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A qualidade das sementes é um conjunto de                                       características complexasPotencial de Germ...
Gaspar-Oliveira et al (2010)
A qualidade da sementes é umconjunto de características complexase poligências.Abordagem integradaParâmetros fisiológicos ...
Como podemos encontrar o(s) gene(s) relacionado(s) auma determinada característica?   Cromossomo   metafásico             ...
“Conceito é melhor que definição, pois esta necessita ser absoluta”            João Nakagawa (2012)
O conceito de gene Um gene é visto como uma unidade física do cromossomo, relacionada a uma função específica, como a sínt...
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Um comportamento normal exibe um padrão de expressãodiferente de um controle.O uso de microarrays permite conhecer que gen...
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Fundamentos:O princípio da técnica de microarray se baseia na habilidade damolécula de mRNA se ligar, ou hibridizar, ao DN...
Moléculas de mRNA são utilizadas comomoldes para a sintese de cDNA marcadascom rótulos fluorescentes verdes Cy3(Cianina 3)...
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Fig. 1 Sensibilidade de germinação de sementes de Lactuca sativa cv. Salinas(Sal, círculos) e L. serriola UC96US23 (UC, tr...
Fig. 2 Respostas de temperaturade germinação do controle (a)e osmocondicionadas (b) as sementes de 89linhagens recombinant...
LsNECD4 codifica paraNINE-CIS_EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 4uma enzima chave na síntese de ABALsGA3ox1 codifica paraGA 3-ß-...
Confirmação do QTL porfenotipagem de uma nova linhagemisogênica com o alelo Htg6.1 a partir   de ambas variedades Salinas ...
Salinas                                  UC96US23Um QTL (Ht6.1) de efeito do priming mensurado a 35º C em 43cM colocado   ...
Inibição em alta temperatura          Priming ou Htg6.1 alelo UCLsNCED4                                  LsGA3ox1         ...
Contato:guilhermebiologia@yahoo.com.brPós-doutorando do Programa de Pós-graduaçãoBolsista do Programa Nacional de Pós-dout...
Análise de QTLs associados com a qualidade de sementes   revisto
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Seminário baseado na palestra do Prof. Henk assistida no Curso Internacional de Sementes da UNESP - Botucatu SP e Abril de 2012.

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  • QTL mapping is a multi step procedure that involves field and lab work as well as an elaborate statistical analysis. In general, two homozygous lines that differ significantly for the trait under study are crossed. The F1 hybrid is selfed to produce a segregating F2 populations. F2 individuals will be genotyped using molecular markers. F2 will be selfed to produce F2:3 lines.  enough seed for repeated field trials. QTL mapping idea (Lynch and Walsh) By crossing two lines, linkage disequilibrium is created between loci that differ between the parental lines. This is creating associations between marker loci and linked segregating QTL. Experimental designs F2:3  in contrast to all other populations here three marker classes can be observed, therefore, dominance can be evaluated. AIL  advanced intercross lines, Random mated populations, higher resolution, but decreased power of QTL detection. RIL  homozygous genetic background, field trials can be repeated in multiple locations and years. DHL BC Marker information and phenotypic data is combined and statistical tools are used to map and characterize QTL.
  • QTL mapping is a multi step procedure that involves field and lab work as well as an elaborate statistical analysis. In general, two homozygous lines that differ significantly for the trait under study are crossed. The F1 hybrid is selfed to produce a segregating F2 populations. F2 individuals will be genotyped using molecular markers. F2 will be selfed to produce F2:3 lines.  enough seed for repeated field trials. QTL mapping idea (Lynch and Walsh) By crossing two lines, linkage disequilibrium is created between loci that differ between the parental lines. This is creating associations between marker loci and linked segregating QTL. Experimental designs F2:3  in contrast to all other populations here three marker classes can be observed, therefore, dominance can be evaluated. AIL  advanced intercross lines, Random mated populations, higher resolution, but decreased power of QTL detection. RIL  homozygous genetic background, field trials can be repeated in multiple locations and years. DHL BC Marker information and phenotypic data is combined and statistical tools are used to map and characterize QTL.
  • Fig. 3 Mapeamento de altíssima resolução de QTLs no cromossomo 6 associado com o aumento da máxima temperatura de germinação devido ao condicionamento quando testado a 35 ºC utilizando uma população RIL derivado de L. sativa cv. Salinas e L. serriola UC96US23. O Lod (log de ​​probabilidades) pontuações no gráfico superior são significativos acima de um valor de 3,2 (linha horizontal). A parte inferior do gráfico indica que o parental contribuiu com o traço, com valores positivos indicando Salinas e negativos que indicam UC96US23 . O intervalo de confiança de QTL abrange a região cromossômica de 33 a 56 cM. O pico máximo QTL exibe uma 9,8 LOD posicionado no 43 cM, com coinstalação LsNCED4 em 43,5 cM.
  • Análise de QTLs associados com a qualidade de sementes revisto

    1. 1. Baseado em: 27/04/2012 – Quinta–feiraAnálise de QTL associados com a qualidade de sementesProf. Dr. Henk W. W. Hilhorst Análise de QTL associados com a qualidade de sementes Uma abordagem rápida sobre o que foi apresentado no curso e sua relação com os trabalhos desenvolvidos no LBBB Apresentado por: Dr. Guilherme Araújo LacerdaSalvador – BA, 18 de maio de 2012
    2. 2. A qualidade das sementes é um conjunto de características complexasPotencial de Germinação Morfologia da plântulaGerminação sob condições normais Plântulas normaisGerminação sob estresse osmótico Tamanho da parte aéreaGerminação sob estresse salino Tamanho da raízGerminação sob estresse térmico Tamanho do hipocótiloGerminação sob estresse oxidativo Raio de crescimento radicularDormência (pós-maturação vs. sementes frescas) Arquitetura da raíz Plantas utilizáveisLogenvidade da sementeGerminação após deteriorização controlada Plântulas de mamoneiraGerminação após o envelhecimentoReserva nutricionalTamanho e massa da sementeArquitetura do embrião Gaspar-Oliveira et al (2010)
    3. 3. Gaspar-Oliveira et al (2010)
    4. 4. A qualidade da sementes é umconjunto de características complexase poligências.Abordagem integradaParâmetros fisiológicos (fenotipagem) Lactuca sativa L. – arquivo pessoalHerança genética e interação entre lociExpressão genética (transcriptômicas)Metabólitos e perfil hormonal (metabolômica) Plântulas de mamoneiraEstudos usando sementes deArabidopsis, Tomate e Alface http://indocorporation.en.nobodybuy.com/pid75360 7/premium-jatropha-curcas-seeds-10-tons-av.htm
    5. 5. Como podemos encontrar o(s) gene(s) relacionado(s) auma determinada característica? Cromossomo metafásico Armação condensada – Fibras de cromatina associada cromatina são compactadas em nucleossomosIntérfase:Armação “Contas deextendida – um colar”cromatina Armação do formam aassociada cromossomo cromatina Região curta do DNA dupla hélice
    6. 6. “Conceito é melhor que definição, pois esta necessita ser absoluta” João Nakagawa (2012)
    7. 7. O conceito de gene Um gene é visto como uma unidade física do cromossomo, relacionada a uma função específica, como a síntese de uma proteína.
    8. 8. “We’ve come to the realization that the genome is full of overlapping transcripts.” — Phillip Kapranov“Nós chegamos à conclusão de que o genoma está cheio detranscritos sobrepostos.” — Phillip Kapranov
    9. 9. Números cromossômicos importantes:• As análises dos genótipos cultivados e silvestres de mamoneira Mirante e IAC-80 revelaram metáfases com 20 cromossomos (2n=20), todos metacêntricos (Barbosa et al. 2010).• A espécie Jatropha curcas é uma espécie diplóide com 2n=22 cromossomos (NUNES, 2007).
    10. 10. O conceito de QTL (quantitative trait locus)Versão - locus de característica quantitativaA análise por QTL revela em qual cromossomo se encontra o gene e o nível de expressão relativa deste com sua interação com outros genes. Adaptado de Hilhorst (2012)
    11. 11. Conceito de Análise de QTLsÉ um método estatístico que conecta doistipos de informação – dados fenotípicos(caracteres mensuráveis) e dadosgenotípicos (usualmente marcadoresmoleculares). Miles e Wayne (2008)
    12. 12. MAPEAMENTO DE QTLs População Parentais A B × F1 ⊗ F2 ⊗ F2:3Campo RC1, RIL , DHL
    13. 13. Dos QTLs para o genesO mapa de QTL representa uma centana de genes.Então, como encontrar um único gene responsável porcerta característica?Abordagem clássica:Comfimação QTLs por novas linhagens isogênicas + subsequentemapeamento refinado;Novas Linhagens Isogênicas (NILs);Famílias endogâmicas heterogêneas (HIFs);Etc. ISSO PODE LEVAR ANOS!
    14. 14. Figura 1. Desenvolvimento de linhagem F6 de mamonaporte baixo com baixa concentração de toxinas. Auld et al (2001)
    15. 15. NOVA ABORDAGEM Conectando a variação genômica com o fenótipo e performance PERFISVARIAÇÃO GENÉTICA Transcritos Performance dos SNPs deletados, Proteínas FENÓTIPOSoutros marcadores Metabólitos Interações
    16. 16. MAPEAMENTO DE QTLs População Laboratório Marcadores Fenótipo # 1 2 3 4 5 .. M PHT[cM] Parentais A B 1 B B H H A .. A 210 2 H A H A A .. H 190 3 B B H H H .. A 203 × 4 H H B B B .. H 159 5 H B H H A .. B 206 . . . . . . . . . . . . . . . . . . F1 N A H H H A .. A 171 ⊗ Análises F2 LOD score ⊗ PHT F2:3Campo RC1, RIL, DHL Cromossoma 1
    17. 17. Como a análise de QTL é conduzida?A análise de QTL requer 2 ítens:(3)Necessita-se de 2 ou mais variedades deorganismos com diferenças genéticasconsiderando-se a característica de interesse;(5)Requere-se marcadores genéticos quedistinguem as linhagens parentais. Miles e Wayne (2008)
    18. 18. Um comportamento normal exibe um padrão de expressãodiferente de um controle.O uso de microarrays permite conhecer que genes são usados (ecom que intensidade) em uma infinidade de situações.A análise da expressão de genes pode fornecer informaçõesimportantes sobre as funções da célula.
    19. 19. Microarray - compara expressão de genesArranjos (arrays), que contêm um grande número de genesdistribuídos de forma ordenada sobre placas de vidro. www.microarrays.med.uu.nl/pix/spotter1.jpg
    20. 20. Fundamentos:O princípio da técnica de microarray se baseia na habilidade damolécula de mRNA se ligar, ou hibridizar, ao DNA molde do qualfoi originado. http://www.imtek.de/anwendungen/content/workinggr oups/topspotmikroarrayer/Microarray_Illustration_Kop plung.gif
    21. 21. Moléculas de mRNA são utilizadas comomoldes para a sintese de cDNA marcadascom rótulos fluorescentes verdes Cy3(Cianina 3).Da mesma forma, as moléculas de mRNAda célula controle são separadas etranscritas, marcadas com tótulosvermelhos Cy5 (cianina 5).
    22. 22. Análise de expressão gênica usando microarray. Clones DNA Teste Referência excitação Laser 1 Laser 2 Transcrição Reversa Sondas com emissão fluoroforosPurificação eamplificação porPCRImpressãorobótica Análise Alvos hibridizados computacional para o microarranjo Duggan et al., 1999
    23. 23. Fig. 1 Sensibilidade de germinação de sementes de Lactuca sativa cv. Salinas(Sal, círculos) e L. serriola UC96US23 (UC, triângulos) à temperaturae priming (não tratados, símbolos fechados; condicionadas, símbolos abertos).Sementes (25 em cada uma das duas repetições) foram embebidas em placas de Petriem cada temperatura e a emergência radícula foi observada 72 h após plantio.
    24. 24. Fig. 2 Respostas de temperaturade germinação do controle (a)e osmocondicionadas (b) as sementes de 89linhagens recombinantes (RILs)em 27-35 ºC. Duas réplicas de25 sementes foram testadas acada temperatura sobre uma mesagradiente,a emergência da radículafoi observada 48 h após o plantio.Em ambos os painéis, RILs são classificados afim de aumentar seupercentual de germinação dassementes ativadas no máximode temperatura à qual agerminação ocorreu.
    25. 25. LsNECD4 codifica paraNINE-CIS_EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 4uma enzima chave na síntese de ABALsGA3ox1 codifica paraGA 3-ß-HYDROXYLASEregula a síntese de GA pela luz em alfaceLsACS1 codifica para1-aminocyclopropane carboxylate (ACC)uma enzima catalítica na biossintese de etileno
    26. 26. Confirmação do QTL porfenotipagem de uma nova linhagemisogênica com o alelo Htg6.1 a partir de ambas variedades Salinas e UC96US23
    27. 27. Salinas UC96US23Um QTL (Ht6.1) de efeito do priming mensurado a 35º C em 43cM colocado com LsNCED4 a 43.5 cM Confirmado futuramente em mapa refinado (intevalo de < 1 cM)
    28. 28. Inibição em alta temperatura Priming ou Htg6.1 alelo UCLsNCED4 LsGA3ox1 Luz LsACS1 GA ABA etileno Germinação Schwember e Bradford (2010)
    29. 29. Contato:guilhermebiologia@yahoo.com.brPós-doutorando do Programa de Pós-graduaçãoBolsista do Programa Nacional de Pós-doutorado (PNPD)

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