem ser tanto diplóides, quanto triplóides. O estado triplóide, por si só, provavelmente, não é a causa mais importante da esterilidade feminina em bananeiras cultivadas. A utilização efetiva dos recursos genéticos disponíveis ao melhoramento genético requer um pleno conhecimento da diversidade genética existente. Atualmente, se conhece a herança da resistência a Sigatoka negra (ORTIZ e VUYLSTEKE, 1994a), do nanismo (ORTIZ e VUYLSTEKE, 1995b), do albinismo (ORTIZ e VUYLSTEKE, 1994b), partenocarpia (ORTIZ e VUYLSTEKE, 1995a), orientação do cacho (ORTIZ, 1995), esterilidade feminina e masculina (ORTIZ, 1995), peso do cacho e outras características quantitativas (VUYLSTEKE, 2001). Na bananeira, a variabilidade genética localiza-se entre as diversas formas selvagens da espécie Musa acuminata Colla, a qual abrange sete subespécies bastante distintas
  23. 23. 21 morfologicamente, e entre os cultivares do grupo AA, que apresentam uma diversidade morfológica muito grande (SHEPHERD et al. 1986 apud SILVA et al., 1999). Uma cultivar triplóide, com um pouco de fertilidade feminina, pode produzir embriões e híbridos com 22 e 33 cromossomos, em função da meiose desequilibrada (sacos embrionários com 11 e 22 cromossomos, mais 11 cromossomos do pólen haplóide), bem como embriões e híbridos com 44 cromossomos (33 mais 11) ou 77 cromossomos (duas vezes 33 mais 11). Na prática, entretanto, são os híbridos tetraplóides, com 44 cromossomos, que têm potencial para serem utilizados como cultivares comerciais. É importante ressaltar que o pólen contribui com apenas um quarto do novo genótipo, em cada fertilização deste tipo. Portanto, é basicamente um processo de implantação de características adicionais, sem provocar outras alterações. Assim, o híbrido tetraplóide sempre apresenta as características do parental feminino triplóide, inclusive aquelas relacionadas com o paladar do fruto (DANTAS et al. 1993b apud SILVA e ALVES, 1999). 2.6 Citogenética do gênero Musa No gênero Musa existem dois números básicos de cromossomos, x=10 e x=11, de acordo com Cheesman (1948 apud DANTAS et al., 1999b). A partir de contagens dos cromossomos somáticos de dois acessos da coleção Trinidad, Shepherd (1959) apud Dantas et al. (1999b), observou dois novos números básicos de cromossomos em Musa. O primeiro acesso I.R.503, apresenta algumas semelhanças com Callimusa (série ou seção do gênero Musa), mas diferenciavam quanto às características das sementes e ao número de cromossomos (2n=18). O outro acesso, I. R. 510 que assemelha-se ao gênero Ensete quanto ao diâmetro das sementes, mas em vários outros aspectos era semelhante com Musa. Outros caracteres, a exemplo do pouco perfilhamento, eram intermediários entre os dois gêneros, e o número de cromossomos foi 2n=14. Shepherd (1999), descreve o procedimento para contagem cromossômica em Musa é bastante simples. Consiste-se basicamente em um pré-tratamento com 8-hidroxiquinoleína a 0,03% seguida de fixação em ácido acético: etanol (1:3) e maceração com uma solução de 9:1 (orceína acética 45%: HCl 1N). Finalmente este material era esmagado com solução de orceína, a fim de umedecer a amostra, seguida por confecção e selagem da lâmina. De acordo com Shepherd (1984 apud DANTAS et al., 1999b), os cromossomos da bananeira são pequenos e não são visíveis, pelo menos separadamente, numa célula que não esteja em divisão mitótica. Apresentam-se como filamentos compridos e finos dentro do núcleo; porém, no início da divisão (prófase) eles se contraem numa espiral compacta ainda
  24. 24. 22 dentro da membrana externa do núcleo, estando aptos a receber alguns corantes especiais. Nessa fase a contagem precisa é praticamente impossível. Shepherd (1992 apud DANTAS et al., 1999b) ainda ressalta que os estudos do cariótipo da bananeira tem sido dificultados em função dos cromossomos serem bastante pequenos, sendo impossível, na prática, uma caracterização estrutural. Outro entrave citado pelo mesmo autor, é a considerável freqüência de translocações. Segundo Crouch, Vuylsteke e Ortiz (1998), a maioria dos cultivares de banana e platanos tem 33 cromossomos (2n = 3x). Ao utilizar a técnica de secagem ao ar com maceração enzimática, Guimarães (2005), inferiu que com raízes coletadas de plantas variantes e não variantes in vitro foi possível se observar um número de 33 cromossomos, tendo uma pequena oscilação de um ou dois cromossomos para mais ou menos sido detectada. Células de ponta de raiz de plantas da cultivar Prata Anã adultas sabidamente normais e variantes somaclonais foram analisadas, entretanto, os resultados fornecidos não foram satisfatórios. Isso porque as plantas adultas não fornecem um material tenro o suficiente para que as lâminas tenham qualidade e a contagem possa ser realizada. As células freqüentemente apresentavam-se ‘embaçadas’, rompidas e as lâminas muito sujas, além de haver uma maior dificuldade na ligação do corante ao DNA. 2.7 Marcadores Morfológicos em Plantas com Variação Somaclonal Os marcadores fenotípicos, também conhecidos como marcadores morfológicos, correspondem aos caracteres fenotípicos qualitativos, ou seja, caracteres cujas classes fenotípicas são naturalmente distinguíveis entre si. Normalmente são representados por caracteres como: coloração de determinada estrutura da planta (flores, vagens, tegumento da semente, cotilédones, etc.) textura ou formato destas mesmas estruturas, resistência a doenças, etc. Com o incremento na multiplicação de bananeiras in vitro, o aparecimento de variações somaclonais nesta cultura foi largamente relatado (STOVER, 1987). No entanto, vale a pena ressaltar que a maioria destes relatos refere-se ao grupo Cavendish (AAA). Quatro tipos de variantes (estatura, forma da folha, cor do pseudocaule e má formação dos cachos) foram detectados por Hwang e Ko (1987), com taxas de 1,4%; 0,5%; 0,1% e 0,4% respectivamente, numa população de 46.260 plantas. Com exceção da variante variegada no pseudocaule, que é instável, todos os demais tipos de variação foram transmitidos consistentemente nas três gerações seguintes.
  25. 25. 23 De acordo com Israeli et al. (1991), as anormalidades mais freqüentemente encontradas em bananeiras dizem respeito à estatura, má formação e alterações de folhas, assim como o aparecimento de cachos mal formados. Wenzel et al. (1997), se revelou bastante interessado no entendimento de mecanismos de controle na expansão foliar. Em suas análises com mutantes anãs de cevada (Hordeum vulgare L. ‘Himalaia’), comprovou uma redução numérica das células ao longo da folha. Segundo Guimarães (2005) as plantas variantes da cultivar ‘Prata-anã’, após 3 meses na casa de vegetação, já apresentavam uma altura maior, embora as condições de luminosidade, irrigação, temperatura e substrato fossem as mesmas para as plantas variantes e normais. Assim se confirmou a eficiência na seleção daquelas plantas da cultivar Prata-anã que seriam variantes ou normais, porém sendo necessário o período de 3 meses. Para os produtores de mudas, este período torna-se demasiadamente longo, objetivando-se este estudo em identificar estes variantes ainda no cultivo in vitro. A caracterização citoanatômica e morfológica, ou seja, a avaliação de determinadas características da planta, tais como seus aspectos morfológicos, diâmetro do grão de pólen, número de cloroplastos por par de células-guarda, tamanho e densidade de estômatos foliares, tem sido adotados como critério indireto na identificação de ploidias (VICHIATO, 2005). 2.8 Marcadores Moleculares RAPD em Musa Os marcadores RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) representam um marco na análise genética por se tornarem um processo de análise de marcadores moleculares rápido e de custo relativamente reduzido, tornando-se bastante acessível. A técnica baseia-se em PCR (Polimerase Chain Reaction), no qual fragmentos de DNA podem ser amplificados especificamente pelo uso de primers adequados flanqueando um fragmento do DNA da amostra compatível. A variação no resultado decorre da presença ou ausência de sítios de homologia a seqüência dos primers utilizados (FERREIRA e GRATAPAGLIA, 1998). A tecnologia do RAPD é um caminho muito rápido para se obter informações sobre a variabilidade genética (FORD-LOYD et al., 1996). Kaemmer et al. (1992) utilizaram seqüências de microssatélites e amplificação aleatória (RAPD) na avaliação do polimorfismo de quinze cultivares representativos do gênero Musa, compreendendo genótipos AA, AAA, AAB, ABB e BB, tendo sido possível identificar bandas específicas de genoma A e B. A identificação de marcadores é de grande interesse para o melhoramento, pois permite que a definição da composição genômica de um híbrido seja feita em estágio de plântula ou in vitro,
  26. 26. 24 contornando os problemas que envolvam a lenta propagação da planta, o longo ciclo da cultura (18-24 meses) e o grande espaço requerido. O potencial do uso de marcadores RAPDs para identificação precoce de variantes somaclonais aliado a caracterização desses clones tem sido avaliado em Musa. Kaemmer et al. (1992) identificaram em bananeira um polimorfismo de RAPD entre um mutante induzido (‘GN 60’) de ‘Grande Naine’ e a planta original. Mais recentemente, Damasco et al. (1996) avaliaram 57 plantas normais e 59 plantas anãs de Cavendish utilizando 66 primers arbitrários, e identificaram um primer (OPJ-04) capaz de amplificar um fragmento de 1500 pares de base, presente apenas nas plantas normais. Ford-Lloyd, Howell e Newbury (1992) avaliaram a instabilidade genética em germoplasma de musa mantido in vitro, empregando-se marcadores RAPD. Bhat e Jarret (1995) demonstram a utilidade de marcadores RAPD na caracterização do germoplasma de Musa, tendo sido possível diferenciar clones que se mostram idênticos sob o ponto de vista morfológico. Segundo Guimarães (2005), o primer de RAPD OPW-08 distinguiu uma planta variante somaclonal de todas as demais, inclusive de outras plantas também variantes, sugerindo que a variação não ocorre de maneira uniforme no genoma, apesar das características morfológicas serem compartilhadas por todos os variantes.
  27. 27. 25 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material Genético Foram utilizadas bananeiras micropropagadas cedidas pela empresa Multiplanta Tecnologia Vegetal – Ltda, repicadas a partir de variantes somaclonais previamente determinados, de acordo com as características morfológicas como altura das plantas e de plantas sem sintomas de variação. Como se tratavam de três plantas variantes distintas, foram designadas PI, PII e PIII, sendo as não-variantes designadas PA – ‘Prata-anã’. Os explantes de bananeira foram repicados em condições assépticas por períodos entre 30 e 60 dias, afim de multiplicar o número de clones utilizando-se o meio apropriado B2 (MS sais, MS vitaminas, 3% sacarose, 3 a 5 mg/L BAP, 5 g/L ágar, pH 5,7). A temperatura da sala de crescimento estava condicionada entre 27-28°C e luz constante. A Figura 2 mostra uma visão parcial das plantas propagadas sob condições in vitro. FIGURA 2 Meio de multiplicação – B2, explantes de bananeira ‘Prata-anã’ cultivadas in vitro. Sala de Crescimento do Laboratório Central de Biologia Molecular do Departamento de Química da Universidade Federal de Lavras. Para induzir o enraizamento, os explantes propagados no meio de multiplicação B2 foram transferidos para o meio de enraizamento B3 (MS vitaminas, MS sais, 3% sacarose, 0,5 mg/L NAA, 5 g/L ágar e pH 5,7). Com aproximadamente 7-10 dias, os explantes já apresentavam sistema radicular, conforme demonstrado na Figura 3.
  28. 28. 26 FIGURA 3 Radícula de ‘Prata-anã’ variante somaclonal, explante I (PI), com aproximadamente 2 cm, em meio de enraizamento – B3. Após estabelecimento do sistema radicular in vitro, as plântulas foram aclimatizadas em substrato comercial (Empresa Vida Verde Ltda.), e mantidas no setor de Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Lavras (Figura 4). Sendo assim denominadas material in vivo. FIGURA 4 Plântulas de bananeira ‘Prata-anã’ in vivo, normais (PA) e variantes somaclonais (PI, PII e PIII). Sala de crescimento do Setor de Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras.
  29. 29. 27 3.2 Caracterização Citogenética em ‘Prata-anã’ e suas variantes somaclonais 3.2.1 Análise do Ciclo Celular Foram coletadas cinco radículas de cada explante (PA, PI, PII e PIII) in vitro, com 1-2 cm de comprimento e 12 dias em meio de enraizamento - B3. As radículas foram então lavadas com água destilada e o excesso de água retirado. A seguir foram transferidos para quatro frascos de 5 mL distintos, previamente identificados em PA, PI, PII e PIII, contendo solução fixadora Carnoy I (3:1), onde permaneceram por 24 horas. Após a fixação, as raízes foram lavadas em água destilada por 5 minutos, sendo as raízes imersas em outra placa de Petri com água destilada por mais 5 minutos (dois banhos). Após os banhos as radículas foram submetidas à maceração enzimática utilizando-se uma solução de pectinase (1,18 U/mg) 2% : celulase (17,8 mg proteína por mL) 20%, em gerbox por duas horas a 35°C em estufa B.O.D. Q-315F16 Quimis®. Terminada a maceração enzimática, as raízes foram lavadas rapidamente em água destilada. Em seguida, foram submetidas a uma hidrólise ácida em HCl a 1N por 8 minutos em banho maria a 60°C, e a um tratamento hipotônico em água destilada gelada, afim de propiciar um choque térmico para enrijecer um pouco as radículas. As radículas foram então coradas utilizando o Reativo de Schiff (Feulgen), em frascos de 5mL cobertos com papel alumínio, devido à natureza fotolábil do corante, por 1 hora. A montagem das lâminas deu-se sob estereomicroscópico binocular Q724S-1 Quimis®, com a região meristemática evidenciada pelo corante. A dissociação celular foi feita com o auxílio de uma agulha de seringa de 1mL, gotejando, com pipeta de Pasteur, ácido acético 45% para impedir a oxidação. A coifa foi mantida afim de evitar perda de material meristemático em radículas muito pequenas. O material foi então macerado com a própria agulha da seringa e em seguida coberto com a lamínula. Foi utilizado o papel filtro para retirar o excesso de ácido acético 45%, batendo levemente com a extremidade do pincel para esmagamento do material, seguindo-se por uma pressão digital do polegar sobre a lâminalamínula-papel filtro, afim de espalhar melhor o material. A seguir o material foi fixado a lâmina com o auxílio do balão de nitrogênio líquido e retirando-se logo a lamínula. As lâminas foram deixadas para secar em temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período, foram varridas em microscópio biológico digital Q720D Quimis®, em aumento total de até 400x, sendo então selecionadas as melhores para serem seladas com Entelan.
  30. 30. 28 3.2.2 Sincronização do ciclo celular Segundo protocolo adaptado de Barbosa et al. (2003), as plântulas foram retiradas da cultura in vitro e lavadas em água destilada a fim de remover o excesso de meio de cultura. Em seguida todos os explantes (PA, PI, PII e PIII) tiveram suas radículas, in vivo, imersas em solução contendo 240 mg/L de hidroxiuréia para fins bioquímicos Merk® (CH4N2O2, 5 g, M=76,06 g/mol) por 15 horas. Para manter a parte aérea das plântulas fora de contato com a solução, utilizaram-se copos plásticos, tomando-se o cuidado de identificar adequadamente o material. Transcorridas as 15 horas, o material foi lavado (recuperado) em água corrente de torneira durante 6 horas, para remoção da solução de hidroxiuréia. Em seguida o excesso de água foi retirado, utilizando-se o pincel e o papel filtro. Só então as radículas foram coletadas de cada plântula (PA, PI, PII e PIII), com aproximadamente 0,5 cm de comprimento e 8 dias em meio de enraizamento - B3. As radículas foram pré-tratadas com 8-hidroxiquinoleína 300 mg/L (0,03%) por 6 horas, protegidas da luz, em temperatura ambiente. O material foi então submetido a um banho rápido em água destilada para remoção de resíduos do antimitótico. A seguir, transferiu-se para quatro frascos de 5 mL distintos e previamente identificados em PA, PI, PII e PIII contendo a solução fixadora Carnoy I (3:1), onde permaneceram por 24 horas. Após a fixação, as raízes foram lavadas em água destilada por 5 minutos, sendo as raízes imersas em outra placa de Petri com água destilada por mais 5 minutos (dois banhos). Após os banhos, as radículas foram submetidas a maceração enzimática, utilizando-se a solução pectinase (1,18 U/mg) 2% : celulase (17,8 mg proteína por mL) 20%, em gerbox por duas horas a 35°C em estufa B.O.D. Q-315F16 Quimis®. Terminada a maceração enzimática, as raízes foram lavadas rapidamente em água destilada. Em seguida seguiu-se a hidrólise ácida em HCl a 1N por 8 minutos em banho Maria a 60°C com os quatro materiais (PA, PI, PII e PIII). A partir disso procedeu-se um banho em água destilada gelada, afim de propiciar um choque térmico para enrijecer um pouco as radículas. As radículas foram então coradas utilizando o Reativo de Schiff (Feulgen), em frascos de penicilina cobertos com papel alumínio, devido a natureza fotolábil do corante, por 2:30 horas. A montagem das lâminas seguiu-se segundo o item 3.2.1.
  31. 31. 29 3.2.3 Contagem numérica e morfometria das placas metafásicas Para cada planta estudada, foram avaliadas 10 metáfases para a determinação do número cromossômico. A análise morfoanatômica das placas metafásicas dos cromossomos foi realizada em metáfases oriundas do experimento de ciclo celular, sendo corados com Reativo de Schiff (Feulgen). Para a captura das imagens foi utilizado o microscópio biológico digital Q720D Quimis® no laboratório de Pesquisa I da Universidade Vale do Rio Verde, Campus de Três Corações – MG. As medições das placas metafásicas foram feitas com o software Jandel Sigma Scan® Pro v. 2.0, realizadas no laboratório de Citogenética do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras, em Lavras – MG. As medidas de comprimento das placas metafásicas dos cromossomos obtidas pelo processo análise de imagem, foram determinadas pela média de 10 placas metafásicas por planta (PA, PI, PII e PIII), utilizando-se as “ferramentas” do programa citado. Os resultados obtidos nessas avaliações foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas através do teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. 3.3 Extração e quantificação do DNA Para extração do DNA utilizou-se o protocolo adaptado de Guimarães (2005), onde cerca de 1g de tecido foliar fresco foi triturado em N2 líquido, utilizando-se pistilo e almofariz, até obter um pó bastante fino. Em seguida, o material foi transferido para microtubos gelados, que foram preenchidos com 800 µL de tampão de extração (2% CTAB (p/v), 0,1 mol/L Tris-HCl pH 8,0, 1,4 mol/L NaCl, 0,02 mol/L EDTA pH 8,0, 1% Sarcosil (p/v), 1% PVP (p/v)) e 2 µL β-mercaptoetanol pré-aquecido a 65 °C, os quais foram adicionados e misturados no triturado foliar. Esta mistura foi mantida em banho maria a 65 °C, por 1 hora, com homogeneização a cada 15 minutos, tendo o cuidado de observar sempre o contato do tampão com o material vegetal. Após este período, a mistura foi deixada em temperatura ambiente por 5 minutos, sendo homogeinizada manualmente. Em seguida, 1 volume (600 µL) de solução de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) foi adicionado ao tubo e agitado por 10 minutos. A separação das fases orgânica e aquosa foi realizada por centrifugação a 18.000 x g, por 5 minutos, à temperatura ambiente, onde o sobrenadante (fase aquosa) foi transferido para um novo microtubo.
  32. 32. 30 A lavagem do sobrenadante com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) foi realizada novamente, seguindo os mesmos volumes, tempos de agitação e centrifugação. Após a segunda lavagem, a fase aquosa foi transferida para um novo microtubo e 900 µL de isopropanol gelado foram adicionados para que o DNA fosse precipitado. O microtubo foi então invertido levemente, para aumentar a precipitação e incubação por 30 minutos a –20 °C. Após este período, a solução foi centrifugada a 18.000 x g, por 10 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado por inversão; 300 µL de etanol 70% gelado foram adicionados e o tubo foi levemente girado para que o sedimento e paredes fossem lavadas. O microtubo foi centrifugado a 18.000 x g, por 3 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado por inversão. O sedimento foi seco em câmara de fluxo laminar por 2 horas e ressuspenso em 47,5 µL de tampão 0,01 mol/L Tris-HCl pH 8,0 adicionado de 2,5 µL de RNAse + TE (100 µg/mL) em banho maria por 30 minutos a 37o C. Em seguida, o material foi centrifugado a 18.000 x g por 3 minutos, em temperatura ambiente, sendo descartado o sobrenadante. Foi adicionado 900 µL de isopropanol gelado mais 90 µL de acetato de sódio 3 M para melhor precipitação do DNA. O material foi incubado por 30 minutos em –20o C e centrifugado a 18.000 x g por 3 minutos, a temperatura ambiente, sendo descartado o sobrenadante. Em seguida, adicionou-se 300 µL de etanol 70% gelado, agitando levemente para levantar o sedimentado e centrifugado novamente a 1800 x g por 3 minutos, a temperatura ambiente, sendo descartado o sobrenadante por inversão. As amostras foram secas em câmara de fluxo laminar por 1 hora e ressuspensadas em 50 µL de tampão 0,01 mol/L Tris HCl e armazenadas em freezer a –20o C. A quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose 1,2%, pela comparação com padrões de DNA de concentração conhecida (Figura 5). PA PI PII PIII PA PI PII PIII MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 FIGURA 5 Quantificação do DNA das amostras, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) caneleta 9 marcador de peso (5 ng/µL). Eletroforese horizontal em gel de agarose 1,2%, corrida a 100 volts por 25 minutos.
  33. 33. 31 A corrida ocorreu a 100 V em tampão TAE (0,001 mol/L; EDTA pH 8,0; 0,04 mol/L Tris pH 8,0; 0,02 mol/L ácido acético) por 25 minutos. Após a eletroforese, o gel foi incubado em solução de brometo de etídio (0,5 µg/mL) por 15 minutos, lavado por 10 minutos em água corrente, sendo visualizado sob luz ultravioleta e fotografado em equipamento EDAS 290 (Kodak®). De posse das concentrações reais de cada amostra, aproximadamente 50 ng/µL, o DNA foi diluído (5x) em água de mili-Q até a concentração de trabalho de 10 ng/µL, sendo tanto a solução estoque e a de trabalho mantidas a 4 °C. 3.4 Oligonucleotídeos (“primers”) utilizados Os primers utilizados foram diluídos segundo protocolo de Ferreira e Grattapaglia (1998). Baseados em informações contidas nos folhetos explicativos destes kit de primers, adicionou-se em volume (µL) de tampão TE, a quantidade em µg de cada primer utilizado (Tabela 2). TABELA 2 Dados do primers utilizados (Oligonucleotideos Data Sheet, QIAGEN®). Código 5’ - 3’ Peso Molecular pmoles µg/tubo OPH-13 GACGCCACAC 2982 5267 16 OPJ-04 CCGAACACGG 3013 5056 15 OPJ-10 AAGCCCGAGG 3062 4864 15 OPJ-13 CCACACTACC 2917 5656 16 OPP-05 CCCCGGTAAC 2973 5616 17 OPP-06 GTGGGCTGAC 3084 5267 16 OPP-08 ACATCGCCCA 2957 5415 16 OPP-09 CTGGTCCGCA 3044 5495 17 OPP-17 TGACCCGCCT 2964 6015 18 OPN-01 CTCACGTTGG 3019 5656 17 OPN-02 ACCAGGGGCA 3062 4864 15 OPN-03 GGTACTCCCC 2964 6015 18 OPN-05 ACTGAACGCC 2997 5194 16 OPN-07 CAGCCCAGAG 3022 5058 15 OPN-13 AGCGTCACTC 2988 5533 17 Continua…
  34. 34. 32 Continuação... OPN-17 CATTGGGGAG 3108 4894 15 OPN-19 GTCCGTACTG 3019 5656 17 OPN-20 GGTGCTCCGT 3035 5876 18 OPM-02 ACAACGCCTC 2957 5415 16 OPM-04 GGCGGTTGTC 3075 5616 17 OPM-05 GGGAACGTGT 3108 4894 15 OPM-07 CCGTGACTCA 2988 5533 17 OPM-12 GGGACGTTGG 3124 5058 16 OPM-13 GGTGGTCAAG 3108 4894 15 OPM-14 AGGGTCGTTC 3059 5415 17 OPM-19 CCTTCAGGCA 2988 5533 17 OPU-06 ACCTTTGCGG 3019 5656 17 OPU-08 GGCGAAGGTT 3108 4894 15 Deste estoque básico preparou-se um estoque de trabalho fazendo-se uma diluição de 1:200 (2 µL da solução de primer 1 µg/µL e 398 µL de água de mili-Q) para se obter uma concentração final de 5 ng/µL. No ensaio RAPD foram utilizados 3 µL deste estoque de trabalho por reação, ou seja, uma quantidade final de 15 ng. 3.5 Amplificação via RAPD Moléculas de DNA foram isoladas de todos os cultivares variantes e não variantes utilizados no trabalho sendo testados os diferentes primers RAPD (série Operon) visando a diferenciação molecular das plantas normais em relação as variantes. O volume final de cada reação de amplificação foi 10 µL contendo 10 ng de DNA, 20 nmol/L Tris-HCl pH 8,4, 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol/L MgCl2, 50 µmol/L de cada um dos dNTPs, 0,25 µmol/L do primer RAPD correspondente e 0,5 unidades (U) de enzima Tag DNA polimerase. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador modelo Mastercycler (Eppendorf, Hanburg, Germany), utilizando-se um programa com desnaturação inicial a 95 °C por 1 minuto, seguido por desnaturação 94 °C por 10 segundos, anelamento a 36 °C por 1 minuto e extensão a 72 °C por 2 minutos. Os passos da desnaturação, anelamento e extensão foram repetidos 34 vezes e, em seguida, a reação foi finalizada por uma extensão a 72 °C por 7 minutos. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose 1% (m/v), com eletroforese a 100 V em tampão TAE (0,001 mol/L; EDTA pH 8,0; 0,04 mol/L ta
  35. 35. 33 pH 8,0; 0,02 mol/L ácido acético) por 2 horas. Após a eletroforese em solução de brometo de etídio (0,5 µg/mL) por 20 minutos, lavado em água corrente por 10 minutos, sendo visualizado sob luz ultravioleta e fotografado no equipamento EDAS 290 (Kodak®). 3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Visando a diferenciação morfológica precoce de plantas cultivadas ‘Prata-anã’ nãovariante e variantes in vitro e in vivo, realizou-se cortes a mão livre em folhas destes explantes, previamente lavadas em água corrente. Os cortes foram com largura e altura máximos de 2 cm. As amostras assim obtidas foram imersas em solução fixativa Karnovisk’s modificado: glutaraldeído 2,5%, formaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio 0,05M, pH 7,8 por um período de 24 horas. Em seguida, foram lavados em tampão cacodilato (três vezes de 10 min), pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio 1% em água por 1 hora e subseqüentemente lavados 3 vezes em água destilada, seguida da desidratação em uma série de acetona (25, 50, 75, 90 uma vez cada e 100% por três vezes). Posteriormente, as amostras foram levadas para o aparelho de ponto crítico para completar a secagem. Os espécimes obtidos foram montados em suportes de alumínio stubs, com fita de carbono dupla face colocada sobre uma película de papel alumínio, cobertos com ouro e observados em microscópio eletrônico de varredura LEO EVO 40XVP. Diversas imagens para cada amostra foram geradas e registradas digitalmente, a aumentos variáveis, nas condições de trabalho de 20 Kv e distância de 9 mm. A freqüência estomática, baseou-se em 10 micrografias de diferentes áreas foliares da superfície abaxial, observando-se a média entre o número das plantas variantes e nãovariantes in vitro. Para cada planta, foram determinadas os diâmetros polar e equatorial de 20 estômatos tomados aleatoriamente, segundo metodologia proposta por Boeger e Wisniewski (2003). Para aferição dos diâmetros, foi utilizado o software LEO-32 v 4.0 2003. Os resultados obtidos nessas avaliações foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas através do teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
  36. 36. 34 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 O Ciclo Celular da Bananeira ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais Os resultados do estudo do ciclo celular de plantas apresentando variação somaclonal não revelaram alto índice de alterações significativas, como pontes cromossômicas, migrações tardias e cromossomos desprendidos, que pudessem comprometer a divisão celular dessas plantas. Porém, algumas células em divisão, demonstraram cromossomos desprendidos da placa metafásica (Figura 6B) e anáfases em pontes (Figura 6D). Embora a freqüência destas anormalidades tenha sido baixa, a mesma poderia acarretar mixoploidias, podendo as plantas tanto variantes como não variantes apresentar vários números cromossômicos (x=9, 10 e 11). A B C D FIGURA 6 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã nãovariante (in vitro): (A) Placa metafásica normal, ao centro; (B) Placa metafásica com cromossomo desprendido, ao centro; (C) Anáfase; (D) Ponte anafásica, como cromossomos prendidos.
  37. 37. 35 Algumas metáfases C (metáfases que somente poderiam ser observadas com a utilização de um antimitótico como a colchicina) também puderam ser notadas como pode ser visto nas figuras 7B, 7C e 7F. A B C D E F FIGURA 7 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã variantes (in vitro): (A) PI - Placa metafásica normal, acima e anáfase, abaixo; (B) PI – Metáfase C, ao centro; (C) PII – Metáfase C, ao centro; (D) PII – Placa metafásica, ao centro; (E) PIII - Placas metafásicas; (F) PIII – Metáfase C.
  38. 38. 36 O delineamento do citoplasma em relação aos cromossomos, constitui um fato que corrobora a adequação da técnica de coloração de Feulgen (Schiff) em comparação a Orceína Acética 2% adotada por Shepherd (1999). Román et al. (2005), em estudos com clones triplóides dos subgrupos ‘Plantain’ e ‘Bluggoe’ (grupo ABB) confirmaram o tamanho relativamente pequeno dos cromossomos e também a estabilidade numérica nestes clones. No entanto, Giménez et al. (2001), em estudo citogenético de um variante somaclonal de banana (CIEN BTA-03) resistente a Sigatoka Amarela demonstraram um aumento no número cromossômico como evento mutagênico significante. Segundo Souza, Costa e Souza (1998), as variações somaclonais são influenciadas tanto por fatores intrínsecos, a exemplo da instabilidade genética da cultivar, como extrínsecos, no que diz respeito ao meio de cultura, número de subcultivos, tipo e grau de diferenciação dos explantes utilizados. Possivelmente a associação entre esses fatores ou sua atuação de forma isolada, podem ter favorecido a alteração das bases genéticas, acarretando mudanças no cariótipo como aneuploidia, poliploidia e mixoploidias; mudanças associadas a rearranjos cromossômicos, como translocações, deleções e inversões; rearranjos de genes somáticos; amplificação gênica, assim como crossing over. Nenhuma dessas modificações puderam ser observadas nos materiais estudados no presente trabalho. 4.2 Sincronização do Ciclo Celular da ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais O número de metáfases não foi significante em comparação às metáfases encontradas sem a utilização de antimitóticos e hidroxiuréia. Ressalta-se no entanto, que utilizou-se somente de um tratamento de 15 horas, sabendo-se que um ciclo celular pode ter 24 horas com a mitose ocorrendo em mais ou menos 1 hora em eucariotos. Dentre as concentrações de 8-hidroxiquinoleína utilizadas, a concentração de 0,03% (Shepherd, 1999) foi a que se mostrou mais eficiente, mesmo se comparada a diferentes concentração da mesma (0,003% e 0,3%), e estas em associação a ciclohexamida (25 mg/L) e em comparação com a colchicina (0,05%). Ao se realizar um pré-teste de tratamento com a colchicina verificou-se uma total oxidação das radículas, bem como a menção do potencial condensativo da mesma. Neste último caso, o que se espera de cromossomos tão pequenos é uma descondensação e espalhamento para facilitar a contagem e a observação dos mesmos. Os resultados do experimento de sincronização demonstraram que o melhor espalhamento ocorreu com o material não variante (Figura 8A) em todos os cromossomos da planta variante apresentaram-se mais condensados, como os observados na figura 8B.
  39. 39. 37 A B FIGURA 8 Micrografia digital do meristema radicular de bananeiras Prata-anã (in vitro): (A) PA - não variante onde observamos um bom espalhamento dos cromossomos; (B) PI – variante, notam-se ainda algumas sobreposições de cromátides. De acordo com Torres, Davide e Bearzoti (2003), uma das dificuldades encontradas em estudos citogenéticos é a baixa taxa de divisão celular dos meristemas radiculares de algumas plantas. Tal obstáculo é superado, em alguns casos, com o uso de bloqueadores de mitose, que propiciam o acúmulo de células em metáfase, bem como a individualização dos cromossomos. No entanto, muitas vezes os índices metafásicos obtidos ainda não são satisfatórios para análises mais detalhadas, fato observado neste trabalho. Altos índices mitóticos e metafásicos tem sido obtidos em células de ponta de raiz de várias espécies por meio de sincronização do ciclo celular com hidroxiuréia (HU). Esse composto inibe de forma reversível a produção de desoxirribonucleotídeos, impedindo a síntese de DNA e, portanto, bloqueando o ciclo na interfase. Após remoção da HU, o ciclo prossegue normalmente, com um número elevado de células em sincronia (PAN et al., 1993 apud TORRES, DAVIDE e BEARZOTI, 2003). Segundo Woloszyn, Golczyk e Joachimiak (2001), a hidroxiuréia deteve grandes frações de células de Alliun cepa L. em sincronizações nas fase sucessivas como G1 e G2, com um tratamento de 13 horas. Navarrete, Pérez-Villamil e López-Sáes (1979), mencionam um tratamento de 8 horas, revelando também uma ação mais eficiente da hidroxiuréia sob a fase G2 do que G1. Lendvai et al. (2002), obtiveram sucesso com um tratamento de 3 horas para a fase S e um tratamento de 9-12 horas para a fase G2. Neste caso, observa-se que o tratamento não foi adequado a cultivar Prata-anã variantes e não variantes, sugerindo talvez novos testes e adequações do tempo de exposição e/ou recuperação das amostras. De acordo com Guimarães (2005), utilizou-se os seguintes critérios na avaliação da qualidade das lâminas preparadas: espalhamento das células na lâmina, presença de citoplasma circundando os cromossomos, definição dos núcleos interfásicos, espalhamento e
  40. 40. 38 definição dos cromossomos. Ainda assim, a contagem e as tentativas de elaboração de um cariótipo não foram possíveis. 4.3 Morfometria das Placas Metafásicas de ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais Como não foi possível construir o cariótipo da cultivar ‘Prata-anã’ e de suas variantes somaclonais devido ao tamanho muito pequeno dos cromossomos. Afim de se estabelecer uma possível diferença na distribuição equatorial dos cromossomos de PA, PI, PII e PIII, mediu-se o comprimento das placas metafásicas (Figura 9) oriundas do estudo de ciclo celular. Os resultados obtidos entre o comprimento médio das placas metafásicas foram: ‘Prata-anã’não variante (PA) 5,44 µm - ab; variante somaclonal 1 (PI) 5,36 µm - ab; variante somaclonal 2 (PII) 6,44 µm - a; e variante somaclonal 3 (PIII) 4,96 µm - b. FIGURA 9 Meristema radicular de bananeira Prata-anã (in vitro), PII variante, notam-se claramente a organização metafásica dos cromossomos. Os valores dos comprimentos médios das placas metafásicas não demonstraram diferença significativa, afim de se estabelecer um marcador citogenético na diferenciação do material não variante e variante somaclonal. De acordo com Cuco et al. (2003), os procedimentos para preparações citológicas com alta freqüência de metáfases para a análise de cariótipos de plantas dependem do estabelecimento de uma rotina de obtenção de raízes apresentando meristemas com alto índice mitótico. Aliado a isto, também é desejável a obtenção de preparações com alta freqüência de metáfases apresentando cromossomos com morfologia nítida. Segundo Valárik et al. (2002), um melhor conhecimento do cariótipo e estrutura dos cromossomos para a evolução em Musa
  41. 41. 39 é necessário. Martina, Adeleke e Bosa (2002), concordam que os estudos individuais dos cromossomos em bananeiras não estão bem identificados em estrutura e números de complemento cromossômico. Análises dos cromossomos de Musa tem sido complexas devido a dificuldades como preparações citogenéticas com cromossomos pequenos (1 a 2 µm), sendo o genoma nuclear delimitado em aproximadamente 600 Mpb, tendo cada cromossomo cerca de 50 Mpb de DNA (DOLEZELOVA et al., 1998). Fatores como estes, segundo os mesmos autores impedem o desenvolvimento de um cariótipo fiel em Musa e o desenvolvimento de um mapa citogenético físico. Osuji et al. (1998), relata que apenas um em 11 cromossomos por genoma de duas espécies de Musa analisadas apresentou uma região 18S-25S rDNA reproduzível detectada por hibridização in situ. Entre as espécies analisadas por estes mesmos autores, não foram encontradas quaisquer correlações entre o número do cromossomo, tamanho do cromossomo ou posição taxonômica, com número de regiões 18S-25S rDNA sendo evidentes. 4.4 Características Morfológicas ao Microscópio Eletrônico de Varredura O número médio de estômatos, bem como os dados relativos aos diâmetros polar e equatorial dos mesmos na cultivar Prata-anã não-variante e variante são apresentados na (Tabela 3). TABELA 3 Valores médios da freqüência estomática e medidas dos diâmetros polar e equatorial de estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’. Número Médio de Prata-anã Diâmetro Polar Diâmetro Equatorial Estômatos (mm2) µm µm In vitro In vivo In vitro In vivo In vitro In vivo PA - não variante 126,78a 159,51a 33,13a 31,38ab 34,83a 30,95b PI - variante 1 110,11a 145,82a 30,99b 32,73a 28,17b 37,75a PII - variante 2 108,92a 116,66a 28,80c 31,74ab 29,41b 33,32b PIII - variante 3 64,28b 104,75b 28,12c 29,41b 34,83a 31,48b *Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo Teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Como pode ser observado houve diferença significativa (p<0,01) entre a diâmetro polar da ‘Prata-anã’ não variante e suas variantes in vitro. Verifica-se também que o número
  42. 42. 40 médio de estômatos é relativamente menor nas plantas variantes somaclonais, porém sem diferenças significantes. Tanto as superfícies abaxiais quanto adaxiais apresentam ausência total de tricomas. Porém, essas superfícies se distinguem quanto ao número de estômatos e a posição dos mesmos em relação às células epidérmicas. A superfície adaxial apresenta um número bastante reduzido de estômatos, e os mesmos parecem estar dispostos em um plano diferente das células epidérmicas, demonstrando certa concavidade. No entanto, nenhuma dessas características diferem nas plantas variantes das não variantes. O estômato de todas as amostras foi classificado como do tipo anomocítico ou de células irregulares, em que as células circundantes são em número indefinido e não diferem das outras células epidérmicas (Figura 10). A C B D FIGURA 10 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã não-variante in vitro (A) e in vivo (B) e ‘Prata-anã’ variante in vitro (C) in vivo (D). De acordo com Faria et al. (2000), fatores ambientais podem alterar, dentro de certos limites, o número de estômatos por unidade de área foliar, fato este comprovado por Ferris e Taylor (1994) relacionando mudanças na anatomia foliar, como a densidade estomática, por incrementos de CO2 atmosférico.
  43. 43. 41 Na micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã nãovariante (Figura 11A), observa-se os estômatos do tipo anomocítico, enfileirados de maneira uniforme, enquanto na superfície abaxial da cultivar Prata-anã variante(Figura 11B), os estômatos são distribuídos de maneira menos uniforme, sendo a cera bastante desenvolvida. A B FIGURA 11 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã não-variante (A) e variante (B) ambas in vivo. A descamação de cera é evidente somente nas plantas variantes de ambos os materiais (in vitro e in vivo) podendo atuar dessa forma como marcador morfoanatômico. Fica evidente ao observar esse processo evaginativo da abertura estomática nas bananeiras ‘Prata-anã’ variantes (Figura 12B e 12C) em relação às não variantes (Figura 12A). Isso se deve, possivelmente, a algum processo fisiológico acarretado pelas mudanças na membrana plasmática das células guarda e/ou mudanças na área de superfície do tonoplasto dessas células. Na cultivar Prata-anã não-variante in vivo quanto in vitro, confirmou-se também o estômato do tipo anomocítico (Figura 12). Nota-se uma evaginação da abertura estomática e a cera bastante desenvolvida.
  44. 44. 42 A B C FIGURA 12 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã não-variante (A) e variantes (B) e (C) todas in vitro. De acordo com Albert e Filho (2002), a cutícula foliar tem componentes hidrófobos (cera), semi-hidrófobos (cutina) e hidrófilos (pectinase e celulase). A cutícula em condições áridas funciona como uma membrana extracelular em toda a área foliar promovendo uma barreira entre a planta e o meio ambiente, agindo primariamente como uma barreira contra a evaporação excessiva (CAMERON, TEECE e SMART, 2006). Segundo Marcus, Moore e Cyr (2001), a ativação da bomba de prótons nas células guarda, acarreta o influxo de K+, atuando na abertura dos canais voltagem porta K+ e,
  45. 45. 43 conseqüentemente, na entrada de água via osmose. Estes mesmos autores demonstram algumas possibilidades envolvidas na abertura e fechamento do estômato e/ou a transdução de sinal para percepção da ativação da bomba de prótons, podendo estar relacionados com os microtúbulos. Simmonds (1949), verificou o efeito da poliploidia em famílias de “seedlings” produzidos por retrocruzamento de três híbridos diplóides, obtidos por cruzamentos de duas espécies diplóides. Alguns pentaplóides foram produzidos e apresentavam estômatos maiores e densidades menores que os triplóides. Por sua vez os triplóides possuíam estômatos um pouco maiores que os diplóides. Além da contagem do número de cromossomos, a análise dos estômatos mostrou ser uma boa medida do grau de poliploidia das plantas. Endoploidias produzem elevadas quantidades de DNA nuclear resultando em conseqüentes duplicações da replicação original, ou 2C, representando o nível de ploidia (MELARAGNO, MEHROTRA e COLEMAN, 1993). Estes mesmos autores encontraram em células epidérmicas pavimentosas de caule e folha de Arabidopsis thaliana, endoploidias como sendo comuns, mas não universais. Cerca de aproximadamente 29% (58 de 202 células) das células epidérmicas pavimentosas de caule e folha, tinham núcleo com 2C em nível de DNA, sendo os níveis de ploidia diferenciados em proporção aproximada de 2C, 25%; 4C, 28%; 8C, 37%; 16C, 10%, nestas mesmas células. Estudos com citometria de fluxo realizados por Guimarães (2005), apresentaram resultados mostrando que a quantidade de DNA é extremamente variável entre os indivíduos (variantes e não variantes somaclonais). O mesmo trabalho revelou que não houve um padrão de quantidade maior ou menor em um ou outro tipo de planta. A distribuição daquelas plantas com mais ou menos quantidade de DNA no núcleo foi totalmente aleatória, não sendo portanto, a citometria uma técnica eficiente para a distinção dos indivíduos da cultivar Prataanã que possuem a característica gigantismo como variante somaclonal. Para Gao et al. (2005), o total do volume vacuolar das células guardas também muda rapidamente durante o movimento estomático. A mudança do volume vacuolar tinha sido implicado em uma maior contribuição da mudança de volume da célula guarda. De acordo com Gao et al. (2005), mudanças no volume das células guarda são acompanhados por mudanças na membrana plasmática e na área de superfície do tonoplasto. Em algumas plantas, a membrana plasmática e a área de superfície do tonoplasto das células guarda podem estar aumentadas 1,5 vezes o original durante a abertura estomática (BLATT, 2002 apud GAO et al., 2005). Segundo Cameron, Teece e Smart (2006), as ceras cuticulares consistem de séries homólogas de longas cadeias de ácidos graxos, álcoois, aldeídos, alcanos, ésteres e compostos
  46. 46. 44 orgânicos cíclicos. Estes concordam com outros autores ao afirmar uma correlação indicando que o aumento da cera reduziria a condutância epidérmica de algumas plantas. Da mesma forma a diminuição da cera aumentaria a condutância. Vários autores também relacionam o aumento da cera com a idade da planta. Ao se comparar o incremento de cera entre as células epidérmicas de Eucalyptus regnans F. Muell, verificou-se oclusões da câmara estomática e aumento relacionado a idade e altura da árvore (ENGLAND e ATTIWILL, 2006) Tornam-se necessários, pois, estudos fisiológicos a cerca da real causa desta protuberância da abertura estomática, assim como a correlação do por que isso não ocorre com as bananeiras variantes in vivo. 4.5 Marcadores RAPD na diferenciação de Variantes Somaclonais No presente trabalho, procurou-se identificar variantes somaclonais de bananeiras ‘Prata-anã’ mediante o uso de marcadores RAPD. Foram testados 28 oligonucleotídeos, os quais estão relacionados na Tabela 4, com seus respectivos resultados. TABELA 4 Relação do número de produtos amplificados para cada oligonucleotídeo utilizado (Oligonucleotídeos Data Sheet, QIAGEN®). Oligonucleotídeo 5’ - 3’ Número de produtos amplificados OPH-13 GACGCCACAC 13 OPJ-04 CCGAACACGG 09 OPJ-10 AAGCCCGAGG 09 OPJ-13 CCACACTACC 06 OPP-05 CCCCGGTAAC 05 OPP-06 GTGGGCTGAC 06 OPP-08 ACATCGCCCA 09 OPP-09 CTGGTCCGCA 11 OPP-17 TGACCCGCCT 07 OPN-01 CTCACGTTGG 03 OPN-02 ACCAGGGGCA 06 OPN-03 GGTACTCCCC 06 OPN-05 ACTGAACGCC 06 Continua…
  47. 47. 45 Continuação... OPN-07 CAGCCCAGAG 07 OPN-13 AGCGTCACTC 04 OPN-17 CATTGGGGAG 06 OPN-19 GTCCGTACTG 05 OPN-20 GGTGCTCCGT 07 OPM-02 ACAACGCCTC 05 OPM-04 GGCGGTTGTC 08 OPM-05 GGGAACGTGT 10 OPM-07 CCGTGACTCA 08 OPM-12 GGGACGTTGG 07 OPM-13 GGTGGTCAAG 08 OPM-14 AGGGTCGTTC 02 OPM-19 CCTTCAGGCA 04 OPU-06 ACCTTTGCGG 06 OPU-08 GGCGAAGGTT 07 A maioria dos fragmentos amplificados não apresentaram polimorfismos que diferenciassem a ‘Prata-anã’ não variante (PA) de suas variantes somaclonais (PI, PII e PII). Curiosamente alguns primers se comportaram diferentemente entre as plantas in vitro e in vivo apesar de ambos serem oriundos da micropropagação. O primer OPJ-04 (5’-CCGAACACGG-3’), mencionado por Damasco et al. (1996), não apresentou bandas polimórficas para o material in vitro (Figura 13), porém conseguiu distinguir a PA in vivo das demais variantes também in vivo. O que nos remete que a característica relativa ao tamanho da planta, nanismo, apresentada por estes autores não se relaciona diretamente com o gigantismo ocorrente nas plantas variantes somaclonais de ‘Prata-anã’.
  48. 48. 46 PA PI PII PIII PA in vitro PI PII PIII C in vivo OPJ-04 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura 13: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1% (1g agarose + 1µL de brometo de etídeo + 100mL de TAE 1X), corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:20 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPJ-04, PA – Prata-anã não variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro), 5-8 (in vivo) e caneleta 9 controle negativo (H2O). O mesmo resultado ocorreu ao utilizarmos o primer OPM-13 (5’-GGTGGTCAAG3’), onde visualizamos perfeitamente a intensidade da banda polimórfica presente na PA in vivo e ausente nas demais variantes também in vivo (Figura 14). Observou-se também uma banda presente em todas plantas in vivo e ausente em todas plantas in vitro. PA PI PII in vitro 1 2 3 PIII PA PI OPM-13 4 PII PIII in vivo 5 6 7 8 Figura 14: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPM-13, PA – Prata-anã não variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo). A diferenciação entre as plantas in vitro e in vivo não era esperada para esta pesquisa, no entanto, assim como no resultado obtido com o primer OPM-13, testes com o primer OPH-
  49. 49. 47 13 (5’-GACGCCACAC-3’), apresentaram bandas polimórficas que diferenciassem também a procedência dessa cultivar em (Figura 15). PA PI PII PIII PA PI PII PIII OPH-13 in vitro 1 2 3 in vivo 4 5 6 7 8 Figura 15: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPH-13, PA – Prata-anã não variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo). O primer OPN-05 (5’-ACTGAACGCC-3’) apresentou um polimorfismo que diferiu o a ‘Prata-anã’ não variante das variantes in vitro (Figura 16). Este mesmo primer apresentou também polimorfismos que diferenciaram as plantas PA e PI de PII e PIII, todas in vitro, bem como a PIII in vitro das demais. PA PI PII PIII PA in vitro PI PII PIII in vivo OPN-05 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 16: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPN-05, PA – Prata-anã não
  50. 50. 48 variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo). Sendo que as condições de amostragem do material in vitro e in vivo ocorreram em dias diferentes, apresentamos os resultados aqui obtidos como possíveis localizadores de diferenças genotípicas. A sensibilidade da técnica por marcadores moleculares tipo RAPD demonstra uma possível mutação de bases (inserção, deleção, alteração) que pode estar acontecendo durante o processo de aclimatação das plantas. Este fato mostra-se coerente com os resultados de Guimarães (2005), que sugere que os variantes somaclonais, para características gigantismo, das bananeiras ‘Prata-anã’ não ocorrem de maneira uniforme no genoma. Guimarães (2005), utilizou 103 oligonucleotídeos na tentativa de diferenciar ‘Prataanã’ de ‘Prata’ (comum) e variantes somaclonais, e obteve com estes 188 bandas visualizadas sem nenhum polimorfismo encontrado. Este mesmo autor revela que o primer OPW-08 forneceu um padrão específico de uma ‘Prata-anã’variante diferente das demais e da não variante, discordando de Gomes (2002) apud Guimarães (2005), que sugeriu o primer OPW08 para distinguir as plantas ‘Prata’ daquelas ‘Prata-anã’. De acordo com Crouch, Vuylstake e Ortiz (1998), a análise RAPD apresenta muitas desvantagens incluindo a dominância natural do marcador sistêmico e problemas de reprodutividade. Os resultados encontrados com o primer OPJ-04 não puderam ser reproduzidos com respectiva fidelidade comprovando um problema com este marcador. Segundo Crouch et al. (2000), acessos de banana apesar de exibirem características morfológicas diferentes, apresentam estabilidade genética ao decorrer de seu genoma. Assumindo que a análise por RAPD é sensível a mudanças durante a amplificação em PCR (polimerase chain reaction). Entretanto, eles encontraram, em comum com vários autores, resultados confiáveis gerados por protocolos precisos e controle estrito para aprimoramento dos protocolos, replicando os ensaios ambíguos e interpretações em série dos resultados. Para Vidal e García (2000), o sucesso do uso de marcadores RAPD requerem conhecimento de fatores que influenciam na amplificação do DNA. Williams et al. (1993 apud VIDAL e GARCÍA, 2000), indicaram que o conteúdo de G + C no primer e o comprimento elevado destes influenciam nos produtos obtidos da amplificação pela análise RAPD. Ferreira et al. (2004), utilizando 21 primers aleatórios, obteve 150 fragmentos (não discriminados em polimórficos e monomórficos) ao utilizar a análise por RAPD em duas cultivares diplóides híbridas (0323-03 e 4279-06) resistentes a Sigatoka Amarela e Negra.
  51. 51. 49 Esta distinção ocorreu em estimativas de dissimilaridade genética proposta por estes autores e comprovou a pequena distância entre os mesmos. Kahangi, Lawton e Kumar (2002) diferenciaram 5 grupos genômicos AA, AB, AAA, AAB e ABB, através de 10 primers, por análise RAPD, afim de descobrir que grupo genômico prevalecia entre os cultivares kenianos. Onguso et al. (2004), analisou 20 cultivares de Musa usando 25 primers decameros, assumindo que quando a variação entre as cultivares é alta, o uso de poucos primers é suficiente, fato que justificou a utilização de 28 oligonucleotídeos neste trabalho, contudo, não impede que novos primers possam ser testados ou avaliados.
  52. 52. 50 5 CONCLUSÕES Os resultados do estudo do ciclo celular não revelaram quaisquer alterações significativas que pudessem comprometer a divisão celular dessas plantas. Porém, algumas células em divisão demonstraram cromossomos desprendidos da placa metafásica e anáfases em pontes. O tratamento com hidroxiuréia não apresentou quantidades suficientes de metáfases em comparação com o experimento de ciclo celular. O comportamento citogenético das bananeiras ‘Prata-anã’ in vitro, não diferenciaram quanto a materiais variantes e não variantes. O comprimento das placas metafásicas também não forneceu dados adequados para esta distinção. O diâmetro polar dos estômatos mostrou-se como um bom marcador morfológico diferenciando o material in vitro, porém o mesmo não foi observado com as amostras in vivo. A maior quantidade de cera presente nas plantas variantes tanto in vitro como in vivo, demonstram também a possibilidade de serem marcadores morfoanatômicos. Porém, tornamse necessários estudos fisiológicos que expliquem o processo de evaginação da abertura estomática observada nas plantas variantes in vitro. Os primers OPJ-04 e OPM-13 apresentaram bandas polimórficas que diferenciaram a planta não variante material in vivo. Por outro lado o primer OPN-05 diferiu todas as plantas variantes in vitro da não variante. Como observado, conclui-se que o material in vitro e in vivo podem ser diferenciados através de alguns marcadores RAPD, como os primers: OPM-13 e OPH-13.
  53. 53. 51 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBERT, L. H. B. FILHO, R. V. Características morfológicas da cutícula foliar e efeitos de adjuvantes no controle químico de três espécies de Guanxumas. Ciência e Agrotecnologia. Lavras, v. 26, n. 5, p. 888-899, set/out, 2002. ÁLVARES, M. C. CALDAS, L. S. Crescimento, produção e variação somaclonal em bananeiras micropropagadas. Pesq. Agrop. Bras. Brasília. v. 37, n. 3, p. 415-420, mar., 2002. BARBOSA, S., DAVIDE, L. C. e PEREIRA, A. V. Cytogenetics of Pennisetum purpureum Schumack x Pennisetum glaucum L. hybrids and their parents. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 27, p.23 - 26, 2003. BHAT, K. V. JARRET, R. L. Random amplified polymorphic DNA and genetic in India Musa germplasm. Genetic Resources and Croup Evolution. v. 42, p. 107-118, 1995. BOEGER, M. R. T. WISNIEWSKI, C. Comparação da morfologia foliar de espécies arbóreas de três estádios sucessionais distintos de floresta ombrófila densa (Floresta Atlântica) no sul do Brasil. Revista Brasileira de Botânica. São Paulo, v. 26, n. 1, p. 61-72, mar., 2003. CAMERON, K. D. TEECE, M. A. SMART, L. B. Increased accumulation of cuticular wax and expresión of lipid transfer protein in response to periodic drying events in leaves of tree tabaco. Plant Physiology. Rockville, v. 140, p. 176-183, jan. 2006. CARVALHO, D. A. Sistemática vegetal. Lavras: UFLA/FAEPE, 2001. 171 p. CROUCH, J. H. CROUCH, H. K. TENKOUANO, A. ORTIZ, R. VNTR-based diversity analysis of 2x end 4x full-sib Musa hybrids. Electronic Journal of Biotechnology. Valparaíso, v. 2, n. 3, p. 99-108, dec., 1999. CROUCH, H. K. CROUCH, J. H. MADSEN, S. VUYLSTEKE, D. ORTIZ, R. Comparative analysis of phenotypic and genotypic diversity among plantain landraces (Musa spp., AAB group). Theoretical and Applied Genetics. Berlin, v. 101, p. 1056-1065, 2000.
  54. 54. 52 CROUCH, J. H. VUYLSTEKE, D. ORTIZ, R. Perspectives on the application of biotechnology to assist the genetic enhancement of plantain and banana (Musa spp.) Electronic Journal of Biotechnology. Valparaíso, v. 1, n. 1, p. 11-22, apr., 1998. CUCO, S. M. MONDIN, M. VIEIRA, M. L. C. AGUIAR-PERECIN, M. L. R. Técnicas para obtenção de preparações citológicas com alta freqüência de metáfases mitóticas em plantas: Passiflora (Passifloraceae) e Crotalaria (Leguminosae). Acta Botanica Brasilica. São Paulo, v. 17, n.3, p. 363-370, 2003. DANTAS, J. L. L. SHEPHERD, K. SILVA, S. O. FILHO, W. S. S. Classificação botânica, origem, evolução e distribuição geográfica. In: ALVES, E. J (Org.). A cultura da banana: aspectos técnicos, socioeconômicos e agroindustriais. 2a Ed. Rev. Brasília: EMBRAPACNPMF, 1999a. cap. 6, p. 107-150. DANTAS, J. L. L. SHEPHERD, K. SILVA, S. O. SOUZA, A. S. ALVES, E. J. CORDEIRO, Z. J. M. FILHO, W. S. S. Citogenética e melhoramento genético. In: ALVES, E. J (Org.). A cultura da banana: aspectos técnicos, socioeconômicos e agroindustriais. 2a Ed. Rev. Brasília: EMBRAPA-CNPMF, 1999b. cap. 6, p. 107-150. DAMASCO, O. P. GODWIN, I. D. HENRY, R. J. ADKINS, S. W. SMITH, M. K. RAPD detection and characterization of a DNA polymorphism associated with dwarf banana somaclonal variants. In: International plant genome II conference. Town & Country Conference Center, San Diego, CA, jan., 1994. Disponível em: <http://www.intlpag.org/2/abstracts/100pg2.html> Acesso em: mai de 2005. DAMASCO, O. P. GRAHAM, G. C. HENRY, R. J. ADKINS, S. W. SMITH, M. K. GODWIN, I. D. Random amplified polimorphic DNA (RAPD) detection of dwarf off-types in micropropagated Cavendish (Musa spp. AAA) bananas. Plant Cell Reports. Berlin, v.16, p. 118-123, 1996. DE LANGHE, E. Banana and plantain: the earliest fruit cops? In: International Network for the improvement of banana and plantain – INIBAP, Annual Report, 1995. p. 6-8. Disponível em: <http://www.inibap.org/pdf/IN960170_en.pdf> Acesso em: jan de 2006.
  55. 55. 53 DREW, R. A. SMITH, M. K. Field evaluation of tissue-cultured bananas in South-Eastern Queensland. Australian Journal of Experimental Agriculture. Collingwood, v. 30, n.4, p. 596-574, 1990. DOLEZELOVÁ, M. VALÁRIK, M. SWENNEN, R. HORRY, J. P. DOLEZEL, J. Physical mapping of the 18S-25S and 5S ribosomal RNA genes in diploid bananas. Biologia Plantarum. Copenhagen, v. 41, n. 4, p. 497-505, 1998. ENGLAND, J. R. ATTIWILL, P. M. Changes in leaf morphology and anatomy with tree age and height in the broadleaved evergreen species, Eucalyptus regnans F. Muell. Trees – Structure and Function. Berlin, v. 20, p. 79-90, jan, 2006. FARIA, L. L. ALVARENGA, A. A. CASTRO, E. M. SOBRINHO, J. C. S. Alguns aspectos morfofisiológicos do feijão Jacatupé [Pachyrrhizus tuberosus (Lam.) Spreng]. Ciência e Agrotecnologia. Lavras, v. 24, n. 3, p. 688-695, jul/set, 2000. FAO. Disponível em: <www.http://www.fao.org/waicent/portal/statitics_en.asp> Acesso em jan de 2006. FERREIRA, C. F. SILVA, S. O. SORBINHO, N. P. D. DAMASCENA, S. ALVES, F. S. A. A. O. PAZ, O. P. Molecular characterization of banana (AA) diploids with contrasting levels of black and yellow sigatoka resistence. American Journal of Applied Sciences. New York, v. 1, n. 4, p. 276-278, 2004. FERREIRA, M. E. GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3a ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1998. 220 p. FERRIS, R. TAYLOR, G. Stomatal characteristics of four nativa herbes following exposure to elevated CO2. Annals of Botany. London, v. 73, p. 447-453, 1994. FORD-LLOYD, B. V. HOWELL, E. NEWBURY, H. J. An evaluation of random amplification polymorphic DNA (RAPD) is a tool for detection genetic stability in Musa germplasm stored in vitro. In: International symposium breeding in plantain resistance to diseases and pests. Proceedings, Montpellier: INIBAP,1992.

×