GEN TRỊ LIỆU

2
LêI NãI §ÇU
Sau sù kiÖn träng ®¹i - th¸ng 6 n¨m 2000 khi tr×nh tù ph¸c th¶o bé gen ngêi ®· ®îc c«ng bè
, tÊt c¶ mäi ngêi trªn hµnh tinh ®Òu chê ®îi mét ngµy nµo ®ã con ngêi cã thÓ trÞ ®îc çc
bÖnh nan y vµ ngµy ®ã ®· ®Õn . HiÖn nay ngßi ta cã thÓ chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ ®îc çc bÖnh
b»ng c«ng nghÖ DNA . Sù xuÊt hiÖn cña ®Çu dß DNA cïng víi PCR ®· gi¶i quyÕt ®îc nhiÒu
vÊn ®Ò bøc thiÕt cña Y häc , ch¼ng h¹n nh thay v× ph¶i chê ®îi hµng tuÇn lÔ ®Ó cã mét xÐt
nghiÖm vÒ vi khuÈn lao th× nay c«ng viÖc ®ã chØ mÊt vµi giê thËm chÝ cã thÓ sím h¬n n÷a .
§iÒu nµy gióp Ých cho çc bÖnh nh©n ®îc ®iÒu trÞ sím h¬n vµ tr¸nh ®îc sù l©y lan trong
céng ®ång . Víi ph¬ng ph¸p ch÷a bÖnh b»ng gen hay gäi v¾n t¾t lµ gen trÞ liÖu ®· ch÷a
®îc nhiÒu bÖnh di truyÒn nh bÖnh x¬ nang , bÖnh ®au c¬ Duchenne , bÖnh
Huntington , Héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X , U nguyªn bµo vâng m¹c , bÖnh
Alzheimer , bÖnh x¬ cøng teo c¬ cét bªn , bÖnh tiÓu ®êng , bÖnh ung th v.v..
Trong t¬ng lai çc bÖnh nh Cholesterol cao cã tÝnh chÊt gia ®×nh, çc bÖnh vÒ gan
, bÖnh Lesh- Nyhan , bÖnh Gaucher vµ bÖnh a ch¶y m¸u còng sÏ ®îc xö lý b»ng
gen trÞ liÖu .
Míi ®©y nhãm nghiªn cøu t¹i Trêng §¹i häc California , Los Angles ®· sö dông liposom
®îc bao bëi polyethylen glycol (PEG) ®Ó ®a vµo tËn çc tÕ bµo n·o . ViÖc chuyÓn gen vµo
n·o lµ mét thµnh c«ng rÊt cã ý nghÜa , nã t¹o tiÒm n¨ng cho viÖc trÞ çc bÖnh Parkinson
(New Scientist . Com-March 20, 2003)
§iÒu mµ mäi ngêi ®ang chê ®îi nhÊt cã lÏ lµ çc bÖnh ung th vµ c¨n bÖnh thÕ kû HIV-
AIDS . Cho tíi th¬× ®iÓm nµy nhiÒu bÖnh ung th ®· ®îc trÞ b»ng gen trÞ liÖu vµ ®· ®em l¹i
nh÷ng kÕt qu¶ kh¶ quan . Víi bÖnh AIDS , ngêi ta còng thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ rÊt khÝch lÖ .
Ch¼ng nh÷ng thÕ çc thÕ hÖ vac xin AIDS ®ang ®îc thö nghiÖm , ch¾c chóng ta ai còng chê
®îi çi gi©y phót mµ vac xin AIDS sÏ thµnh c«ng nh çc lo¹i vac xin Viªm gan B , vac
xin Cóm hay mét lo¹i vac xin hiÖn ®¹i nµo ®ã ®ang ®îc lu hµnh .
Cuèn s¸ch nµy dµnh cho çc b¸c sÜ l©m sµng , nh÷ng ngêi ®ang ngµy ®ªm theo dâi çc c¨n
bÖnh ë tõng bÖnh nh©n , lóc nµo hä còng chê ®îi mét ph¬ng ph¸p h÷u hiÖu nhÊt ®Ó cøu sèng
ngêi bÖnh . Tuy vËy , s¸ch còng gióp Ých cho tÊt c¶ nh÷ng ai quan t©m tíi Gen trÞ liÖu
mét ph¬ng phÊp ch÷a bÖnh míi hiÖn ®ai vµ ®Çy tiÒm n¨ng . S¸ch còng giíi thiÖu
çc dîc phÈm ®îc bµo chÕ theo kiÓu C«ng nghÖ DNA . Ph©n tö Antisene lµ mét chÕ
phÈm thuèc hoµn toµn míi chøa ®ùng nhiÒu tiÒm n¨ng ®¸ng ®îc quan t©m . §©y kh«ng chØ
®¬n thuÇn lµ vÊn ®Ò khoa häc mµ cßn lµ mét lÜnh vùc kinh tÕ hÊp dÉn mµ çc nhµ ho¹ch ®Þnh
chÝnh s¸ch cÇn quan t©m v× lîi nhuËn thu ®îc tõ c«ng nghÖ gen lµ khæng lå .
S¸ch còng ®Ò cËp tíi viÖc lµm trong s¹ch m«i trêng , ph¸ vì chu kú dÞch bÖnh cña çc c«n
trïng vµ çc t¸c nh©n g©y bÖnh nguy hiÓm kh¸c v.v..
PhÇn cuèi cña cuèn s¸ch chóng t«i cã ®Ò cËp tíi mét sè lÜnh vùc míi trong c«ng nghÖ DNA
nh Tin -Sinh häc . Sù xuÊt hiÖn cña tin sinh häc lµm chóng ta an t©m r»ng , mÆc dï ta cßn
nghÌo , trang thiÕt bÞ thiÕu thèn , nhng chóng ta vÉn cã thÓ b¾t tay ngay vµo lÜnh vùc gen trÞ
liÖu ®Ó ch÷a trÞ bÖnh cho çc bÖnh nh©n . §iÒu ®ã thËt dÔ hiÓu , v× thêi ®¹i ngµy nay tÊt c¶
mäi c«ng viÖc ®Òu mang tÝnh chÊt toµn cÇu , c«ng nghÖ DNA nãi chung hay Gen trÞ liÖu nãi
riªng còng kh«ng ngoµi quy luËt Êy .
Víi lßng mong mái chuyÓn t¶i çc th«ng tin cËp nhËt nhÊt trong lÜnh vùc gen trÞ liÖu tíi tÊt c¶
çc b¹n ®äc , mÆc dï ®· cè g¾ng rÊt nhiÒu nhng ch¾c ch¾n kh«ng tr¸nh khái çc thiÕu sãt ,
mong b¹n ®äc lîng thø .
Nh©n ®©y , chóng t«i xin chan thµnh çm ¬n Gi¸o s §µo §×nh §øc , nguyªn Phã ViÖn
Trëng ViÖn Y häc l©m sµng nhiÖt ®íi ®· ®äc b¶n th¶o vµ ®ãng gãp nhiÒu ý kiÕn bæ Ých ®Ó hoµn
thiÖn cuèn s¸ch . Chóng t«i còng ch©n thµnh çm ¬n Nhµ xuÊt b¶n Y häc ®· t¹o mäi ®iÒu
kiÖn thuËn lîi ®Ó cuèn s¸ch sím tíi tay ®äc gi¶ .
T¸c gi¶ xin ch©n thµnh çm ¬n nh÷ng ý kiÕn ®ãng gãp x©y dùng ®Ó cuèn s¸ch ngµy cµng ®îc
hoµn chØnh h¬n . Hµ néi th¸ng 7 n¨m 2005.
T¸c gi¶

3
Môc lôc
Lêi nãi ®Çu
Môc lôc
Ch¬ng I : Nh÷ng kh¸i niÖm c¬ b¶n vÒ gen trÞ liÖu
1.1.S¬ lîc vÒ gen trÞ liÖu
1.2.Kh¸i niÖm vÒ phÐp ch÷a bÖnh b»ng gen
1.3.C¬ chÕ cña gen trÞ liÖu
1.4.Çc lo¹i gen trÞ liÖu
1.5. Nh÷ng bÖnh cã thÓ sö dông ®îc gen trÞ liÖu
1.5.1.§iÒu trÞ çc bÖnh di truyÒn
1.5.1.1.Çc bÖnh di truyÒn g©y nªn bëi çc locut gen ®¬n
1.5.1.2.Çc bÖnh do rèi lo¹n di truyÒn çc locut ®a gen
1.5.2. §iÒu trÞ çc bÖnh do nhiÔm trïng
Ch¬ng II : Nguyªn lý c¬ b¶n cña gen trÞ liÖu
2.1.Nguyªn lý cña gen trÞ liÖu
2.1.1.Çc tÕ bµo chñ
2.1.1.1.NhiÔm s¾c thÓ cña vi khuÈn
2.1.1.2.Virut
2.1.2.Çc Enzym giíi h¹n
2.1.3. Ligaza
2.1.4.Plasmid
2.2. Çc thÝ nghiÖm vÒ DNA t¸i tæ hîp
2.3. Nh÷ng bµn c·i vÒ tÝnh an toµn trong gen trÞ liÖu
2.4. T¬ng lai cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp
2.5. Nh÷ng tiÕn bé ®¸ng kÓ trong GTL hiÖn nay
Ch¬ng III : çc ph¬ng ph¸p cña c«ng nghÖ DNA
3.1. Thu thËp gen
3.2. Sù lùa chän çc Vec t¬
3.3. Sù lùa chän çc tÕ bµo chñ
3.4. Sù biÓu hiÖn cña gen
3.5. TËp hîp çc s¶n phÈm cña gen
3.6. Th viÖn gen
3.6.1.ThiÕt lËp mét th viÖn gen
3.6.2.Sµng läc th viÖn gen
3.6.3. Th viÖn cDNA
Ch¬ng IV : Ph©n tÝch vµ chÈn ®o¸n b»ng DNA
4.1. Më ®Çu
4.2. Ph¬ng ph¸p ph©n tÝch DNA
4.2.1. §Çu dß DNA
4.2.2.Ph¶n øng tæng hîp chuçi (PCR)
4.2.3. KhuÕch ®¹i tÝn hiÖu
4.2.4. Ph©n tÝch RFLP
4.3. ChÈn ®o¸n çc bÖnh truyÒn nhiÔm
4.3.1. ChÈn ®o¸n Héi chøng thiÕu hôt miÔn dÞch m¾c ph¶i
4.3.2. ChÈn ®o¸n bÖnh Lao
4.3.3. ChÈn ®o¸n bÖnh Lyme
4.3.4. ChÈn ®o¸n bÖnh u nhó vµ çc bÖnh kh¸c
4.4. Ph¸t hiÖn çc bÖnh do di truyÒn
4.4.1. BÖnh x¬ nang
4.4.2.BÖnh ®au c¬ Duchenne
4.4.3.BÖnh Huntington
4.4.4. Héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X
4.4.5. U nguyªn bµo vâng m¹c
4.4.6. BÖnh Alzheimer
4.4.7. BÖnh s¬ cøng teo c¬ cét bªn
4.4.8. BÖnh tiÓu ®êng
4.4.9. BÖnh ung th
4.4.10. Ng©n hµng gen
4.5. øng dông gen trÞ liÖu trong l©m sµng
4.5.1. §iÒu trÞ bÖnh thiÕu hôt miÔn dich tæ hîp trÇm träng (SCID)

4
4.5.2. Gen trÞ liÖu trong chèng ung th
4.5.3. Nh÷ng nç lùc hiÖn t¹i vµ t¬ng lai
4.5.3.1.Thay thÕ gen khiÕm khuyÕt trong bÖnh x¬ nang
4.5.3.2. BÖnh Cholesterol cao cã tÝnh chÊt gia ®×nh
4.5.3.3. GTL víi çc tÕ bµo gan
4.5.3.4. GTL trong Héi chøng thiÕu hôt miÔn dÞch m¾c ph¶i
4.5.3.6. BÖnh Lesh-Nyhan
4.5.3.7. BÖnh Gaucher vµ bÖnh a ch¶y m¸u
4.6. B¶o hiÓm an toµn trong gen tril liÖu
Ch¬ng V : Çc Dîc phÈm chÕ t¹o theo c«ng nghÖ DNA
5.1. më ®Çu
5.2.Thay thÕ çc protein ngêi
5.2.1. Insulin
5.2.2. Hormon sinh trëng cña ngêi
5.2.3. YÕu tè VIII
5.3. TrÞ liÖu trªn ngêi
5.3.1. ChÊt ho¹t ho¸ Plasminogen cña m«
5.3.2. Interferon
5.3.3. Çc ph©n tö Antisene
5.4.Vac xin
5.4.1. Vac xin viªm gan B
5.4.2. Vac xin AIDS
5.4.3. Çc lo¹i vac xin kh¸c
5.5. §éng vËt chuyÓn gen vµ nh÷ng øng dông thùc tiÔn cña §VCG
5.5.1. Nh÷ng kh¸i niÖm vÒ ®éng vËt chuyÓn gen vµ nh÷ng øng dông cña chóng
5.5.2. §a DNA vµo çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó
5.5.3. T¹o çc ®éng vËt theo ý muèn
5.5.3.1. Chuét mang hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi
5.5.3.2. Chuét mang ung th
5.5.3.3. Çc ®éng vËt chuyÓn gen kh¸c
5.5.3.4. Çc chÊt ph¶n øng sinh häc tõ ®éng vËt
5.5.3.5. Hemoglobin ngêi tõ lîn
5.5.3.6. Çc s¶n phÈm kh¸c cña ®éng vËt chuyÓn gen
5.5.4.çc chÊt thay thÕ m«i trêng
Ch¬ng VI : Dù ¸n bé gen ngêi
6.1 ý nghÜa Y sinh häc
6.2. Dù ¸n bé gen ngêi cã nhiÒu môc ®Ých
6.3.Tr×nh tù ph¸c th¶o cña bé gen ngêi ®· ®îc th«ng b¸o th¸ng 6 n¨m 2000.
6.4.Hai nhãm sö dông çc ph¬ng ph¸p kh¸c nhau
6.5. ViÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù bé gen ngêi ®· ®em l¹i Ých lîi cho çc ph¸t hiÖn míi
6.6. HÇu hÕt bé gen ngêi ®· ®îc x¸c ®Þnh tr×nh tù
6.7. §· x¸c ®Þnh ®îc r»ng bé gen ngêi m· cho kho¶ng 30.000-40.000 protein
6.8. ChØ cã 1,1% ®Õn 1,5% bé gen ngêi dïng ®Ó m· cho protein
6.9. CÊu tróc cña çc nhiÔm s¾c thÓ ngêi thay ®æi rÊt lín
6.10. Çc gen cña ngêi ho¹t ®éng nhiÒu h¬n çc gen cña çc tæ chøc ®¬n gi¶n h¬n .
6.11. HÖ protein ngêi phøc t¹p h¬n ®éng vËt cã x¬ng sèng
6.12. Çc tr×nh tù lÆp chiÕm trªn 50% bé gen ngêi
6.13. Nh÷ng ph¸t hiÖn kh¸c ®¸ng quan t©m
6.14 .LËp kÕ ho¹ch cho nh÷ng c«ng viÖc tiÕp theo vÒ bé gen ngêi vµ çc tæ chøc kh¸c
6.15 Nh÷ng liªn quan tíi hÖ protein , c«ng nghÖ sinh häc vµ tin sinh häc
6.16. Nh÷ng liªn quan tíi Y häc
Gi¶i thÝch mét sè tõ chuyªn m«n
Phô lôc
Tin-Sinh häc : Kh¸i niÖm vµ øng dông
MÉu dß Axit Nucleic
Nh÷ng s¸ch tham kh¶o chÝnh

5
Ch¬ng I
Nh÷ng kh¸i niÖm c¬ b¶n vÒ Gen trÞ liÖu
(ph¬ng ph¸p ch÷a bÖnh b»ng gen) .
1.1.Lù¬c sö vÒ gen trÞ liÖu:
Çi mèc lÞch sö lµ ngµy 14 th¸ng 9 n¨m 1990 khi çc nhµ khoa häc viÖn søc khoÎ quèc gia
Hoa kú tr×nh bµy ph¬ng ph¸p gen trÞ liÖu (GTL) trªn mét c« bÐ 4 tuæi tªn lµ Ashanti Desiva
.Khi míi sinh ra em ®· m¾c mét bÖnh di truyÒn hiÕm gÆp - bÖnh thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp
trÇm träng (severe combined immune deficiency –SCID) ,v× em bÞ tæn th¬ng hÖ miÔn dÞch
ngay tõ ph«i thai . TrÎ em m¾c chøng bÖnh nµy thêng ph¸t triÓn rÇm ré çc bÖnh nhiÔm trïng
vµ hiÕm khi tån t¹i tíi tuæi trëng thµnh . Mét bÖnh th«ng thêng nh bÖnh thuû ®Ëu còng cã
thÓ ®e do¹ tÝnh m¹ng , v× thÕ Ashanti ph¶i giam m×nh trong mét phßng kÝn , tr¸nh tiÕp sóc víi
mäi ngêi trõ nh÷ng ngêi trong gia ®×nh . Em ®îc gi÷ trong m«i Trêng v« trïng vµ ph¶i
dïng mét lîng lín kh¸ng sinh ®Ó chèng träi l¹i çc bÖnh th«ng thêng .
H×nh 1.1. .¶nh 2 bÖnh nh©n ®Çu tiªn ®îc ®iÒu trÞ bÖnh b»ng gen . C« g¸i phÝa bªn tr¸i lµ
Cynthia cßn phÝa bªn ph¶i lµ Ashanti. C¶ hai c« g¸i nµy ®Òu cã cuéc sèng b×nh thêng do ®·
nhËn ®îc çc tÕ bµo biÕn ®æi gen ®Ó ®Èy lui bÖnh do thiÕu hôt ADA vµo cuèi 1990 vµ ®Çu
1991 . TÊm ¶nh ¶nh nµy xuÊt hiÖn trªn t¹p chÝ Time vµo gi÷a 1993.
Trong tiÕn tr×nh gen trÞ liÖu , çc b¸c sÜ ph¶i rót hÕt b¹ch cÇu ra khái c¬ thÓ Ashanti , råi ®Ó çc
tÕ bµo nµy ph¸t triÓn ë phßng thÝ nghiÖm vµ ®a çc gen ®· bÞ mÊt vµo . Çc tÕ bµo ®· ®îc söa
®æi di truyÒn sÏ ®îc thÊm nhËp qua m¹ch m¸u bÖnh nh©n . §iÒu thËt vui mõng lµ çc test
phßng thÝ nghiÖm (labor) cho thÊy hÖ thèng miÔn dÞch cña Ashanti sau khi ®îc trÞ liÖu ®· kh¸
h¼n lªn , em kh«ng cßn bÞ c¶m cóm thêng xuyªn n÷a vµ ®îc phÐp tíi Trêng råi ®îc tiªm
chñng c¶ vacxin ho gµ n÷a .
Sau Ashanti lµ Cynthia 9 tuæi còng m¾c bÖnh suy gi¶m miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng còng ®îc
cøu ch÷a b¨ng GTL vaß cuèi 1990 ®Çu 1991.
Tuy nhiªn, víi GTL th× kh«ng thÓ chÜ xö lý mét lÇn v× çc b¹ch cÇu ®· dîc xö lý di truyÒn chØ
cã thÓ ho¹t ®éng ®îc trong vßng vµi th¸ng nªn liÖu tr×nh ph¶i lËp ®i lËp l¹i nhiÒu lÇn .
Còng cÇn ph¶i nhÊn m¹nh r»ng ,tuy ®· ®¹t ®îc mét sè thµnh tùu trong GTL, nhng nh÷ng g×
mµ ta thu ®îc vÉn cßn rÊt bÐ nhá so víi sù l¹c quan trong mét c©u chuyÖn dµi.
N¨m 1999 vÊp ph¶i mét khã kh¨n v« cïng lín víi sù cè Jesse Gelsinger 18 tuæi bÞ chÕt khi
tham gia GTL v× bÖnh di truyÒn do thiÕu hôt enzym Ornithin Transcarboxylaza (OTCD) .Jesse
bÞ chÕt sau 4 ngµy trÞ liÖu v× cã sù ®¸p øng miÔn dÞch m·nh liÖt víi vËt mang Adenovirut dÉn
®Õn c¬ thÓ bÞ huû ho¹i nghiªm träng .
Mét sù kiÖn träng ®¹i n÷a lµ th¸ng 1 n¨m 2003 , FDA ra lÖnh t¹m dõng tÊt c¶ çc GTL cã sö
dông vec t¬ Retrovirut trong çc tÕ bµo nguån cña m¸u. Së dÜ cã sù cè nµy lµ do sau khi mét
em bÐ ngêi Ph¸p khi xö lý b»ng GTL l¹i ph¸t bÖnh gièng nh bÖnh b¹ch cÇu (Leukemia) .
§iÒu ®¸ng nãi lµ c¶ 2 em bÐ ®Òu ph¸t bÖnh gièng nhau khi dïng GTL ®iÒu trÞ thµnh c«ng bÖnh

6
thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp nghiªm träng SCID hay cßn gäi lµ héi chøng “Bubble Baby” vµo
th¸ng 8 n¨m 2003.
Còng v× lý do nµy nªn Uû ban cè vÊn sinh häc cña FDA còng bµn luËn vÒ kh¶ n¨ng cã thÓ ®Þnh
lîng sè gen trÞ liÖu cã sö dông Retrovirut ®Ó ®¶m b¶o sù an toµn cho GTL.
Con ®êng ®i tíi sù phª chuÈn ®Ó thùc hiÖn mét qui tr×nh GTL gÆp biÕt bao khã kh¨n trë ng¹i
v× cßn rÊt nhiÒu vÊn ®Ò cÇn tranh c·i. KhÝa c¹nh Sinh häc cña GTL rÊt phøc t¹p vµ nhiÒu kü
thuËt cßn ph¶i ph¸t triÓn thªm còng nh çc bÖnh cÇn ph¶i ®îc hiÓu ®Çy ®ñ h¬n n÷a tríc khi
muèn øng dông phÐp trÞ bÖnh b»ng gen .
ViÖc tranh c·i c«ng khai xung quanh vÊn ®Ò liÖu cã nªn sö dông nh÷ng chÊt liÖu (material) do
c«ng nghÖ gen cho con ngêi hay kh«ng th× qu¶ lµ qu¸ phøc t¹p .Tham gia tranh luËn vÒ vÊn ®Ò
nµy cã ®ñ çc chuyªn gia ë nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau nh Sinh häc , Qu¶n lý nhµ níc, Y häc ,
TriÕt häc , ChÝnh trÞ vµ T«n gi¸o v.v.. Mçi lÜnh vùc nh×n nhËn mét kh¸c v× thÕ cã rÊt nhiÒu vÊn
®Ò cÇn ph¶i tranh luËn .
MÆc dï gÆp nhiÒu trë ng¹i , nhng GTL vÉn cã nh÷ng bíc tiªn ®¸ng ghi nhËn . ChØ tÝnh ®Õn
cuèi 1994 ®· cã h¬n 500 bÖnh nh©n ®îc ®iÒu trÞ b¨ng GTL víi nhiÒu lo¹i bÖnh kh¸c nhau ,
trong ®ã sè ngêi bÞ ung th ®îc ®iÒu trÞ víi liÖu ph¸p nµy chiÕm tíi 69% ( n¨m 2001) , bÖnh
HIV-AIDS 11,8%.
Cho tíi nay sè bÖnh ®îc ®iÒu trÞ b»ng GTL ngµy cµng nhiÒu , ngoµi çc bÖnh ung th, SCID,
hµng lo¹t bÖnh kh¸c còng ®· sö dông GTL nh x¬ nang, thiÕu m¸u do hång cÇu h×nh lìi liÒm,
bÖnh l·o ho¸ sím , bÖnh m¸u khã ®«ng, bÖnh thiÕu hôt trÇm träng enzym OTG ( do mét gen
trªn NST giíi tÝnh X ), bÖnh Huntington ( ch÷a b»ng antisens RNA) (New scientist .Com-
march 13.2003) . Kü thuËt t¹o ra çc Liposom cã kÝch thíc siªu nhá (kho¶ng 25 nm) dÔ dµng
mang çc gen qua lç mµng nh©n , hoÆc sö dông vec t¬ Liposom ®îc bao bëi mét líp vá
polyethylen glycol –PEG ®a çc gen vµo tÕ bµo n·o ®Ó ch÷a çc bÖnh Parkinson.v.v..(New
Scientist .Com –May 12-2002)
1.2.Kh¸i niÖm vÒ phÐp ch÷a bÖnh b»ng gen:
Gen lµ ®¬n vÞ c¬ së cña th«ng tin di truyÒn .ThuËt ng÷ gen dïng nh mét ®o¹n cña th«ng tin di
truyÒn ®îc phiªn m· sang mét RNA ®¬n lÎ vµ tiÕp ®ã th«ng tin tõ ph©n tö nµy ®îc dÞch m·
sang mét protein nhÊt ®Þnh .
Gen n»m trªn çc nhiÔm s¾c thÓ (NST) (vÞ trÝ trªn NST n¬i mét gen cô thÓ ®Þnh vÞ gäi lµ locut
cña gen ®ã) . ë çc sinh vËt lìng béi , çc NST s¾p xÕp thµnh çc cÆp t¬ng ®ång t¹i çc vÞ trÝ
t¬ng øng tån t¹i çc d¹ng kh¸c nhau cña cïng mét gen gäi lµ ALEN.
CÊu tróc cña mét gen bao gåm 3 vïng chÝnh : Vïng ®iÒu khiÓn , vïng mang m· di truyÒn vµ
vïng kÕt thóc . Vïng ®iÒu khiÓn cã mét sè tr×nh tù ®Æc hiÖu ®iÒu khiÓn ho¹t ®éng cña gen.
Vïng mang m· chøa çc th«ng tin dØ truyÒn , ®îc phiªn m· sang RNA th«ng tin (mRNA) .
Gen cÊu tróc cã thÓ ®îc dÞch m· t¹o nªn çc s¶n phÈm lµ protein . Vïng kÕt thóc mang çc
tr×nh tù ph©n biÖt gi÷a çc gen vµ çc tr×nh tù kÕt thóc qu¸ tr×nh phiªn m· . CÊu tróc cña gen
cßn bao gåm mét sè cÊu tróc ®Æc thï n»m ë tríc,sau hoÆc trong gen nh çc tr×nh tù ®iÒu hoµ,
vïng t¨ng cêng , vïng bÊt ho¹t (silencer) , vïng ®Öm (spacer).
S¶n phÈm cña gen lµ protein mang nh÷ng chøc n¨ng quan träng nhÊt cña sù sèng vµ t¹o nªn cÊu
tróc cña çc tÕ bµo . Khi gen bÞ biÕn ®æi th× çc protein ®îc m· ho¸ bëi çc gen ®ã kh«ng cã
kh¶ n¨ng thùc hiÖn nh÷ng chøc n¨ng th«ng thêng cña chóng - ®ã lµ nguyªn nh©n cña çc bÖnh
di truyÒn .
PhÐp ch÷a bÖnh b»ng gen hay cßn gäi lµ gen trÞ liÖu –gen liÖu ph¸p v.v.. lµ mét kü thuËt nh»m
chuÈn x¸c l¹i çc gen bÞ khiÕm khuyÕt (lµ nguyªn nh©n ph¸t sinh ra bÖnh ). Çc nhµ nghiªn cøu
®a ra mét sè ph¬ng ph¸p ®Ó chuÈn x¸c l¹i çc gen lçi nh sau :
*§a mét gen ho¹t ®éng b×nh thêng vµo mét vÞ trÝ kh«ng ®Æc hiÖu trongbé gen (genome) ®Ó
thay thÕ çc gen kh«ng cßn chøc n¨ng . §©y lµ çch phæ biÕn nhÊt .
*Mét gen dÞ thêng cã thÓ ®îc ®æi b»ng mét gen b×nh thêng th«ng qua t¸i tæ hîp t¬ng ®ång
.
*Mét gen dÞ thêng cã thÓ ®îc söa ch÷a th«ng qua ®ét biÕn chän läc ngîc (selective reserse
mutation) ®Ó chuyÓn gen trë l¹i chøc n¨ng b×nh thêng cña nã .
*§iÒu hoµ mét gen ®Æc biÖt nµo ®ã ®· bÞ biÕn ®æi (møc ®é ®ãng, më gen).
* §a mét gen b×nh thêng vµo tÕ bµo ho¹t ®éng ®ång thêi víi çc gen g©y bÖnh ®Ó h¹n chÕ t¸c
®éng cña gen g©y bÖnh hoÆc hç trî cho çc gen bÞ h háng ,
*§a mét gen bÊt ho¹t vµo tÕ bµo thay thÕ cho mét gen b×nh thêng nµo ®ã nh»m h¹n chÕ çc
s¶n phÈm kh«ng cÇn thiÕt cña gen lµnh nh»m t¹o mét tr¹ng th¸i míi cho tÕ bµo.
1.3. C¬ chÕ cña Gen trÞ liÖu:
Trong hÇu hÕt çc nghiªn cøu vÒ gen trÞ liÖu , mét gen “b×nh th¬ng” ®uîc ®a vµo bé
gen(genome) ®Ó thay thÐ mét gen “kh«ng b×nh thêng”-gen g©y bÖnh .Ph©n tö chuyªn chë
“Carrier” ®îc gäi lµ Vec t¬ lµm nhiÖm vô chuyÓn gen trÞ liÖu tíi çc tÕ bµo ®Ých cña bÖnh nh©n
. HiÖn nay, Vec t¬ th«ng thêng lµ çc Virut ®· ®îc biÕn ®æi gen mang DNA cña ngêi khoÎ
m¹nh . Virut ph¸t triÓn dÇn dÇn vµ çc gen cña chóng ®îc chuyÓn tíi çc tÕ bµo ngêi ®·

7
nhiÔm bÖnh . Ngêi ta cè g¾ng t¹o ra çc lîi thÕ cña kh¶ n¨ng nµy vµ vËn dông genome virut ®Ó
lo¹i bá çc gen g©y bÖnh vµ ®a çc gen trÞ liÖu vµo c¬ thÓ ngêi bÖnh .
Çc tÕ bµo ®Ých cña bÖnh nh©n (ch¼ng h¹n nh çc tÕ bµo gan hoÆc phæi ) sÏ bÞ nhiÔm víi çc
vec t¬ virut . Çc vec t¬ sau ®ã l¹i “bèc dì”çc vËt liÖu di truyÒn cña nã cã chøa çc gen trÞ liÖu
vµo çc tÕ bµo ®Ých. Sù sinh s«i n¶y në cña çc protein “cã chøc n¨ng”®îc t¹o ra tõ çc gen trÞ
liÖu sÏ hoµn tr¶ tr¹ng th¸i b×nh thêng cña tÕ bµo ®Ých .
1.4.Çc lo¹i gen trÞ liÖu :
VÒ mÆt lý thuyÕt cña GTL , ngêi ta ph©n biÖt gi÷a GTL ®èi víi tÕ bµo Soma vµ GTL
®èi víi çc tÕ bµo mÇm (germ) lµm nhiÖm vô sinh s¶n .
DÜ nhiªn chØ cã çc tÕ bµo mÇm th× míi cã thÓ mang çc gen truyÒn tõ thÕ hÖ nµy sang thÕ hÖ
kh¸c
Xung quanh vÊn ®Ò nµy cã nhiÒu ý kiÕn kh¸c nhau:
Mét sè ngêi ph¶n ®èi bÊt kú mét thao t¸c nµo cña GTL cho dï lµ cã ý ®Þnh tèt (VII , Rifkin
1983) .
Mét sè kh¸c th× ®ång ý TLG ®îc dïng cho çc tÕ bµo soma nhng l¹i do dù ®èi víi çc tÕ bµo
mÇm v× cha nh×n tríc ®îc çc hËu qu¶ ®èi víi çc thÕ hÖ t¬ng lai .
Cßn mét sè kh¸c l¹i cho r»ng ®é an toµn còng nh sù ®iÒu hoµ trong GTL còng cÇn ph¶i uèn
n¾n thêng xuyªn theo n¨m th¸ng vµ ph¶i ®îc sù chÊp thuËn cña lu©n lý .
LiÖu ph¸p gen Soma (Somatic Gene Therapy) lµ ph¬ng ph¸p ®iÒu trÞ thay hoÆc sa ch÷a
çc gen háng, gen g©y bÖnh cña çc tÕ bµo soma trong c¬ thÓ bÖnh nh©n.
LiÖu ph¸p gen soma cã thÓ sö dông mét sè lo¹i tÕ bµo nh lympho(lymphocyte),nguyªn bµo
sîi(Fibroblast),tÕ bµo gèc (stem cells), tÕ bµo m¸u(hematocyte), tÕ bµo biÓu b×(keratinocyte)...
LiÖu ph¸p nµy ®· ®îc ¸p dông víi mét sè lín bÖnh nh©n m¾c çc bÖnh hiÓm nghÌo nh ung
th ,thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng (SCID) , thiÕu m¸u do hång cÇu h×nh lìi liÒm, x¬
nang v.v..
LiÖu ph¸p gen tÕ bµo mÇm (Germline Gene Therapy) lµ ph¬ng ph¸p ®iÒu trÞ , söa ch÷a
hay thay thÕ çc gen háng cho giao tö (tinh trïng hoÆc tÕ bµo trøng) ®a çc tÕ bµo mÇm trë l¹i
tr¹ng th¸i sinh lý b×nh thêng . TLG tÕ bµo mÇm cã thÓ theo 2 çch :
a.§iÒu trÞ çc ph«i ë giai ®o¹n ®Çu (pre embryo) cã çc khuyÕt tËt di truyÒn nghiªm träng.
b.§iÒu trÞ çc tÕ bµo mÇm (tinh trïng hay tÕ bµo trøng ) cña nh÷ng ngêi cã khuyÕt tËt vÒ mÆt
di truyÒn mµ nh÷ng khuyÕt tËt nµy cã thÓ truyÒn l¹i cho çc thÕ hÖ sau . Çch tiÕp cËn nµy ®ßi
hái sù thµnh th¹o vÒ kü thuËt . Tuy nhiªn, vÊn ®Ò nµy cßn nhiÒu tranh c·i chñ yÕu v× lý do ®¹o
®øc vµ cã sù liªn quan tíi viÖc nh©n b¶n ngêi .
1.5.Nh÷ng bÖnh cã thÓ sö dông ®îc GTL.
HiÖn nay nh÷ng bÖnh nµo cã thÓ øng dông ®îc ph¬ng ph¸p ch÷a bÖnh b»ng gen ? §©y lµ mét
c©u hái mµ nhiÒu ngêi quan t©m . Chóng ta nhí l¹i r»ng cuèi n¨m 1993 GTL ®· ®îc sö dông
cho çc bªnh thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp nghiªm träng ,bÖn¾utng Cholesterol cã tÝnh chÊt gia
®×nh,bÖnh nang x¬ vµ bÖnh Gaucher. Cho tíi nay phÇn lín çc protocol ®îc ¸p dông cho çc
bÖnh ung th vµ mét sè Ýt híng tíi bÖnh AIDS . Còng cã mét sè bÖnh ®îc bµn luËn ®Ó sö
dông GTL nh bÖnh Parkinson vµ bÖnh Alzheimer, bÖnh viªm khíp , çc bÖnh vÒ tim (VII,
Wolff 1993).
Dù ¸n bé gen ngêi ®ang nç lùc x¸c ®Þnh vÞ trÝ cña tÊt c¶ çc gen trong bé gen ngi¬× , sau ®ã
tiÕp tôc x¸c ®Þnh çc gen g©y bÖnh di truyÒn . Còng trong dù ¸n nµy Eve Nichols ®· ®a ra çc
tiªu chuÈn lùa chän çc bÖnh sö dông GTL nh sau :
1.Çc bÖnh nÆng ®ang ®e do¹ sù sèng mµ kh«ng cã çch cøu ch÷a
2.Ph¶i x¸c ®Þnh râ rµng çc tæ chøc, m« vµ çc tÕ bµo bÞ nhÔm bÖnh .
3.B¶n sao b×nh thêng cña çc gen khuyÕt tËt ph¶i ®îc ph©n lËp vµ t¸ch dßng .
4.Çc gen b×nh thêng cã thÓ ®îc ®a vµo tõng bé phËn nhá cña tÕ bµo m« bÞ bÖnh. HoÆc khi
®a mét gen vµo mét m« ®Ých nh tuû x¬ng ch¼ng h¹n th× nã sÏ lµm thay ®æi qu¸ tr×nh diÔn
tiÕn ë çc m« bÞ bÖnh .
5. Gen cã thÓ ®îc chuyÓn tíi mét vÞ trÝ thÝch hîp khi ®ã nã sÏ chØ ®¹o viÖc tæng hîp mét lîng
protein cã chøc n¨ng b×nh thêng ®Ó t¹o nªn mét sù kh¸c biÖt ®Æc biÖt.
6.Çc kü thuËt ®îc ¸p dông ph¶i ®îc x¸c nhËn lµ an toµn ( III,Nichols 1988,p.18)
Cho tíi nay GTL cã thÓ ®îc øng dông trong çc bÖnh cô thÓ nh sau :
1.5.1.§iÒu trÞ çc bÖnh di truyÒn ( inherited disorders) .
1.5.1.1.Víi çc bÖnh di truyÒn g©y nªn bëi çc locut gen ®¬n (monogenic).
Nh÷ng bÖnh nµy thêng g©y tö vong ë giai ®o¹n sím vµ ®Ó l¹i çc di chøng cho çc thÕ hÖ sau.
Møc ®é di truyÒn lµ 100% . Mét sè bÖnh ®iÓn h×nh lµ :
-ThiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng (SCID)
-ThiÕu m¸u do hång cÇu h×nh lìi liÒm (Sickle cell anemia)
-BÖnh a ch¶y m¸u (Hemophilia)

8
-BÖnh x¬ nang (cystic fibrosis) vµ viªm phæi cÊp.
-BÖnh Parkinson
-BÖnh Gaucher.
-BÖnh rèi lo¹n m·n tÝnh chøc n¨ng tæ chøc h¹t (chronic granulomatoses disease)
1.5.1.2. Çc bÖnh do rèi lo¹n di truyÒn çc locut ®a gen (polygenic)
§©y lµ nhãm bÖnh g©y bëi nhiÒu gen thuéc çc locut kh¸c nhau . Tuú theo møc ®é h háng
hoÆc mÊt chøc n¨ng gen cña mét hay nhiÒu gen (alelle) mµ møc ®é biÓu hiÖn bÖnh cã kh¸c
nhau . Nh÷ng bÖnh nµy chØ di truyÒn l¹i cho thÕ hÖ sau díi 100%.Cã thÓ kÓ qua çc bÖnh sau
®©y:
-BÖnh tim bÈm sinh (Congenital Heart disease)
-Ung th
-BÖnh tiÓu ®êng (Diabetes)
-BÖnh nghiÖn rîu (Alcoholism)
-BÖnh t©m thÇn ph©n liÖt (Schizophrenia)
-BÖnh cã hµnh vi ph¹m téi (Criminal behavior)
1.5.2.§iÒu trÞ çc bÖnh do nhiÔm trïng :
GTL ®· ®¹t hiÖu qu¶ cao trong viÖc ®iÒu trÞ çc bÖnh nhiÔm trïng do vi khuÈn vµ virut nh ung
th gan, lao , HIV-AIDS ,viªm gan B ... Trong t¬ng lai kh¶ n¨ng GTL sÏ ®iÒu trÞ ®îc nhiÒu
bÖnh truyÒn nhiÔm víi hiÖu qu¶ vµ chÊt lîng cao , cøu sèng ®îc nhiÒu ngêi bÖnh .
PhÐp ch÷a bÖnh b»ng gen lµ mét ph¬ng ph¸p míi ,cã hiÖu qu¶ cao nhng hiÖn nay vÉn bÞ h¹n
chÕ v× nã qu¸ phøc t¹p, tèn kÐm vµ b¾t buéc ®ßi hái ph¬ng tiÖn kü thuËt hiÖn ®¹i. ChÝnh v× vËy
cho tíi nay ph¬ng ph¸p nµy chØ míi giíi h¹n trong çc bÖnh hiÓm nghÌo vµ chØ cã çc níc
ph¸t triÓn víi tiÒm lùc kinh tÕ cao míi cã ®iÒu kiÖn ¸p dông. DÜ nhiªn cßn nhiÒu vÊn ®Ò kh¸c
n÷a nh hÖ sè an toµn vµ nh÷ng hËu qu¶ ngoµi ý muèn cña gen trÞ liÖu ...còng lµm cho ngêi ta
thËn träng h¬n khi sö dông kü thuËt nµy .
Víi çc níc ®ang ph¸t triÓn th× gen trÞ liÖu míi chØ giíi h¹n ë nh÷ng thùc nghiÖm, cha cã
chiÕn lîc ph¸t triÓm rÇm ré .Níc ta còng vËy, liÖu ph¸p gen cßn rÊt xa l¹ víi çc thÇy thuèc ,
chóng ta cha s½n sµng tiÕp nhËn mét “vò khÝ” míi hiÖn ®¹i ,hiÖu qu¶ vît tréi h¬n h¼n çc
ph¬ng ph¸p kh¸c .§· ®Õn lóc chóng ta ph¶i ®Æt ra mét chiÕn lîc ph¸t triÓn cã ®Þnh híng cô
thÓ vÒ gen trÞ liÖu , v× nã cã nhiÒu lîi thÕ vît tréi vµ ch¾c ch¾n sÏ mang l¹i h¹nh phóc cho tÊt
c¶ mäi ngêi .

9
Ch¬ng II
Nguyªn lý c¬ b¶n cña Gen trÞ liÖu
2.1. Nguyªn lý cña gen trÞ liÖu
GTL lµ ®a mét gen míi (cßn gäi lµ gen liÖu ph¸p) vµo trong tÕ bµo ngêi lµm cho nã g¾n ®óng
vµo vÞ trÝ cÇn söa ch÷a cña bé gen vµ ho¹t ®éng mét çch b×nh thêng trong tÕ bµo .Çc gen trÞ
liÖu nµy t¹o ®îc çc s¶n phÈm cã kh¶ n¨ng h¹n chÕ hoÆc k×m h·m sù t¸c ®éng cña çc gen
háng , do ®ã lµm gi¶m çc biÓu hiÖn cña bÖnh .§©y chÝnh lµ kü thuËt di truyÒn (genetic
engineering) hay cßn gäi lµ thao t¸c gen (gene manipulation) hay t¸ch dßng gen (gene cloning),
c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp (recombitant DNA technology) , s÷a ®æi di truyÒn (genetic
modification) hoÆc cßn gäi lµ di truyÒn häc míi (new genetics).
MÆc dï nhiÒu kü thuËt ®a d¹ng vµ phøc t¹p ®îc sö dông nhng çc nguyªn lý cña kü thuËt di
truyÒn kh¸ ®¬n gi¶n . C¬ së cña c«ng nghÖ nµy lµ th«ng tin di truyÒn m· ho¸ trong DNA tån t¹i
ë d¹ng çc gen . Çc th«ng tin nµy cã thÓ söa ®æi theo nhiÒu çch kh¸c nhau ®Ó ®¹t tíi nh÷ng
môc ®Ých nhÊt ®Þnh trong nghiªn cøu c¬ b¶n còng nh øng dông trong y sinh häc . §iÓm mÊu
chèt cña kü thuËt di truyÒn lµ t¸ch chiÕt mét ®o¹n DNA riªng biÖt tõ hÖ gen ( ®ã lµ b¶n chÊt
cña t¸ch dßng gen ). Víi GTL qu¸ tr×nh nµy bao gåm 4 bíc sau ®©y :
1.T¸ch dßng gen trÞ liÖu (t¹o ra çc ®o¹n DNA).
2. Chän vec t¬ chuyÓn gen phï hîp víi gen trÞ liÖu vµ nèi chóng l¹i víi nhau .
3. T¹o çc vec t¬ t¸i tæ hîp vµ ®a çc vec t¬ mang gen trÞ liÖu vµo tÕ bµo chñ vµ nh©n lªn .
4. Chän läc çc tr×nh tù (sequence) quan t©m ,theo dâi sù ho¹t ®éng vµ nh÷ng biÓu hiÖn cña
gen trÞ liÖu.
Chóng ta h·y lít qua ®«i nÐt vÒ
c¬ së sinh häc cña c«ng nghÖ DNA .
2.1.1.Çc tÕ bµo chñ (organnisms) :
C«ng nghÖ DNA míi ®· t¹o dùng ®îc kh¶ n¨ng nghiªn cøu trªn vi khuÈn vµ virut (H×nh 2.1.)
H×nh 2.1.Vi khuÈn phôc vô con ngêi. ¶nh hiÓn vi ®iÖn tö mét mÉu Pseudomonas. Anad
Chakrabarty ®· sö dông Pseudomonas biÕn ®æi gen s¶n xuÊt ra çc enzym ph©n huû dÇu vµ
lµm s¹ch m«i trêng.
Nh÷ng sinh vËt nµy cã thÓ nu«i cÊy ®îc mét çch dÔ dµng vµ viÖc kh¶o s¸t Ho¸ sinh còng
®îc thùc hiªn mét çch dÔ dµng trong èng nghiÖm.Vi khuÈn ®îc dïng phæ th«ng nhÊt trong

10
c«ng nghÖ DNA lµ Escherichia Coli.ViÖc sö dung réng r·i ®Çu dß vi khuÈn lµ mét biÕn cè lÞch
sö .Nh÷ng c«ng tr×nh nghiªn cøu trªn nh÷ng sinh vËt nµy qua hµng mÊy thËp kû ®· cho phÐp
çc nhµ sinh häc hiÓu râ h¬n vª mÆt Ho¸ sinh, h×nh th¸i, sinh lý,vµ di truyÒn häc cña chóng h¬n
bÊt cø sinh vËt nµo kh¸c (kÓ c¶ con ngêi) v× chóng dÔ dµng ®îc nu«i cÊy vµ kh«ng ph¶i lµ
yÕu tè g©y bÖnh cho con ngêi . E. Coli ®· trë thµnh con ngùa thå cho çc thÝ nghiÖm trong
c«ng nghÖ DNA .
2.1.1.1.NhiÔm s¾c thÓ cña vi khuÈn ®Æc biÖt thÝch hîp cho çc thÝ nghiÖm DNA bëi v×
nã chØ thuÇn cã DNA , cßn ë çc tÕ bµo nh©n chuÈn nh çc tÕ bµo ®éng vËt th× phøc t¹p h¬n v×
NST cã chøa nhiÒu protein g¾n chÆt vµo DNA . H¬n n÷a , NST cña vi khuÈn lµ hoµn toµn ®¬n lÎ
nªn nã cã thÓ tù biÓu hiÖn ®îc mµ kh«ng bÞ lÊn ¸t bëi NST thø hai . Ngîc l¹i NST cña çc tÕ
bµo nh©n chuÈn l¹i lµ cÆp ®«i vµ thêng mét trong sè ®ã lµ tréi . Thªm n÷a lµ NST cña vi
khuÈn thêng n»m tù do trong tÕ bµo chÊt v× thÕ nghiªn cøu nã dÔ dµng h¬n . Trong khi ®ã
NST cña çc tÕ bµo nh©n chuÈn th× l¹i cã mµng nh©n bao quanh nh©n nªn c«ng viÖc kh¶o s¸t
gÆp nhiÒu khã kh¨n h¬n . Mét lý do kh¸c n÷a lµ m· di truyÒn cña çc sinh vËt nµy lµ rÊt phæ
th«ng nªn vi khuÈn cã thÓ biÓu hiÖn DNA ngo¹i lai tõ bÊt kú c¬ thÓ nµo dï dµi ®Õn mÊy nÕu
nh ®· g¾n ®îc vµo DNA cña vi khuÈn . Trªn thùc tÕ, mét gen ngo¹i lai khi ®· g¾n vµo NST
cña vi khuÈn th× nã sÏ ®îc sao chÐp vµ phiªn m· chÜnh x¸c gièng y nh DNA vi khuÈn mÑ.
2.1.1.2.Virut : Çc virut thêng ®îc dïng trong çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ DNA . Nh÷ng
h¹t siªu vi nµy bao gåm Ýt hoÆc nhiÒu ®o¹n RNA hoÆc DNA ®îc bao trong mét çi ¸o protein
vµ tuú thuéc vµo tõng lo¹i virut mµ cã lo¹i cßn cã c¶ mét líp lipid bao quanh. Virut sao chÐp
mét çch ®¬n ®éc trong çc tÕ bµo sèng. ë ®ã chóng lét bá phÇn vá protein cña m×nh vµ sö
dông cç m¸y ph©n tö cña tÕ bµo ®Ó t¹o nªn çc virut míi .Virut DNA hay RNA ho¹t ®éng nh
mét gen vµ chØ ®¹o sù tæng hîp çc h¹t virut míi . Khi ®ã çc virut RNA hay DNA t¸c ®éng
nh mét RNA th«ng tin cung cÊp çc m· (Codon) cho çc protein enzym vµ çc thµnh phÇn
cÊu tróc cña virut .
§«i khi virut kh«ng tù sao chÐp tøc kh¾c mµ nã l¹i g¾n vµo NST cña tÕ bµo chñ vµ trë thµnh
mét bé phËn cña bé gen tÕ bµo . DNA cña Herpesvirus ch¼ng h¹n , nã cã thÓ héi nhËp vµo bé
gen cña tÕ bµo thÇn kinh vµ ë l¹i ®ã nhiÒu n¨m g©y nªn sù x©m nhiÔm tuÇn hoµn herpes .Còng
t¬ng tù nh vËy, virut g©y héi chøng thiÕu hôt miÔn dich trªn ngêi HIV chóng lét bá ¸o trªn
tÕ bµo råi RNA cña chóng ho¹t ®éng nh mét çi khu«n tæng hîp DNA. DNA nµy tù cµi vµo
genome cña tÕ bµo chñ. Nh vËy, tÕ bµo ®· trë thµnh vËt mang virut DNA vµ bÞ bÖnh HIV.
Kh¶ n¨ng virut cµi ®îc vµo bé gen cña tÕ bµo chñ ®· lµm çc nhµ c«ng nghÖ DNA chó ý , hä
nh×n nhËn nã nh lµ mét çch ®Ó mang gen vµo trong tÕ bµo .
Nh÷ng nghiªn cøu ë nh÷ng n¨m 1950 còng chøng minh r»ng t¸i tæ hîp gen còng cã thÓ x¶y ra
gi÷a çc vi khuÈn vµ virut.
Çc thÝ nghiÖm cña Griffith víi vi khuÈn vµo n¨m 1928 ®· lµm râ sù t¸i tæ hîp gen vµ dÉn tíi
sù ph¸t hiÖn cña Avery vÒ DNA lµ mét ph©n tö cã liªn quan trong t¸i tæ hîp. Còng trong
nh÷ng n¨m 1950 , çc nhµ vi khuÈn häc ®· ph¸t hiÖn ra çc vËt chÊt di truyÒn tõ çc m¶nh vì vi
khuÈn cã thÓ ®a ®uîc vµo çc vi khuÈn sèng , ®ã lµ mét hiÖn tîng tù nhiªn . HiÖn tîng nµy
chÝnh lµ sù biÕn n¹p (transforrmation). MÆc dï sù biÕn n¹p chØ x¶y ra víi tû lÖ Ýt h¬n 1% trong
mét quÇn thÓ vi khuÈn , nhng ®iÒu nµy ®· dÉn ®Õn nh÷ng thay ®æi s©u s¾c trong di truyÒn häc .
Trong sù biÕn n¹p, mét sè vi khuÈn cho (donnor) bÞ vì ra vµ DNA cña chóng ®îc lé ra thµnh
çc m¶nh . Khi cã mét vi khuÈn nhËn (recipient) th× mét ®o¹n DNA chuçi kÐp chøa kho¶ng 10-
20 gen cã thÓ ®i qua v¸ch vµ mµng tÕ bµo cña chóng . Mét enzym lµm hoµ tan mét chuçi cña
DNA vµ chuçi cßn l¹i th× ®æi chç cho ®o¹n DNA chuçi ®¬n trong NST vi khuÈn nhËn . Çc gen
ngo¹i lai nµy sau ®ã tù biÓu lé trong qu¸ tr×nh tæng hîp protein ®Ó hoµn tÊt sù biÕn n¹p.
Díi çc ®iÒu kiÖn tù nhiªn, sù biÕn n¹p x¶y ra ë nh÷ng c¬ thÕ cã DNA t¬ng tù .Mét trong sè
çc hÖ qu¶ cã thÓ lµ lµm t¨ng tÝnh g©y bÖnh cho c¬ thÓ nhËn (trong thÝ nghiÖm Griffith’s
pneumococci) . Mét hÖ qu¶ kh¸c cã thÓ lµ ph¸t triÓn tÝnh kh¸ng thuèc . §iÒu ®ã , cã thÓ gi¶i
thÝch ®îc mét sè vi khuÈn ®· kh¸ng thuèc trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y nh thÕ nµo .

11
H×nh 2.2. CÊu tróc cña c¸c Virut (a) Virut thùc vËt (virut kh¶m cñ c¶i ®á). (b) Virut kh¶m
thuèc l¸ .(c) Bacteriophage .
TiÕp tôc nh÷ng nghiªn cøu trong nh÷ng n¨m 1950 ngêi ta ®· chØ râ r»ng vi khuÈn còng cã
thÓ ®îc t¸i tæ hîp bëi qu¸ tr×nh liªn hîp (conjugation) .

12
H×nh 2.3, C¬ chÕ trong ®ã mét Retrovirut nh HIV cã liªn quan víi tÕ bµo vËt chñ . Acid
Nucleic cña Retrovirut lµ RNA.Enzymphiªn m· ngîc tæng hîp mét ph©n tö DNA chuèi kÐp
th¼ng (ds DNA), sau ®ã hîp nhÊt víi vµo bé gen tÕ bµo chñ nh mét Provirut. ë nh÷ng thêi
®iÓm sau ®ã (giê, ngµy , tuÇn hoÆc dµi h¬n nòa) RNA polymeraza tõ vËt chñ sÏ sao chÐp
provirut thµnh d¹ng genome RNA cña Retrovirut .Khi ®ãng gãi víi protein th× genome nµy t¹o
nªn mét bé çc Virut míi ra khái tÕ bµo nµy ®Ó g©y nhiÔm çc tÕ bµo míi vµ tiÕp tôc chu
tr×nh.
Sù ph¸t hiÖn cña Joshua Lederberg, Francois Jacob vµ Elie Wollman ®· cã ¶nh hëng
s©u s¾c tíi viÖc nghiªn cøu . Trong khi liªn hîp 2 vi khuÈn , mét cho vµ mét nhËn tiÕn l¹i gÇn
nhau vµ nèi víi nhau bëi mét cÇu bµo chÊt (cytoplasmic) . Sau ®ã DNA chuçi ®¬n tõ vi khuÈn
cho ®i qua cÇu bµo chÊt ®Ó tíi vi khuÈn nhËn .
H×nh 2.4. BiÕn n¹p trong tÕ bµo vi khuÈn .(a) Mét ®o¹n DNA gi¶i phãng tõ mét tÕ bµo cho ®·
chÕt .(b)§o¹n DNA ®i vµo çc tÕ bµo nhËn ®ang sèng. (c)Mét chuçi bÞ hoµ tan vµ (d) chuçi
cßn l¹i thÕ mét ®o¹n cña chuçi trong NST tÕ bµo nhËn vµ biÕn n¹p tÕ bµo nµy. BiÕn n¹p ®îc
nghiªn cøu s©u tõ nh÷ng n¨m 1950 vµ ®· ®îc chøng minh nh÷ng ®iÒu x¶y ra trong phßng thÝ
nghiÖm vµo nh÷ng n¨m 1970.
ë ®©y nã cã thÓ hîp nhÊt víi NST vi khuÈn nhËn (rÊt hiÕm) , hoÆc cã thÓ tån t¹i ë tÕ bµo chÊt
díi d¹ng mét vßng DNA di ®éng tù do (xem phÇn Plasmid).
Nh÷ng gen míi thu nhËn tõ vi khuÈn cho sau nµy tù nã biÓu hiÖn (H×nh 2.5.)

13
H×nh 2.5. Sù hîp nhÊt trong vi khuÈn. Hai tÕ bµo Escherichia Coli nèi víi nhau qua cÇu t¬ng
bµo .Nh÷ng tÕ bµo phÝa bªn ph¶i cã l«ng trªn bÒ mÆt ®ã lµ çc tÕ bµo cho . Çc tÕ bµo phÝa
bªn tr¸i lµ çc tÕ nhËn .Sù hîp nhÊt t¹o thuËn lîi cho viÖc vËn chuyÓn çc chÊt liÖu di truyÒn tõ
tÕ bµo nµy sang tÕ bµo kh¸c .§ã lµ mét ph¬ng ph¸p mµ vi khuÈn thu ®îc çc gen cho phÐp
nã kh¸ng l¹i nhiÒu lo¹i thuèc .
Sù liªn hîp nh ®· m« t¶ x¶y ra gi÷a çc tÕ bµo tõ çc loµi kh¸c nhau cña vi khuÈn , ch¼ng
h¹n nh gi÷a Salmonella vµ Shigella .(ngîc l¹i, sù biÕn n¹p chØ x¶y ra gi÷a çc tÕ bµo cã
bé gen gièng nhau). Nh v©y, sù liªn hîp cã thÓ coi nh viÖc ®a mét gen vµo çc vi khuÈn
kh«ng cã quan hÖ di truyÒn vµ coi nh ®ã lµ sù t¸i tæ hîp cña çc mÉu ph©n kú (divergent)
réng.
D¹ng thø ba cña t¸i tæ hîp ®îc ph¸t hiÖn vµo nh÷ng n¨m 1950 lµ cña Joshua Ledeberg
vµ Norton Zinder. Nh÷ng nhµ nghiªn cøu nµy ®· ph¸t hiÖn ra r»ng virut cã thÓ truyÒn DNA
cho çc tÕ bµo vi khuÈn vµ t¸i tæ hîp cã hiÖu qu¶ çc tÕ bµo nµy . Qu¸ tr×nh nµy gäi lµ sù
chuyÓn n¹p (transduction).
Trong chuyÓn n¹p , mét virut lµ bacteriophage (®¬n gi¶n gäi lµ phage) chui vµo mét tÕ bµo vi
khuÈn vµ trao ®æi DNA cña nã víi NST vi khuÈn .Råi çc virut nµy cã thÓ ®îc th¸o gì khái
NST vi khuÈn , nh vËy nã cã thÓ mang theo mét ®o¹n nhá DNA cña vi khuÈn . Khi virut sao
chÐp nã tù t¸i b¶n DNA cña chÝnh nã còng nh DNA vi khuÈn vµ ®ãng gãi DNA vµo trong çc
phage míi .Vµ khi virut chui nµo trong mét vi khuÈn míi nã sÏ tù g¾n vµo NST vi khuÈn vµ
mang theo DNA cña vi khuÈn
®· ®îc g¾n tõ tríc . Nh vËy vi khuÈn míi nµy ®· ®îc t¸i tæ hîp , hay cßn gäi lµ sù chuyÓn
n¹p (transduction).
ChuyÓn n¹p lµ mét sù kiÖn Ýt x¶y ra ë çc tÕ bµo vi khuÈn , khã t×m ®îc çc vÝ dô . Tuy nhiªn,
tiÒm n¨ng cña chuyÓn n¹p th× rÊt to lín bëi v× nhiÒu virut cã thÓ trao ®æi trong çc tÕ bµo vËt
chñ khi phage chuyÓn n¹p .Ch¼ng h¹n nh Bacillus diphteria lµ nh÷ng bÕn c¶ng cho
bacteriophage m· ho¸ cho viÖc t¹o ra çc ®éc tè cña chÝnh sinh vËt nµy . Salmonnella g©y
nhiÔm trïng thùc phÈm còng ®îc hiÓu lµ vËt vËn chuyÓn bacteriophage . §èi víi ngêi th× çc
herpesvirus cã thÓ tån t¹i trong çc tÕ bµo thÇn kinh nh ®· ®Ò cËp ë trªn .Virut g©y thuû
®Ëu, virut g©y nhiÔm mononucleosis vµ HIV lµ çc virut ®· ®îc nghiªn cøu kü lìng , nã cã
thÓ cµi a xit nucleic cña chóng vµo trong çc tÕ bµo cña ngêi.

14
H×nh 2.6. ¶nh qua hiÓn vi ®iÖn tö cña mét Bacteriophage vµ vi khuÈn chñ cña nã- E.Coli
.NhiÒu Bacteriophage cã thÓ g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo vi khuÈn . Trong h×nh phage ®ang sao chÐp
trong vi khuÈn vµ cã thÓ nh×n thÊy nhiÒu thø trong tÕ bµo chñ .
Qu¸ tr×nh biÕn n¹p, liªn hîp, vµ chuyÓn n¹p cho phÐp vi khuÈn thu ®îc nh÷ng mÊu DNA míi
vµ duy tr× ®îc çc ®Æc tÝnh di truyÒn .
Trong nh÷ng n¨m 1950 , çc nhµ sinh häc ph©n tö lÇn ®Çu tiªn sö dông tõ “t¸i tæ hîp-
recombined” ®Ó chØ çc vi khuÈn ®· biÕn ®æi gen vµ cã DNA míi .DÇn dÇn, tõ “recombinant
DNA” trë thµnh thuËt ng÷ Ho¸ sinh . Cho tíi nay, DNA t¸i tæ hîp dïng ®Ó chØ çc ph©n tö
DNA cã chøa çc thµnh phÇn DNA tù nhiªn còng nh mét sè DNA ngo¹i lai g¾n vÜnh viÔn vµo
ph©n tö gèc . Nh÷ng thùc nghiÖm víi vi khuÈn trong nh÷ng n¨m 1950 ®· chøng minh r»ng t¸i
tæ hîp lµ mét kh¶ n¨ng x¶y ra trong tù nhiªn . Çc nhµ khoa häc b¾t ®Çu ®Æt ra vÊn ®Ò lµ cã thÓ
thùc hiÖn sù t¸i tæ hîp t¬ng tù trong phßng thÝ nghiÖm kh«ng ?
2.1.2.Çc enzym giíi h¹n:
C«ng tr×nh ®îc quan t©m lín trong nh÷ng n¨m 1950 vÒ DNA lµ c«ng tr×nh cña Salvador
Luria cïng céng t¸c ®· cung cÊp b»ng chøng lµ E.Coli cã thÓ kh¸ng l¹i sù ph¸ huû bëi
bacteriophage . Tøc lµ nã cã thÓ”h¹n chÕ” sù sao chÐp bëi virut . N¨m 1962, Werner Arber
vµ nhãm céng t¸c ®É chøng minh r»ng cã mét hÖ thèng enzym h¹n chÕ sù sao chÐp cña virut do
nã c¾t bá DNA cña phage tríc khi nã tíi tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn . Hä ®· ph©n lËp ®îc
enzym ®ã tõ E.Coli vµ ®Æt tªn lµ endonucleaza. Enzym nµy c¾t DNA cña virut nhng kh«ng c¾t
DNA cña vËt chñ vi khuÈn bëi v× nã ®· cã sù c¶i biÕn tríc tiªn ë DNA vi khuÈn b»ng çch
g¾n thªm çc nhãm metyl vµo DNA vi khuÈn . V× endonucleaza”h¹n chÕ” sù sao chÐp cña virut
(vµ bëi v× nã lµm khëi ®éng vÞ trÝ”h¹n chÕ” sù sao chÐp trªn ph©n tö DNA) nªn dÇn dÇn ®îc
gäi lµ enzym c¾t giíi h¹n (restriction enzyme).
Nhãm nghiªn cøu cña Arber ®· ph¸t hiÖn ra r»ng enzym c¾t giíi h¹n cña hä Ýt cã gi¸ trÞ thùc
tiÔn trong thao t¸c DNA v× nã c¾t DNA ë nhiÒu vÞ trÝ . V× thÕ cho tíi n¨m 1970 Hamilton
Smith vµ céng t¸c l¹i ph©n lËp ®îc mét enzym giíi h¹n míi tõ vi khuÈn Haemophilus
influenzae . Enzym nµy c¾t ph©n tö DNA ë nh÷ng ®iÓm cã thÓ ®o¸n tríc ®îc v× vÞ trÝ t¸c
®éng cña nã chÝnh x¸c h¬n enzym cña Arber. Khi sö dông enzym nµy Daniel Nathan vµ
nhãm nghiªn cøu cña «ng ®· ph©n lËp ®îc DNA tõ mét virut trªn khØ gäi lµ Simian virut 40
(hay SV40) vµ chøng minh r»ng enzym cña vi khuÈn nµy cã thÓ dïng ®Ó c¾t DNA virut ë mét
vµi vÞ trÝ nµo ®ã (H×nh 2.7.).

15
H×nh 2.7.Çc Enzym giíi h¹n . (a) Werner Arber , Hamilton Smith vµ Daniel Nathans nhËn
gi¶i Nobel n¨m 1978 vÒ Sinh lý häc vµ y häc víi c«ng tr×nh vÒ çc enzym giíi h¹n . (b) Ho¹t
tÝnh cña çc enzym giíi h¹n (hoÆc Endonucleaza) . Enzym giíi h¹n çt 2 chuçi cña ph©n tö
DNA ®Ó t¹o thµnh 2 m¶nh . (c)VÞ trÝ nhËn d¹ng cña mét vµi enzym giíi h¹n. Mòi tªn chØ chøc
n¨ng cña nh÷ng enzym giíi h¹n kh¸c nhau . Lu ý r»ng ë vÞ trÝ nhËn d¹ng ®Æc biÖt tr×nh tù
nucleotit cña 2 chuçi DNA ch¹y theo híng ®èi nghÞch nhau . Sù ®èi xøng nµy gäi lµ ®èi xøng
quay 2 chiÒu .Còng lu ý r»ng 2 enzym HaeIII vµ Smal t¹o ra çc m¶nh víi çc ®Çu kh«ng s¾c
(blunt) trong khi ®ã enzym EIoRIvµ HindIII t¹o nªn çc ®Çu ®ung ®a . Nh÷ng ®Çu ®ung ®a
nµy cÇn cho kü thuËt g¾n gen . Do nh÷ng c«ng tr×nh nµy mµ Arber,Smith vµ Nathan ®· ®îc
nhËn gi¶i thëng Nobel vÒ sinh lý häc vµ y häc n¨m 1978.
Nhê çc thµnh tùu nghiªn cøu trong nhiÒu n¨m , çc nhµ c«ng nghÖ DNA thÊy r»ng hä cã thÓ
sö dông çc enzym giíi h¹n ®Ó c¾t nhá ph©n tö DNA theo ý muèn bÊt kÓ tõ nguån gèc nµo .
ThËt vËy, enzym c¾t giíi h¹n tõ vi khuÈn cã thÓ dïng ®Ó c¾t mét ph©n tö DNA ë ®iÓm X , bÊt
chÊp nã lµ DNA cña thùc vËt, ®éng vËt hay ngêi. Ch¼ng h¹n nh ®èi víi mét sè çc virut th×
mét enzym cã thÓ c¾t ®îc DNA cña çc virut kh¸c nhau ë r©t nhiÒu vÞ trÝ .Thùc tÕ lµ cã trªn
1.200 enzym çt giíi h¹n ®· ®îc ph©n lËp vµ lµm tinh khiÕt tõ vi khuÈn .Enzym thuéc nhãm

16
nµy t¸c ®éng vµo nhiÒu tr×nh tù nucleotit kh¸c nhau : cã kho¶ng 75 enzym ®· trë thµnh th¬ng
phÈm .
Çc enzym c¾t giíi h¹n gäi tªn theo quy íc quèc tÕ nh sau: Ch÷ ®Çu tiªn viÕt ch÷ in hoa chØ
tªn chi hoÆc loµi vi khuÈn mµ tõ ®ã çc enzym giíi h¹n ®îc ph©n lËp (ch÷ nghiªng)
B¶ng.2.1.
Hai ch÷ tiÕp theo viÕt ch÷ thêng chØ gièng vi khuÈn (còng ch÷ nghiªng) , tiÕp theo lµ lµ mét
ch÷ hoa chØ chñng vi khuÈn vµ cuèi cïng lµ sè La m· chØ thø tù enzym giíi h¹n ®îc t×m ra .
Ch¼ng h¹n nh çc enzym díi ®©y :
EcoRI tõ Escherichia (E)
co(co)
chñng RY13(R)
Endonucleaza thø nhÊt (I)
BamHI tõ Bacillus(B)
amyloliquifaciens(am)
chñng H(H)
endonucleaza thø nhÊt (I)
HindIII tõ Haemophilus (H)
influenzae(in)
chñng Rd(d)
endonucleaza thø III (III)
Víi mét c¬ chÕ cha ®îc x¸c ®Þnh , enzym giíi h¹n quÐt trªn ph©n tö DNA vµ dõng l¹i khi nã
nhËn d¹ng ®îc mét tr×nh tù cña 4 hay 6 nucleotit . Tr×nh tù nhËn d¹ng (recognition sequence)
nh tªn gäi cña nã lµ n¬i mµ ph©n tö DNA bÞ ph©n c¾t .Tr×nh tù nhËn d¹ng biÓu lé sù ®èi xøng
2 vßng , ®iÒu ®ã cã nghÜa lµ çc nucleotit ë ®u«i tr×nh tù nµy lµ bæ cøu cho çc nucleotit ë mét
®Çu kh¸c (H.4.8c).
Thùc chÊt 2 chuçi cña xo¾n kÐp l¹i cã cïng mét tr×nh tù nucleotit ch¹y theo híng ®èi nghÞch
däc theo chiÒu dµi cña tr×nh tù . NhiÒu enzym giíi h¹n chØ c¾t ë çc vÞ trÝ ë phÇn ®u«i , nhng

17
mét sè enzym giíi h¹n kh¸c l¹i c¾t c¶ nh÷ng vÞ trÝ ë cuèi cña nh÷ng chuçi ®¬n , tøc lµ kh«ng
cè ®Þnh (h 4.8c).
Sù s¾p xÕp ®éc quyÒn nucleotit trªn 2 chuçi cã 2 t¸c dông:
1. V× tr×nh tù nhËn d¹ng lµ gièng nhau trªn c¶ 2 chuçi (mÆc dï ch¹y tr¸i chiÒu nhau), nªn
çc enzym giíi h¹n nhËn d¹ng vµ c¾t ®îc ë c¶ 2 chuçi cña DNA v× thÕ nã c¾t ®îc c¶ 2 chuçi
xo¾n kÐp .
2. Nh÷ng vÞ trÝ mµ 2 chuçi ®îc c¾t thêng kh«ng ph¶i lµ ®èi nghÞch trùc tiÕp v× thÕ nã cã
thÓ c¾t ®îc mét vµi nucleotit ë çc ®Çu cuèi cïng .
C¬ së cña sù xª dÞch nµy lµ sù bæ cøu lÉn nhau cña çc nucleotit .
Mét ®iÒu quan träng cÇn nhí lµ bÊt kú mét c¾t bá nµo bëi enzym giíi h¹n ®Òu x¶y ra ë cïng
mét vÞ trÝ nhËn d¹ng bÊt kÓ nguån gèc cña DNA tõ ®©u (H×nh 2.8.)
H×nh 2.8. ThiÕt lËp mét ph©n tö DNA t¸i tæ hîp ®i tõ 2 vßng DNA xa l¹ . Enym giíi h¹n EcoRI
t¸ch DNA ë c¶ 2 vßng bëi v× mÆc dÇu chóng kh«ng cã quan hÖ víi nhau nhng nh÷ng vßng nµy
vÉn cã çc vÞ trÝ nhËn d¹ng gièng nhau . Çc vßng b©y giê trë nªn th¼ng . T¹i ®iÓm nµy çc
®Çu cã thÓ nèi víi nhau ®Ó t¹o nªn ph©n tö DNA ®¬n dµi . Sù g¾n kÕt nµy ®îc xóc t¸c bëi
DNA Ligaza . Nh÷ng sù liªn kÕt nh thÕ lµ c¬ së cho sù t¸i tæ hîp gen tæng hîp .
Mét ®iÒu n÷a còng rÊt quan träng ®ã lµ vÞ trÝ nhËn d¹ng cã Ýt nhÊt lµ mét trªn bÊt kú mét DNA
nµo ®Ó cho bÊt kú nguån DNA nµo còng cã thÓ sö dông ®îc . Mçi m¶nh DNA cã çc nucleotit
®u ®a (dangling) gäi lµ “®Çu dÝnh-stickly ends” lµ kÕt qu¶ cña sù t¸c ®éng bëi enzym.
Vµ bëi v× çc ®Çu cña chuçi ®¬n lµ bæ cøu cho nhau nªn chóng cã thÓ cÆp ®«i víi nhau hoÆc víi
çc ®o¹n DNA kh¸c cã ®Çu dÝnh bæ cøu. §Æc tÝnh thø hai nµy t¹o cho enzym giíi h¹n trë thµnh
mét c«ng cô v« gi¸ ®èi víi c«ng nghÖ gen –tøc lµ dï nguån gèc DNA cã thÓ lµ cña vi khuÈn,
chim, hoÆc cña c©y mao l¬ng vµ dï dµi ®Õn mÊy ®i n÷a th× thÝ çc ®Çu dÝnh cña çc ®o¹n
DNA nµy vÉn lµ bæ cøu.
2.1.3.Ligaza :
Çc ®o¹n DNA bæ cøu kh«ng thÓ tù liªn kÕt víi nhau . §iÒu ch¾c ch¾n lµ liªn kÕt hydro sÏ
®îc h×nh thµnh gi÷a çc baz¬ bæ cøu . Nhng nh÷ng liªn kÕt nµy kh«ng ®ñ bÒn ®Ó kÕt nèi çc
®u«i nµy víi nhau mét çch v« tËn ®Æc biÖt lµ trong çc ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é sinh lý . §Ó thùc
hiÖn viÖc g¾n l©u dµi çc ®Çu cuèi cña DNA th× ph¶i sö dông mét enzym , ®ã lµ DNA ligaza.

18
LÇn ®Çu tiªn ngêi ta ph©n lËp ®îc mét DNA ligaza tõ bacteriophage T4, nã cã thÓ g¾n çc
bé khung ho¸ häc cña çc chuçi DNA do h×nh thµnh mét liªn kÕt ho¸ häc gi÷a nhãm phot phat
5’tù do cña çc ®o¹n nucleotit víi ph©n tö deoxy ribozacña nucleotit kÕ tiÕp. §ã chÝnh lµ liªn
kÕt phot pho dieste (phosphodiesster bond)-mét liªn kÕt ®ång ho¸ trÞ bÒn v÷ng h¬n liªn kÕt
hydro gi÷a çc baz¬ ni t¬ ®èi nghÞch . Liªn kÕt phot pho dieste tån t¹i ë tÊt c¶ çc nucleotit t¹o
nªn çc ph©n tö DNA míi (H×nh 2.9.)
H×nh 2.9. Çc liªn kÕt ®Ó dÝnh çc ®o¹n DNA víi nhau trong ph©n tö DNA t¸i tæ hîp . Liªn kÕt
hydro lµ liªn kÕt yÕu gi÷a çc baz¬ bæ cøu , cßn liªn kÕt bÒn v÷ng ®îc t¹o bëi Ligaza . Liªn
kÕt nµy nèi çc bé khung cña chuçi DNA .
DNA ligaza ®îc ph©n lËp lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m1960. Nã ch¼ng nh÷ng cã trong çc virut mµ
cßn cã c¶ trong çc tÕ bµo nh©n chuÈn vµ E.Coli. Nã nèi çc ®o¹n DNA víi nhau vµ tham gia
cïng çc enzym kh¸c trong sù tæng hîp DNA .
Enzym nµy còng gióp cho viÖc söa ch÷a DNA do nã g¾n l¹i çc m¶nh vì cña DNA, nhê vËy
mµ lµm håi phôc l¹i çc vÕt th¬ng cña tÕ bµo . Trong c«ng nghÖ DNA nã ®ãng vai trß lµ sù
g¾n kÕt cuèi cïng trong çc chuçi sù kiÖn dÉn ®Õn sù h×nh thµnh mét ph©n tö DNA t¸i tæ hîp
(H4.11)
2.1.4.Plasmid
Nh÷ng n¨m ®Çu cña nh÷ng n¨m 1970, Paul Berg vµ céng t¸c t¹i Trêng §¹i häc Stanford ®·
kh¶o s¸t kh¶ n¨ng sö dông çc enym giíi h¹n ®Ó lµm thay ®æi cÊu tróc cña DNA. Nhãm nghiªn
cøu cña Berg ®· ph©n lËp ®îc NST cña E.Coli vµ c¾t nhá ph©n tö DNA b»ng enzym giíi h¹n .
Tuy nhiªn , DNA cã çc ®u«i ®¬n gi¶n nªn rÊt khã g¾n vµo çc DNA ngo¹i lai ch¼ng h¹n nh
virut (còng t¬ng tù nh viÖc g¾n mét viªn g¹ch vµo cuèi mét bøc têng) .
MÆc dÇu v©þ, nguêi ta ®· th¾ng lîi trong viÖc t¹o ra ph©n tö DNA t¸i tæ hîp ®Çu tiªn. Sau ®ã
Berg ®· ®îc chia gi¶i Nobel ho¸ häc n¨m 1980 do nh÷ng cèng hiÕn cña m×nh .
Còng vµo thêi ®iÓm ®ã cã 2 sù kiÖn ®· x¶y ra lµm mét cuéc çch m¹ng trong c«ng nghÖ DNA
. Sù kiÖn thø nhÊt lµ Herbert Boyer t¸ch chiÕt ®îc enzym gÝ¬i h¹n EcoRI c¾t bá çc
®u«i nh kiÓu th¸o çc lç méng . Sù kiÖn thø hai x¶y ra ë Labo Stanley Cohen thuéc
Trêng §¹i häc Stanford . Cohen ®· thu thËp ®îc çc d÷ liÖu trªn çc vßng DNA nhá bÐ thÊy
ë tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn (kh«ng thÊy ë çc sinh vËt cã cÊu tróc phøc t¹p) . Çc vßng DNA ®ã
chÝnh lµ Plasmid . Plasmid n»m ngoµi NST vi khuÈn vµ chøc n¨ng cña nã cha ®îc hiÓu râ
®Çy ®ñ . Plasmid chøa Ýt th× mét t¸ mµ nhiÒu th× hµng hµng tr¨m gen (vi khuÈn cã kho¶ng vµi
ngµn gen trong NST) nã chiÕm kho¶ng 20% th«ng tin di truyÒn cña c¬ thÓ . Mét ®iÒu râ rµng lµ
plasmid kh«ng cÇn thiÕt cho sù sinh trëng cña vi khuÈn vµ khi lo¹i bá nã ®i th× còng ch¼ng
g©y h¹i g× cho vi khuÈn .

19
H×nh 2.10. Ho¹t tÝnh cña DNA Ligaza . DNA Ligaza g¾n çc ®o¹n DNA víi nhau b»ng çch
liªn kÕt gèc phot phat ë vÞ trÝ 5 cña ®o¹n nµy víi vÞ trÝ 3 cña ph©n tö Deoxyriboza tiÕp theo.
§ã chÝnh lµ liªn kÕt photphodieste. Liªn kÕt nµy ch¾c h¬n liªn kÕt Hydro , nã h×nh thµnh gi÷a
çc nucleotit ®èi dÊu .
N¨m 1972, Cohen thiÕt lËp ®îc mét plasmid míi tõ mét plasmid cã tõ tríc ë E.Coli. Plasmid
míi nµy cã 3 ®Æc tÝnh quan träng :
1.Nã cã mét vÞ trÝ nhËn d¹ng ®¬n lÎ ë chç EcoRI ph©n c¾t , v× thÕ mµ x¸c ®Þnh ®îc n¬i mµ
plasmid sÏ më ra .
2.Cã mét tr×nh tù nucleotit gäi lµ ®iÓm gèc sao chÐp (origin of replication) , tr×nh tù Êy thóc
®Èy sù sao chÐp cña plasmid trong c¬ thÓ tóc chñ .
3.Chøa mét gen kh¸ng tetraxyclin .
V× vËy çc vi khuÈn chøa plasmid nµy th× kh¸ng l¹i tetraxyclin , cßn nh÷ng vi khuÈn kh¸c
kh«ng cã plasmid ®ã sÏ chÕt khi cã mÆt tetraxyclin .Cohen ®Æt tªn plasmid ®ã lµ pSC101
(“SC”tøc lµ Stankey Cohen).
Mét ®Æc trng quan träng kh¸c cña plasmid Cohen lµ dÔ dµng cµi vµo tÕ bµo tóc chñ .
Cohen ®· ph¸t hiÖn ra r»ng cã thÓ cµi çc plasmid vµo çc vi khuÈn míi b»ng çch treo nã
trong dung dÞch Canxi clorua , sau ®ã l¹i nhanh chãng lµm nãng vi khuÈn tíi 42o
C . Víi çch
xö lý nh vËy th× v¸ch vµ mµng sinh chÊt cña vi khuÈn sÏ më ra , cho phÐp plasmid ®i qua ®Ó
vµo tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn . Khi ë bªn trong vi khuÈn th× mét plasmid ®¬n tù nã nh©n lªn ®Ó
t¹o nªn hµng t¸ plasmid míi . NÕu plasmid chøa mét gen ngo¹i lai th× gen nµy ®îc sao chÐp
cïng víi nh÷ng phÇn cßn l¹i cña ph©n tö . V× çc vi khuÈn cã chøa çc plasmid còng ®îc nh©n
lªn – thêng cø 20 phót mét lÇn vµ mçi mét vi khuÈn míi l¹i cã vµi plasmid míi . DÜ nhiªn lµ
tríc ®ã vi khuÈn ®· s¶n sinh hµng triÖu thÕ hÖ con ch¸u råi . Mét quÇn thÓ nh thÕ xuÊt ph¸t tõ
mét tÕ bµo cha mÑ ®îc gäi lµ mét dßng (clone). TÊt c¶ çc tÕ bµo trong cïng mét dßng ®Òu cã
çc plasmid ®ång nhÊt . Còng t¬ng tù nh vËy, hiÖn nay cã hµng triÖu b¶n sao cña cïng mét
gen ngo¹i lai. V× thÕ gen còng ph¶i t¸ch dßng .
Kh«ng ph¶i tëng tîng nhiÒu còng hiÓu ®îc r»ng plasmid lµ çc vËt mang hay lµ çc vec t¬
®èi víi gen ngêi trong çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ DNA.
Giai ®o¹n hiÖn t¹i lµ tËp hîp çc thÝ nghiÖm DNA t¸i tæ hîp ®· lµm thay ®æi tiÕn tr×nh lÞch sö
Ho¸ sinh .
2.2. çc thÝ nghiÖm vÒ DNA t¸i tæ hîp
Theo mét sè sö gia th× nguyªn lý cña c«ng nghÖ DNA gièng nh chiÕc b¸nh sanwich ë bê biÓn
Waikiki .N¨m 1972, x¶y ra sù kiÖn nh sau : khi Herbert Boyer ph¸t biÓu trong mét héi nghÞ

20
khoa häc ë Hawai vÒ enzym giíi h¹n EcoRI th× Stanley Cohen còng tham gia héi nghÞ nhng
víi c¬ng vÞ lµ thÝnh gi¶ . Sau khi kÕt thóc diÔn thuyªt Cohen mêi Boyer ¨n tra vµ béc b¹ch
r»ng hä cã thÓ céng t¸c víi nhau trong hµng lo¹t çc thÝ nghiÖm . Sau ®ã 2 nhµ nghiªn cøu ®·
ngåi l¹i víi nhau vµ xem xÐt çc thÝ nghiÖm ®Ó ®a cång nghÖ DNA vµo mét kû nguyªn míi .
Cohen chØ ®¹o thµnh c«ng çc thÝ nghiÖm víi plasmid , nhng «ng l¹i gÆp khã kh¨n khi c¾t më
réng çc plasmid vµ enzym EcoRI cña Boyer dêng nh lµ mét gi¶i ph¸p lý tëng v× thÕ Cohen
ngá ý cïng hîp t¸c nghiªn cøu . Hä dïng plasmid cña Cohen vµ enzym cña Boyer ®Ó thùc hiÖn
t¸i tæ hîp DNA plasmid .
Tríc tiªn, hä sÏ tiÕn hµnh tæ hîp 2 plasmid ®Ó t¹o nªn mét plasmid ®¬n.NÕu thµnh c«ng hä sÏ
®a DNA ngo¹i lai vµo plasmid ®Ó t¹o nªn mét ph©n tö DNA t¸i tæ hîp . Boyer ®ång ý vµ b¾t
®Çu vµo c«ng viÖc .
Çc thÝ nghiÖm cña Boyer vµ Cohen ®îc tiÕn hµnh vµo n¨m 1973, sau 20 n¨m Watson vµ
Crick c«ng bè trªn b¸o vÒ lÞch sö cÊu tróc DNA . Plasmid mµ Boyer vµ Cohen sö dông lµ
pSC101 (H×nh 2.11.).
H×nh 2.11. ¶nh hiÓn vi ®iÖn tö cña Plasmid vi khuÈn . Lu û r»ng DNA ë d¹ng vßng khÐp kÝn .
Mét sè vßng l¹i níi láng , trong khi ®ã cã çc vßng l¹i so¾n chÆt .
Trong çc thÝ nghiÖm ®Çu tiªn, Boyer vµ Cohen ®· tæ hîp thµnh c«ng pSC101 víi pSC102 vµ
t¸ch dßng víi çc tÕ bµo E.Coli. Çch tiÕp cËn cña hä thËt lµ thó vÞ . Plasmid pSC101 cã mét
gen kh¸ng chÊt kh¸ng sinh kanamyxin . Khi çc plasmid t¸i tæ hîp ®· hîp nhÊt ®îc víi vi
khuÈn th× vi khuÈn nµy béc lé kh¶ n¨ng di truyÒn míi tøc lµ h¹n chÕ ®îc t¸c dông cña c¶
tetraxyclin vµ kanamyxin.
Råi tíi l« thÝ nghiÖm thø hai víi DNA ngo¹i lai (H×nh 2.12)

21
H×nh 2.12. Çc thÝ nghiÖm cña Boyer-Cohen n¨m 1973 .(a) Plasmid pSC101 ®îc më ra b»ng
enzym giíi h¹n EcoRI ë ®iÓm chØ mòi tªn .Plasmid cã chøa gen kh¸ng tetracyclin ®îc m« h×nh
lµ tetr
.(b)DNA tõ cãc Xenopus Laevi còng ®îc xö lý víi EcoRI vµ ®· thu ®îc çc ®o¹n DNA
ngo¹i lai .Lu ý r»ng EcoRI t¸c ®éng ë nh÷ng vÞ trÝ nhËn d¹ng gièng nhau ë vec t¬ Plasmid vµ
ë DNA cho .(c)Çc ®o¹n DNA cho g¾n víi plasmid ®· më vµ x¶y ra sù bæ cøu çc baz¬ . (d)
Khi thªm DNA Ligaza , plasmid sÏ ®ãng l¹i vµ h×nh thµnh ph©n tö DNA t¸i tæ hîp. (e) Plasmid
®îc ®a vµo çc tÕ bµo E.Coli nhËy c¶m víi tetracyclin (tets) b»ng çch xö lý tÕ bµo víi hîp
chÊt can xi . Çc tÕ bµo E.Coli ®· biÕn n¹p . Çc plasmid sÏ nh©n lªn trong tÕ bµo vµ m· cho
çc protein chuyªn ho¸ bëi DNA cña cãc .(f) Khi vi khuÈn ®îc nu«i cÊy trong m«i Trêng cã
tetracyclin th× çc tÕ bµo cã chøa plasmid t¸i tæ hîp sÏ ph¸t triÓn vµ t¹o çc khuÈn l¹c . §iÒu
®ã x¶y ra bëi v× nã cã gen kh¸ng l¹i tetracyclin .Vi khuÈn cã chøa plasmid b×nh thêng kh«ng
cã gen kh¸ng tetracyclin sÏ kh«ng t¹o ®ù¬c khuÈn l¹c trong m«i trêng .
Boyer vµ Cohen thu thËp mét gen tõ çc tÕ bµo cãc Ch©u Phi Xenopus Laevis .Gen nµy m· ho¸
cho mét ®o¹n protein dïng ®Ó tæng hîp RNA riboxom . Hä sö dông EcoRI ®Ó c¾t DNA cña cãc
, sau ®ã còng dïng enzym nµy ®Ó më plasmid pSC101. Së dÜ dïng EcoRI cho c¶ hai bëi v× çc
®u«i cña chóng ®Òu t¬ng tù nhau. Çc ®o¹n DNA cña cãc ®îc trén víi DNA plasmid vµ sù
cÆp ®«i gi÷a çc baz¬ bæ cøu x¶y ra trªn c¶ 2 ®o¹n DNA . Thªm DNA ligaza vµo th× çc
plasmid ®îc t¸i sinh tuÇn hoµn trõ trêng hîp b©y giê plasmid l¹i chøa çc DNA ®· ®îc cµi
vµo tõ cãc .Çc nhµ nghiªn cøu gäi plasmid t¸i tæ hîp nµy lµ Chimera.
TiÕp theo , ngêi ta xem xÐt kh¶ n¨ng m· ho¸ protein cña çc DNA ngo¹i lai . B»ng çch sö
dông çc kü thuËt tiªu chuÈn Cohen ®· ®a plasmid vµo trong çc tÕ bµo E.Coli vµ ®Æt vi khuÈn
vµo m«i trêng ®Ó ph¸t triÓn .Vi khuÈn vµ plasmid t¸i tæ hîp cña chóng ®îc sao chÐp tõng
phót vµ tríc ®ã çc tÕ bµo E.Coli ®· t¹o ra thªm mét protein cho RNA riboxom mµ th«ng
thêng protein nµy chØ ®îc t¹o nªn tõ çc tÕ bµo cña cãc .ë ®©y E.Coli ®· tæng hîp nªn
protein cña nã vµ tæng hîp thªm c¶ protein cña c¬ thÓ kh¸c (X .laevis) .
Çc ph¬ng tiÖn truyÒn th«ng quèc gia ®· cæ ®éng cho nh÷ng thµnh c«ng cña Boyer vµ
Cohen.Thùc chÊt hai nhµ khoa häc nµy ®· ph¸ vì hµng rµo ng¨n çch gi÷a çc mÉu sinh häc
t¸ch biÖt vµ më ra mét kû nguyªn míi hiÖn ®¹i cña cång nghÖ DNA . V× vËy mét quan s¸t

22
viªn ®· ghi chó nh sau C«ng nghÖ sinh häc tríc Cohen ( BBC Before Boyer-Cohen) vµ
nay lµ sau Cohen ( ABC tøc lµ After Boyer-Cohen)
Çc nhµ sinh häc ®· nhanh chãng xem xÐt çc mèi liªn quan cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp vµ
khÈn tr¬ng tiÕn hµnh çc thÝ nghiÖm thao t¸c gen .Vµ chØ trong mÊy tuÇn çc nhµ khoa häc ®·
ph¸t hiÖn ra sù chuyÓn gen vµ cè g¾ng vît qua çc ph©n çch vÒ mÉu .Trong mét thÝ nghiÖm
ngêi ta ®· chuyÓn gen cña Staphylococcus Aureus cho E.Coli. Çc nhµ khoa häc kh¸c l¹i cã ý
®Þnh ph©n lËp çc gen ngêi vµ ®a vµo plasmid cña vi khuÈn . Cßn sè kh¸c th× ®i s©u vµo çc
mèi liªn quan chÆt chÏ gi÷a çc thÝ nghiÖm trong c«ng nghÖ DNA . Ch¼ng h¹n nh ngêi ta suy
luËn r»ng çc gen cã thÓ ®îc ®a vµo çc tÕ bµo sèng ®Ó gi¶i to¶ sù thiÕu hôt di truyÒn còng
nh cã thÓ t¹o ®îc mét lîng lín protein dîc phÈm hiÕm .
Ngêi ta íc väng cã ®îc nh÷ng nguån n¨ng lîng sinh häc rÎ tiÒn hay trÎ em sinh ra kh«ng
bÞ khuyÕt tËt. Dêng nh kh«ng cã giíi h¹n trong nÒn c«ng nghÖ míi nµy .
VÒ ph¬ng diÖn kü thuËt Trong Gen trÞ liÖu ngêi ta sö dông 2 ph¬ng ph¸p chuyÓn gen :
Ph¬ng ph¸p chuyÓn gen ngoµi c¬ thÓ (ex vivo ) vµ ph¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp vµo c¬
thÓ (in vivo) .
Mét sè kü thuËt thêng dïng trong gen trÞ liÖu lµ : Kü thuËt vi tiªm , Kü thuËt ®iÖn xung , kü
thuËt b¾n gen , kü thuËt liposom , kü thuËt viªn gen v.v.. Nh÷ng vÊn ®Ò nµy chóng ta sÏ bµn
luËn sau .
2.3.Nh÷ng bµn c i vÒ tÝnh an toµn trong gen trÞ liÖu.
MÆc dï sèt s¾ng víi c«ng nghÖ DNA nhng nhiÒu nhµ khoa häc ®· c¶nh b¸o vÒ nh÷ng hËu qu¶
nguy hiÓm cña c«ng nghÖ nµy ®· gîi ý cÇn ph¶i thËn träng h¬n víi çc xu híng nghiªn cøu .
Ch¼ng h¹n nh ®· cã sù b¸o ®éng khi nhãm nghiªn cøu cña Paul Berg dù ®Þnh ®a mét gen tõ
virut g©y ung th vµo E.Coli.Çc ®ång nghiÖp cña «ng ®· v¹ch ra rµnh m¹ch r»ng çc tÕ bµo
E.Coli t¸i tæ hîp tõ phßng thÝ nghiÖm khi ®· vµo c¬ thÓ ngêi (ë ®ã chóng vÉn sèng mét çch
b×nh thêng) th× nã sÏ biÓu lé çc gen ung th . Berg ®· ph¶i xem xÐt nh÷ng lêi ph¶n ®èi ®ã vµ
®· huû bá thÝ nghiÖm nµy .
Nhng nh÷ng vÊn ®Ò vÒ tÝnh an toµn vÉn lu«n ®îc ®Æt ra . ChØ míi gÇn ®©y th«i çc nhµ sinh
häc ph©n tö l¹i b¾t ®Çu th¶o luËn vÒ çc vÊn ®Ò liªn quan ®Õn c«ng nghÖ DNA trong mét héi
nghÞ ®îc tæ chøc díi sù b¶o trî cña viÖn hµn l©m khoa häc quèc gia .Tíi n¨m 1974 , mét sù
kiÖn cha hÒ thÊy ®· x¶y ra , ®ã lµ mét bøc th cã c¶ ch÷ ký cña Paul Berg vµ 9 nhµ khoa häc
kh¸c xuÊt hiÖn ®ång thêi trªn 3 t¹p chÝ khoa häc uy tÝn nhÊt ThÕ giíi viÕt b»ng tiÕng Anh ®ã lµ
Science, Nature vµ Proceedings of the National Academy of Science. Bøc th ®· chØ râ çc
nguy h¹i tiÒm tµng cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp . Bøc th cã ®o¹n viÕt:
Nh÷ng tiÕn bé míi ®©y trong kü thuËt ph©n lËp vµ ghÐp nèi çc ®o¹n DNA tíi nay ®· cho
phÐp kiÕn t¹o çc ph©n tö DNA cã ho¹t tÝnh sinh häc in vitro.
MÆc dï nh÷ng thÝ nghiÖm nµy cã vÎ t¹o thuËn lîi cho çc gi¶i ph¸p vÒ çc vÊn ®Ò thùc tiÔn vµ
lý thuyÕt quan träng trong sinh häc nhng viÖc t¹o nªn çc d¹ng DNA míi mµ b¶n chÊt sinh
häc cña çc phÇn tö cña chóng kh«ng thÓ dù ®o¸n ®îc mét çch ®Çy ®ñ
Cã mét vÊn ®Ò liªn quan rÊt nghiªm tóc lµ mét sè trong çc ph©n tö DNA nµy cã thÓ ®îc
chøng minh lµ cã nguy h¹i vÒ mÆt sinh häc

23
H×nh 2.13. C«ng nghÖ DNA víi viÖc t¸ch dßng gen ngêi vµ çc s¶n phÈm protein s¶n xuÊt víi
sè lîng lín ®îc m· ho¸ bëi gen nµy.
Bøc th tiÕp tôc hái ý kiÕn çc nhµ sinh häc ph©n tö trªn toµn ThÕ giíi liÖu cã “tù nguyÖn tr×
ho·n”mét sè thÝ nghiÖm vÒ DNA cho tíi khi cã mét héi nghÞ quèc tÕ nhãm häp ®Ó th¶o thuËn
vÒ çc nguy h¹i cã thÓ vµ çc biÖn ph¸p b¶o vÖ cÇn thiÕt hay kh«ng?
Çc nhµ khoa häc còng nh¾c nhë cÇn ph¶i thËn träng víi çc thÝ nghiÖm cã liªn quan tíi viÖc
®a mét gen kh¸ng chÊt kh¸ng sinh vµo plasmid vµ g¾n mét gen ung th vµo bÊt kú mét ph©n tö
chÊt mang DNA nµo .
§©y lµ lÇn ®Çu tiªn çc nhµ khoa häc thuéc nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau ®ßi h¹n chÕ çc nghiªn
cøu mÆc dï ch¼ng cã b»ng chøng nµo chøng minh nã lµ nguy hiÓm .
MÆc dï qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp kh«ng vi ph¹m luËt ph¸p , nhng çc nhµ khoa häc toµn ThÕ giíi
vÉn ph¶i ®¨ng ký çc dù ®Þnh trong çc thÝ nghiÖm khoa häc cña m×nh.Th¸ng 2-1975 , mét
nhãm gåm 139 nhµ nghiªn cøu tõ 17 quèc gia ®· häp mÆt trong 4 ngµy ë Asilomar , mét
trung t©m vÒ héi nghÞ ë Pacific Grove , California nh»m ®a ra nh÷ng híng dÉn vµ çc khuyÕn
ço cho viÖc chØ ®¹o çc thÝ nghiÖm trong c«ng nghÖ DNA . Mét trong sè nh÷ng ®iÒu tríc
tiªn nh÷ng cö to¹ ph¶i lµm lµ cam ®oan víi c«ng chóng r»ng vi khuÈn dïng cho çc thÝ nghiÖm
DNA tÊi tæ hîp lµ nh÷ng nßi ®Æc biÖt vµ “®· gi¶i trõ qu©n bÞ” nªn chóng kh«ng cßn tån t¹i
ngoµi phßng thÝ nghiÖm . Çc nhµ khoa häc còng vËt lén víi t×nh tr¹ng khã xö nhÊt ®ã lµ thiÕu
çc b»ng chøng ®Ó hoÆc ñng hé hoÆc ph¶n ®èi vÒ b¶n chÊt g©y nguy h¹i cña çc c«ng tr×nh vÒ
DNA .
Cuèi cïng , çc nhµ nghiªn cøu ®· chän biÖn ph¸p nh¾c nhë vµ ho¹ch ®Þnh chÝnh s¸ch cho çc
c«ng tr×nh cña hä . Çc thÝ nghiÖm DNA t¸i tæ hîp ph¶i lu«n xem xÐt tíi çc rñi ro ë çc møc
®é thÊp, trung b×nh vµ cao vµ quyÕt ®Þnh r»ng bÊt kú mét thÝ nghiÖm nµo mµ cã rñi ro (nh Berg

24
®· nªu) ®Òu ph¶i ®îc chØ ®¹o mét çch chÆt chÏ cho tíi khi cã mét ph¬ng ph¸p tèt h¬n .
ChiÕn lîc nµy bao hµm c¶ trong lÜnh vùc vËt lý còng nh sinh häc vµ u tiªn nhiÒu cho viÖc
ph¸t triÓn çc chñng vi khuÈn kh«ng cã kh¶ n¨ng sèng ë bªn ngoµi phßng thÝ nghiÖm .
KhuyÕn ço Asilomar dÉn tíi viÖc h×nh thµnh mét Uû ban cè vÊn vÒ DNA t¸i tæ hîp t¹i viÖn
søc khoÎ quèc gia Hoa kú(NIH). Uû ban nµy sÏ ®a ra çc híng dÉn ®Çy ®ñ song song víi çc
khuyÕn ço Asilomar.N¨m th¸ng tr«i qua , mäi ®iÒu ®· ®îc s¸ng tá tríc c«ng chóng lµ çc
nhµ nghiªn cøu vÒ DNA kh«ng xa rêi çc ®¹o luËt x· héi.
2.4.T¬ng lai cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp
Nh÷ng thÝ nghiÖm ®îc thùc hiÖn n¨m 1972 vµ nh÷ng n¨m sau ®ã ®· t¸c ®éng s©u s¾c tíi çch
suy nghÜ cña çc nhµ di truyÒn häc . Tríc nh÷ng thµnh c«ng vÒ çc thÝ nghiÖm t¸ch gen , çc
nhµ di truyÒn häc suy luËn qua çc nghiªn cøu cña m×nh r»ng tÊt c¶ nh÷ng ®iÒu mµ hä hiÓu vÒ
®Æc ®iÓm vµ sù biÓu hiÖn cña gen cho tíi giê hä ®Òu cã thÓ thao t¸c ®îc . C«ng nghÖ DNA
cho phÐp çc nhµ di truyÒn häc hiÓu ®îc cÊu tróc , chøc n¨ng còng nh sù ®iÒu hoµ gen vµ b¾t
®Çu ®i s©u vµo di truyÒn Ho¸ sinh çc bÖnh l·o khoa .
§i ®«i víi nh÷ng th¾ng lîi trong c«ng nghÖ DNA th× ®ång thêi còng xuÊt hiÖn thªm çc nguyªn
lý cña c«ng nghÖ sinh häc . C«ng nghÖ sinh häc lµ mét nÒn c«ng nghiÖp réng lín vµ hoµn toµn
míi trong ®ã sinh häc ph©n tö cã thÓ tham gia gi¶i quyÕt çc vÊn ®Ò vÒ « nhiÔm, çc chÒ phÈm
thùc phÈm , n¨ng lîng vµ sù tæng hîp çc lo¹i dîc phÈm míi . Çc nhµ Ho¸ sinh sím ®Ó ý tíi
vi khuÈn , coi ®ã lµ çc nhµ m¸y ho¸ häc t¬ng lai vµ suy luËn r»ng cã thÓ lËp ch¬ng tr×nh cho
DNA ®Ó tæng hîp mét sè lîng kh«ng h¹n chÕ çc chÊt cã ý nghÜa ®èi víi c«ng nghiÖp , kinh tÕ
vµ y häc.
Sau nh÷ng n¨m 1970, mét sè høa hÑn ®· thµnh hiÖn thùc, nhiÒu nhµ m¸y ®· b¾t ®Çu ¸p dông kü
thuËt DNA ®Ó s¶n xuÊt nhiÒu s¶n phÈm h÷u Ých. Ch¼ng h¹n nh n¨m 1980, mét c«ng ty ®· thu
®îc insulin tõ vi khuÈn t¸i tæ hîp víi nh÷ng gen cña çc tÕ bµo tuþ ngêi . Mét c«ng ty kh¸c
còng ®· sö dông çc tÕ bµo vi khuÈn ®Ó t¹o ra interferon –mét chÊt øc chÕ virut mµ th«ng
thêng chØ ®îc t¹o ra tõ çc tÕ bµo cña ngêi . NhiÒu c«ng ty kh¸c còng ®· t¸i tæ hîp DNA
trong vi khuÈn ®Ó cho vi khuÈn nµy cã thÓ t¹o nªn çc chÊt nh hormon sinh trëng cña ngêi ,
hay mét vacxin cho mét bÖnh nµo ®ã cña ®éng vËt hoÆc çc enzym hoµ tan trong dÇu
Trong nh÷ng n¨m 1980, nhiªu s¶n phÈm kh¸c cña c«ng nghÖ DNA ®îc dù b¸o lµ hiÖn thùc
hoÆc lµ cã kh¶ n¨ng trë thµnh hiÖn thùc . Çc vi khuÈn t¸i tæ hîp ®îc dïng trong viÖc lo¹i th¶i
çc chÊt ®éc h¹i , hoµ tan çc chÊt khã tan trong níc nh tãc ch¼ng h¹n . Vi khuÈn t¸i tæ hîp
®· tæng hîp ®îc çc enzym hoµ tan côc m¸u ®«ng cña ngêi lµ Urokinaza vµ hormon cña thËn
lµ erythropoietin . Hµng tr¨m c«ng ty trªn ThÕ giíi ®· øng dông c«ng nghÖ DNA trong c«ng
nghiÖp .
NhiÒu nhµ khoa häc ®· ph¸t biÓu mét çch l¹c quan vÒ mét t¬ng lai trong ®ã sù thô tinh sÏ lµ
lçi thêi , thùc vËt cã thÓ sö dông çc ®éc tè vi khuÈn ®Ó xua ®uæi c«n trïng vµ hoa mµu cã thÓ
®îc trång cÊy mµ kh«ng bÞ ph¸ h¹i cña s¬ng gi¸ .
Tíi nh÷ng n¨m 1990, çc nhµ nghiªn cøu ®· ®i qu¸ xa so víi viÖc cµi mét DNA ngo¹i lai vµo
çc tÕ bµo vi khuÈn vµ c«ng nghÖ DNA ®· ph¸t triÓn trong rÊt nhiÒu lÜnh vùc . Ch¼ng h¹n nh
in dÊu v©n DNA lµ mét d¹ng míi cña ph¸p y ®· ®îc çc hÖ thèng ph¸p luËt chÊp thuËn .
Trong gen trÞ liÖu con ngêi ®· ®îc truyÒn vµo çc gen ngo¹i lai ®Ó ch÷a çc bÖnh .Hay ®éng
vËt biÕn ®æi gen cã ®îc hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi .Råi dù ¸n t×m hiÓu tr×nh tù Baz¬ çc
gen ®¬n cña ngêi
H¬n bÊt kú mét kü thuËt nµo kh¸c , c«ng nghÖ DNA sÏ cho nh©n lo¹i c¬ héi lµm chñ ®îc
nh÷ng ph©n tö ®· t¹o nªn chÝnh hä. CÊc nhµ khoa häc thÝch thó khi con ngêi cµng hiÓu râ h¬n
n÷a vÒ c¬ thÓ m×nh còng nh çc ®éng t¸c nh bß, b¬i léi , ch¹y nh¶y hay bay lîn v.v..
Khã thÊy nh÷ng vÊn ®Ò vÒ sù tån t¹i cña con ngêi mµ l¹i kh«ng ®ông tíi c«ng nghÖ DNA còng
nh çc vÊn ®Ò chÝnh trÞ næi lªn ®ßi hái ph¶i cã çc gi¶i ph¸p cã tÝnh toµn cÇu.Ch¼ng h¹n nh
liÖu c«ng nghÖ DNA cã cho phÐp ®Ó gen can thiÖp vµo viÖc “c¶i biÕn gièng nßi” hay kh«ng?
Hay çc vÊn ®Ò thuéc ®¹o ®øc , nh÷ng b¨n kho¨n vÒ tinh thÇn sÏ cßn cßn tõng bíc n¶y sinh
trªn con ®êng ®i tíi cña DØ truyÒn häc .
Nhng cã mét ®iÒu mµ ai còng ph¶i thõa nhËn lµ c«ng nghÖ DNA ®· ®i vµo cuéc sèng con
ngêi vµ trë thµnh mét trong nh÷ng øng dông cã tÝnh thuyÕt phôc nhÊt .
2.5.Nh÷ng tiÕn bé ®¸ng kÓ trong gtl hiÖn nay :
*Nhãm nghiªn cøu Trßng §¹i häc California , Los Angeles sö dông Liposome ®îc bao
polyme Polyethylen glycol (PEG) ®Ó ®a vµo n·o . ViÖc chuyÓn gen vµo çc tÕ bµo n·o lµ mét
thµnh c«ng rÊt cã ý nghÜa bëi v× çc vec t¬ virut lµ qu¸ lín ®· vît qua ®îc hµng rµo gi÷a n·o
vµ m¸u . Thµnh c«ng nµy ®· t¹o tiÒm n¨ng cho viÖc trÞ çc bÖnh Parkinson .(20/3/2003 New
Scientist .Com –March 20, 2003 ).
*Sù can thiÖp cña RNA hay çc gen lÆn cã thÓ lµ mét ph¬ng ph¸p míi ®Ó ®iÒu trÞ bÖnh
Huntington. ( New Scientist . Com –March 13, 2003).

25
*Phong ph¸p TLG theo çch söa ch÷a nh÷ng sai sãt trong RNA th«ng tin cña çc gen khiÕm
khuyÕt . Kü thuËt nµy lµ tiÒm n¨ng ®iÒu trÞ çc bÖnh vÒ m¸u nh bÖnh thiÕu m¸u vïng biÓn ,
bÖnh x¬ nang ( mét bÖnh di truyÒn t¸c ®éng tíi çc tuyÕn ngo¹i tiÕt ) vµ mét sè bÖnh ung th .
( New Scientist ,Com –october 11, 2002.)
*TLG dïng trong ®iÒu trÞ bÖnh X-SCID . Tuy nhiªn , viÖc nµy ®· dõng l¹i khi mét bÖnh nh©n ë
Ph¸p bÞ m¾c bÖnh b¹ch cÇu (Leukemia) . (New Scientist .Com – October 3, 2003).
*Çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §H Case Western vµ Copernicus Therapeutics cã thÓ t¹o ®îc
çc liposome nhá tíi 25 nanomet , nã cã thÓ mang DNA trÞ liÖu qua çc lç ë nh©n tÕ bµo (New
Scientist . Com – May 12, 2002)
*Çc tÕ bµo h×nh lìi liÒm ®· ®iÒu trÞ thµnh c«ng trªn chuét ( The Science –March 18, 2002).
Ch¬ng III
Çc ph¬ng ph¸p cña c«ng nghÖ DNA
3.1.Thu thËp gen
Çc tÕ bµo cña c¬ thÓ sèng bao gåm hµng ngh×n gen hoÆc nhiÒu h¬n n÷a.C¬ thÓ chóng ta cã tíi
100.000 gen trong bé gen (genome ).NÕu chØ cÇn nghiªn cøu mét gen ®¬n th× nhiÖm vô cña
nhµ Ho¸ sinh còng rÊt lín bëi v× mét gen còng ®· cã tíi hµng ngh×n milimet chiÒu dµi DNA .
Tuy nhiªn, c«ng viÖc nµy trë nªn thËt ®¬n gi¶n nhê sö dông mét enzym c¾t giíi h¹n(restriction
enzyme) , çc enzyme nµy cã thÓ c¾t çc ph©n tö DNA ë çc vÞ trÝ ®Æc hiÖu , ®iÒu ®ã cho phÐp
çc nhµ sinh Ho¸ t¸ch riªng ®îc çc ®o¹n DNA.ViÖc sö dông nhiÒu enzym giíi h¹n ®· lµm
t¨ng kh¶ n¨ng nghiªn cøu çc gen n»m trªn nh÷ng ®o¹n DNA nµy .
Tuy nhiªn nhê sö dông çc ph©n tö RNA th«ng tin (mRNA) nªn còng kh«ng cÇn thiÕt ph¶i t×m
b»ng ®îc mét gen ®Æc hiÖu trong çc ®o¹n DNA . Nh ta biÕt , biÓu hiÖn gen th«ng qua sù
tæng hîp protein trong tÕ bµo liªn quan tíi sù m· ho¸ cña çc ph©n tö mRNA . Khi ta muèn
t¸ch mét gen tæng hîp protein X th× ta ph¶i t×m kiÕm çc tÕ bµo ho¹t ho¸ t¹o nªn protein X ®Ó
t¸ch ra çc ph©n tö mRNA tõ tÕ bµo chÊt cña tÕ bµo .Khi ®· x¸c ®Þnh ®îc chÝnh x¸c çc tÕ bµo
cÇn nghiªn cøu , lóc nµy ta ph¸ vì tÕ bµo , çc thµnh phÇn cña tÕ bµo ®îc xö lý b»ng hµng lo¹t
çc ph¬ng ph¸p lý ho¸ häc vµ thu ®îc çc chÊt nh protein, çc chÊt bÐo, carbohydrat vµ acid
nucleic . Çc ph©n tö mRNA ®îc thu thËp nhê lîi thÕ cña çc ®u«i poly-A (poly –A tails),
phÇn RNA cã tíi 150-200 nucleotit chøa adenin (v× thÕ míi cã tªn lµ poly A) . PhÇn lín mRNA
®Òu g¾n víi çc h¹t xenluloza mµ trªn bÒ mÆt cña chóng cã nhiÒu m¶nh acid nucleic chøa
thimin “poly –T”. Çc m¶nh vì cßn l¹i sÏ ®îc röa ®Ó lo¹i ®i . Vµ b©y giê cã thÓ thu thËp çc
ph©n tö mRNA tõ çc h¹t xenluloza ®Ó cã ®îc mRNA c« ®Æc .
Sau khi ®· cã ®îc mRNA tinh khiÕt th× nh÷ng th«ng tin Ho¸ sinh mµ nã chøa ®ùng cã thÓ
chuyÓn ngîc l¹i trong DNA . §Ó thùc hiÖn ®îc bíc nµy , çc tr×nh tù cña çc baz¬ ni t¬
trong mRNA ®îc sö dông nh mét çi khu«n ®Ó tæng hîp çc tr×nh tù baz¬ bæ cøu trong DNA
. Mét enzym gäi lµ Enzym phiªn m· ngîc (Reverse transcriptase) gióp cho viÖc tæng hîp nµy
. Chóng ta nhí l¹i r»ng vµo nh÷ng n¨m 1970 Howard Temin vµ David Baltimore ®· ph¸t
hiÖn ra vÒ enzym phiªn m· ngîc , ngêi ta sö dông RNA nh mét çi khu«n ®Ó tæng hîp mét
ph©n tö DNA bæ cøu . Khi sö dông enzym phiªn m· ngîc ®Ó t¹o nªn çc ph©n tö DNA th× ®ßi
hái ph¶i cã mét chÊt måi (Primer)-hay lµ cÇn sù cã mÆt cña çc tr×nh tù nucleotit khëi ®Çu .

26
ChÊt måi nµy bao gåm çc chuçi nucleotit cña Thimin (polyT), çc chuçi nµy g¾n víi ®u«i poly
A cña mRNA vµ ho¹t ®éng nh mét vÞ trÝ khëi ®Çu cho sù tæng hîp DNA. Sau ®ã reverse
transcriptase dÞch chuyÓn däc theo çc ph©n tö mRNA m· ho¸ cho mét ph©n tö DNA bæ cøu
víi mRNA ( complementary DNA= cDNA) .PhÇn cuèi cDNA cã mét nucleotit vßng xo¾n
ng¾n ®îc ®a vµo nhê mét enzym , lý do t¹i sao vÉn cha râ .NÕu chuçi ®¬n cDNA lµ phï hîp
víi mong muèn th× vßng xo¾n nucleotit nµy sÏ ®îc lo¹i bá bëi enzym nucleaza vµ cDNA cã
thÓ t¸ch khái çc khu«n mRNA ë d¹ng tinh khiÕt.
H×nh 3.1. Ph¬ng ph¸p chung ®Ó t¹o DNA bæ cøu (cDNA) (a) çc tÕ bµo tæng hîp protein nh
çc tÕ bµo tuþ ®îc gi÷ cÈn thËn vµ mRNA ®îc t¸ch chiÕt ra tõ nh÷ng tÕ bµo nµy , (b)mRNA
®îc xö lý víi enzym Transcriptaza ngîc . Enzym nµy sö dông nh÷ng m· baz¬ ni t¬ trong
RNA ®Ó tæng hîp chuçi bæ cøu cña DNA . cDNA sau ®ã l¹i dïng ®Ó tæng hîp mét chuçi DNA
bæ cøu víi chuçi thø nhÊt .
§Ó t¹o ®îc mét gen ®Ó lång vµo tÕ bµo , ngêi ta ph¶i t¹o ra çc ph©n tö DNA chuçi kÐp . §Ó
hoµn tÊt qu¸ tr×nh nµy , vßng xo¾n nucleotit ph¶i ®îc ®Æt ®óng chç , khi ®ã ph¶i dïng enzym
DNA Polymeraza . Enzym nµy sö dông nucleotit vßng nh mét chÊt måi vµ di chuyÓn xuèng
ph©n tö DNA . Sö dông ph©n tö nµy nh mét çi khu«n ®Ó tæng hîp ph©n tö DNA bæ cøu . Lóc
nµy vßng xo¾n ®îc lo¹i ®i nhê nucleaza vµ kÕt qu¶ lµ ®îc mét ph©n tö cDNA xo¾n kÐp
t¬ng tù nh gen m· ho¸ nguyªn gèc ph©n tö mRNA .
Tuy nhiªn , ph©n tö cDNA kh«ng cã intron (trong gen nguyªn gèc th× vÉn cã) mµ nã chØ chøa
çc exon ( H×nh 3.2)

27
H×nh 3.2. Sù h×nh thµnh mét ph©n tö cDNA chuçi kÐp (bíc 1)RNA chÝn ®îc ph©n lËp víi
®u«i poly-A trong phßng thÝ nghiÖm . Transcriptaza ngîc vµ Deoxynucleotit ®îc sö dông ®Ó
tæng hîp DNA bæ cøu (cDNA) trong ®ã cã ®u«i poly-T bæ cøu .(Bíc 2) ph©n tö RNA ®îc
ph©n huû bëi kiÒm , cÆn cDNA cã çc vßng h×nh çi kÑp tãc ë ®Çu 3 .(Bíc3) cDNA võa
®ãng vai trß lµ khu«n võa lµ primer cho sù tæng hîp mét chuçi cDNA bæ cøu .(Bíc4) vßng
h×nh cÆp tãc vÉn g¾n víi nh©n ®Ó t¹o mét cDNA chuèi kÐp phï hîp ®Ó cµi vµo mét vec t¬. Çc
cDNA chØ cã çc Exon.
§Ó cho çc cDNA cã chøc n¨ng trong çc tÕ bµo nhËn , çc ph©n tö nµy ph¶i cã kh¶ n¨ng tù
nh©n ®«i. Díi çc ®iÒu kiÖn b×nh thêng , çc ®o¹n DNA ngÉu nhiªn kh«ng t¸i b¶n ®îc
trong tÕ bµo sèng .Lý do lµ enzym DNA polymeraza chØ ®îc khëi ®éng nÕu cã mÆt mét tr×nh
tù ®Æc biÖt cña çc baz¬ lµ çc gèc sao chÐp ( origin of replication) . Mµ çc origin of
replication l¹i ®îc cung cÊp bëi çc DNA chÊt mang (carrier) , n¬i mµ çc cDNA g¾n vµo .
Çc chÊt mang (carrier) thêng lµ çc vec t¬.
3.2.Sù lùa chän çc vec t¬.
§èi víi çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ DNA th× çc vec t¬ thêng ®îc dïng lµ çc plasmid.
Plasmid lµ mét DNA d¹ng vßng khÐp kÝn n»m ngoµi NST . §¸ng quan t©m lµ çc plasmid cña
vi khuÈn (H ×nh 3.3.) , cßn víi çc tÕ bµo nh©n chuÈn nh çc tÕ bµo ®éng vËt vµ thùc vËt th×
kh«ng cã plasmid .

28
H×nh 3.3. ¶nh.hiÓn vi ®iÖn tö hiÖn râ plasmid nh lµ mét ph©n tö DNA §iÒu hoµ . Trong
h×nh Plasmid lµ nh÷ng vßng nhá .Ph©n tö DNA ®îc ph©n lËp tõ lôc l¹p cña c©y xanh cã cÊu
tróc vßng lín ë gi÷a h×nh.
Chøc n¨ng cña plasmid cha ®îc hiÓu ®Çy ®ñ . Tuy nhiªn çc nhµ khoa häc x¸c nhËn r»ng
plasmid kh«ng cÇn cho sù tån t¹i cña tÕ bµo . Vµo nh÷ng n¨m 1970, çc nhµ khoa häc Stanley
Cohen vµ çc céng t¸c ®· ph¸t hiÖn r»ng plasmid cã thÓ ®îc më ra vµ g¾n ®îc vµo çc ®o¹n
DNA ®Ó t¹o nªn plasmid t¸i tæ hîp hay cßn gäi lµ chimera . Çc chimera chøa çc origin of
replication ®ßi hái bëi DNA polymeraza.Qu¸ tr×nh g¾n thªm mét ®o¹n cDNA vµo plasmid ph¶i
sö dông rÊt nhiÒu enzym giíi h¹n . Çc enzym giíi h¹n qóet trªn çc xo¾n kÐp cña plasmid cho
tíi khi nhËn ra ®îc tr×nh tù baz¬ ®Æc hiÖu . Sau ®ã plasmid ®îc më ra ë d¹ng ngo»n ngßeo ,
lo¹i ®i 4 baz¬ trªn mçi sîi ®· bÞ c¾t . 4 baz¬ nµy g¾n láng lÎo víi çc baz¬ bæ cøu trªn ph©n tö
cDNA ®· ®îc më .TiÕp theo, enzym ligaza g¾n bé khung ph«t ph¸t , ®êng cña plasmid vµ
cDNA. Ngêi ta lÊy DNA ligaza tõ bacteriophage T4 ®Ó t¹o ra liªn kÕt bÒn v÷ng vµ lµm æn
®Þnh chimera ®Ó ®a vµo çc tÕ bµo tiÕp nhËn míi .
Plasmid cµng nhá cµng cã lîi cho c«ng nghÖ DNA v× plasmid nhá Ýt bÞ h h¹i h¬n çc plasmid
lín khi tr¶i qua qu¸ tr×nh ph©n lËp.H¬n n÷a, mét plasmid nhá cã thÓ g¾n víi tÕ bµo vËt chñ h÷u
hiÖu h¬n. Giíi h¹n vÒ kÝch cì plasmid ph¶i tÝnh sao cho çc ph©n tö cDNA kh«ng qu¸ lín cã
thÓ ®îc cµi vµo .
Theo chøc n¨ng çc gen trªn plasmid ngêi ta chia ra nhiÒu lo¹i plasmid nh plasmid giíi tÝnh
(F) , plasmid kh¸ng kh¸ng sinh (R) , plasmid col (cã gen m· ho¸ Colicin)... Plasmid ph¸t hiÖn
®Çu tiªn ë E.Coli cã ký hiÖu lµ ColE1.Tõ çc plasmid tù nhiªn ph©n lËp ®îc ngêi ta ®· t¹o
nªn nhiÒu thÕ hÖ plasmid nh©n t¹o kh¸c nhau víi nhiÒu ®Æc ®iÓm quÝ thuËn lîi cho viÖc t¸ch
dßng .
Plasmid thÕ hÖ thø nhÊt lµ nh÷ng plasmid ®Çu tiªn ®îc sö dông ®Ó t¸ch dßng vec t¬ pSC101
(Stanley&Cohen ,1973),ColE1(Hershfield,1974) .
Plasmid thÕ hÖ thø hai ®îc t¹o ra b»ng çch tËp hîp çc ®Æc tÝnh quÝ cña nhiÒu plasmid tù
nhiªn hoÆc g¾n thªm çc gen chØ thÞ ®Ó ®îc mét plasmid míi . Tiªu biÓu cho plasmid thÕ hÖ
nµy lµ pBK322 (Bolivar vµ céng t¸c ,1977). Plasmid pBK322 cã kh¶ n¨ng t¸i b¶n cao , cho
phÐp g¾n çc ®o¹n DNA cã tíi 6kb vÉn ho¹t ®éng b×nh thêng .
Plasmid thÕ hÖ thø ba lµ nh÷ng plasmid m¹nh ,kÝch thíc rÊt nhá vµ mét polylinker
(polycloning site ) rÊt ®îc a chuéng trong c«ng nghÖ gen .Polylinker lµ mét ®o¹n
polynucleotit tæng hîp mang mét chuçi çc vÞ trÝ nhËn d¹ng duy nhÊt cña nhiÒu lo¹i RE
(restiction Enzyme)
Nhãm çc plasmid pUC ®iÓn h×nh lµ pUC18 ®îc c¶i biªn tõ pBK322 , kÝch thíc kho¶ng
2.686bp mang gen ApR
vµ mét phÇn gen lacZ , xen gi÷a gen lacZ lµ polylinker. çc plasmid
nhãm nµy chØ kh¸c nhau vÒ ®é dµi cña polylinker.Plasmid nhãm pUC cã kÝch thíc nhá , vïng
polylinker cho phÐp g¾n bÊt kú mét tr×nh tù DNA l¹ nµo .
Nhãm plasmid pSP vµ Gemini cã kÝch thíc kho¶ng 3.000bp, mang çc gen ApR
vµ
polylinker , kh«ng mang gen lacZ. Vec t¬ pSP mang promoter ®Æc trng cho RNA ë hai bªn
vïng polylinker (pSP64,pSP56,Gemini...) u ®iÓm næi bËt cña plasmid nhãm nµy lµ cho phÐp

29
phiªn m· çc ®o¹n DNA ng¾n trong vec t¬ t¹o nªn nhiÒu RNA, çc RNA nµy ®îc dïng lµm
mÉu dß hay ®Ó nghiªn cøu cÊu tróc , chøc n¨ng cña RNA.
H×nh 3.4. Tæng hîp vµ sö dông Cosmid ,(a) DNA thu nhËn tõ Bacteriophage Lamda ,(b) DNA
më ra vµ çc ®o¹n cDNA ®îc cµi vµo nhê enzym ,(c) t¹o thµnh Cosmid,(d) Çc m· di truyÒn
chøa cosmid cho yÕu tè nµy ®i vµo vi khuÈn vµ nh vËy lµ hoµ víi vi khuÈn ,(e) ë ®©y nãgöi
th«ng ®iÖp ®Ó h×nh thµnh mét thÓ gièng plasmid cã mang cDNA.
Mét vec t¬ kh¸c còng hay dïng lµ çc Cosmid . Cosmid lµ mét ®o¹n DNA ®îc t¹o ra b»ng
çch cµi mét ph©n tö cDNA vµo gi÷a çc tr×nh tù Cos ë cuèi çc ph©n tö DNA . Ph©n tö DNA
dïng ®Ó t¹o Cosmid ®îc lÊy tõ virut, thêng lµ bacteriophage lamda , nã sao chÐp ®îc trong
vi khuÈn . Çc virut nh bacteriophage cã chøa çc m· di truyÒn cho çc yÕu tè cho phÐp thÊm
nhËp tÕ bµo khi sao chÐp . Khi ë bªn trong tÕ bµo chñ , DNA d¹ng th¼ng cña virut göi th«ng
®iÖp tíi çc vßng gièng plasmid do g¾n vµo çc tr×nh tù Cos cña nã . Sö dông Cosmid còng
gièng nh s©u chØ vµo kim råi kÕt l¹i çc ®Çu láng lÎo ®Ó t¹o nªn mét Plasmid . Çc Cosmid cã
kh¶ n¨ng vËn chuyÓn çc ®o¹n DNA lín vµo bªn trongbtÕ bµo v× chóng cã kh¶ n¨ng thÊm nhËp
vµo tÕ bµo mét çch dÔ dµng
Vec t¬ thø 3 lµ mét Virut ®· ®îc thiÕt kÕ l¹i ®Ó mang çc mÈu DNA ngo¹i lai nh
cDNA.Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y çc virut cã RNA nh Retrovirut ®· ®îc dïng ®Ó chuyªn
chë çc gen tíi çc tÕ bµo cña ngêi. Virut cã thÓ ®îc thiÕt lËp cho viÖc vËn chuyÓn m· di
truyÒn cu¶ çc ®o¹n vi khuÈn ®Ó sö dông nã nh çc t¸c nh©n g©y miÔn dÞch vµ thêng gäi lµ
vacxin vec t¬ vi khuÈn .Nã ®¹i diÖn cho sù tiÕp cËn míi víi viÖc tiªm chñng cho mét quÇn thÓ
d©n c réng lín vµ ®ã còng lµ nguyªn nh©n ®Ó l¹c quan vÒ çc vac xin t¬ng lai .
Mét virut ®îc sö dông réng r·i víi t çch lµ mét vec t¬ ®ã lµ Bacteriophage hay ®¬n gi¶n
gäi lµ Phage .MÆc dï kh«ng cÇn thiÕt x¶y ra , nhng bé gen cña phage thêng tù sao chÐp
trong tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn . NhiÒu d¹ng cña phage bé gen cña nã l¹i g¾n víi çc NST cña
Vi khuÈn vµ n»m l©u dµi ë ®ã . V× v©y bé gen cña phage cã thÓ dïng ®Ó chuyÓn cDNAtíi mét
NST vi khuÈn . Mét qu¸ tr×nh t¬ng tù nh vËycòng x¶y ra ë çc virut cña mét loµi thùc vËt
hay çc virut cña ®éng vËt (tøc lµ retrovirut) víi çc tÕ bµo vËt chñ . H¬n n÷a , ®Ó cã mét ®iÓm
gèc cho sù sao chÐp (origin of replication) th× mét vec t¬ thêng chØ cã mét vÞ trÝ ®¬n , n¬i dµnh
cho enzym giíi h¹n ®Æc biÖt , mÆc dï enzym cã thÓ c¾t vec t¬ ë r¸t nhiÒu ®iÓm . Vec t¬ nµy cßn
cã mét bé phËn gièng nh maker gene (dÊu chuÈn gen) gióp cho vec t¬ cã thÓ ®Þnh vÞ ®îc
trong çc tÕ bµo. Gen kh¸ng kh¸ng sinh lµ mét dÊu chuÈn thÝch hîp bëi v× çc tÕ bµo cã dÊu
chuÈn vÉn cßn tån t¹i khi xö lý víi kh¸ng sinh cßn nh÷ng tÕ bµo kh«ng cã dÊu chuÈn th× sÏ bÞ
chÕt. Gi¶ thiÕt lµ cµi ®îc mét gen th× maker gene ph¶i ho¹t ®éng .
Mét yÕu tè kh¸c lµm t¨ng gi¸ trÞ cña vec t¬ nµy lµ tÝnh thÝch nghi cña nã víi çc tÕ bµo vËt chñ .
TÝnh æn ®Þnh cña vec t¬ cã thÓ ®¹t ®îc b»ng çch khi muèn ®a mét gen vµo th× ph¶i kiÓm
so¸t chÆt chÏ thêi ®iÓm ®a gen vµo sao cho ®óng thêi kú phiªn m· , ch¼ng h¹n nh trong thêi
kú tÕ bµo sinh trëng nhanh .Tiªu ®iÓm kiÓm so¸t sù biÓu hiÖn gen trong cång nghÖ DNA lµ sù
ho¹t ®éng ë vÞ trÝ promoter –mét tr×nh tù baz¬ t¹o nªn sù h×nh thµnh RNA th«ng tin .
TÝnh æn ®Þnh còng ®¹t ®îc b»ng çch sö dông NST thay v× çc vec t¬ plasmid .
§Ó gi¶m bít kh¶ n¨ng mÊt toµn bé plasmid , çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· ®a vµo çc tÕ bµo
mét lîng lín plasmid gäi lµ “high copy number-nhiÒu b¶n sao” v× cã sù cè mÊt çc tÕ bµo cã
chøa plasmid trong lóc ph©n chia tÕ bµo .

30
H×nh 3.5. .Bacteriophage Lamda Phage ®i vµo çc tÕ bµo vi khuÈn , ë ®ã lâi DNA cña nã g¾n
víi NST cña vi khuÈn . Khi tæ hîp víi DNA ngo¹i lai , phage ®ãng vai trß nh mét vec t¬ cho
DNA ®ã.
Mét çch kh¸c ®Ó duy tr× plasmid lµm cho çc tÕ bµo phô thuéc plasmid ph¶i sèng tiÕp tôc .
Ch¼ng h¹n nh mét gen cho mét enzym cÇn thiÕt nµo ®ã cã thÓ ®îc ®a vµo plasmid cïng víi
mét gen kh¸c. Plasmid sÏ cµi vµo tÕ bµo çc gen cña enzym cÇn thiÕt ®ã. §Ó tån t¹i, çc tÕ bµo
ph¶i cã plasmid (vµ gen ®Ó t¹o ra çc enzym) . V× thÕ chØ cã çc tÕ bµo cã plasmid th× míi tån
t¹i ®îc khi ph©n chia tÕ bµo .Còng cã thÓ lµ cÇn ph¶i hîp nhÊt mét gen kh¸ng kh¸ng sinh vµo
plasmid . Vµ nh vËy th× chØ çc tÕ bµo cã chøa plasmid kh¸ng l¹i kh¸ng sinh míi tån t¹i cßn
çc tÕ bµo kh¸c th× sÏ bÞ chÕt .
3.3.Lùa chän çc tÕ bµo chñ
B¶n chÊt cña vec t¬ còng quan träng nh b¶n chÊt cña çc tÕ bµo hay c¬ quan vËt chñ . Mét ®ßi
hái kh¸c lµ çc tÕ bµo vËt chñ ph¶i thÝch hîp ®îc víi viÖc nu«i cÊy trong phßng thÝ nghiÖm vµ
cã kh¶ n¨ng hîp nhÊt víi çc vËt chÊt di truyÒn cña vec t¬ . Vµ çc nhµ Ho¸ sinh còng ph¶i cã
kh¶ n¨ng kiÓm so¸t ®îc sù biÓu hiÖn gen trong çc tÕ bµo chñ vµ thu thËp ®îc çc s¶n phÈm
cña gen .
Mét trong sè çc ph¬ng tiÖn vËn t¶i lín nhÊt ®èi víi sù biÓu hiÖn protein lµ vi khuÈn
Escherichia Coli (H×nh 3.7a).
Nh ®· ®Ò cËp ë çc ch¬ng tríc, vi khuÈn ®· ®îc sö dông réng r·i ngay tõ trong çc thÝ
nghiÖm ®Çu tiªn cña c«ng nghÖ DNA v× ngêi ta ®· qu¸ hiÓu vÒ vi khuÈn .§èi víi virut th×
ngêi ta còng sö dông çc t liÖu nghiªn cøu tõ nh÷ng n¨m ®Çu 1950 . TÝnh di truyÒn cña
chóng ®· ®îc x¸c lËp trong çc thÝ nghiÖm vÒ biÕn n¹p (transformation) vµ céng hîp

31
(conjugation) trong nh÷ng n¨m 1960 vµ nã ®· ®îc dïng ®Ó giÉi m· qu¸ tr×nh tæng hîp protein
trong nh÷ng n¨m 1960 vµ 1970.
H¬n n÷a , çc tÕ bµo E.Coli ®îc sö dông réng r·i cßn do chóng cã tèc ®é t¸i b¶n ®Æc biÖt cao
.Trong ®iÒu kiÖn lý tëng, cø 20 phót vi khuÈn nµy l¹i nh©n ®«i mét lÇn . Khi vi khuÈn t¸i sinh
th× plasmid vµ çc gen ®îc cµi vµo còng ®îc t¸i sinh .Vµ trong nhiÒu giê th× sÏ cã mét quÇn
thÓ cã tíi hµng triÖu çc con ch¸u cña vi khuÈn còng nh hµng triÖu b¶n sao cña çc plasmid
biÕn ®æi gen .Nh÷ng qï©n thÓ nh vËy gäi lµ colony(khuÈn l¹c) vµ gäi lµ dßng (clone) ®èi víi
plasmid vµ gen . Tõ lãng cña c«ng nghÖ DNA gäi lµ gen “®· ®îc t¸ch dßng”(gene have been
cloned).ViÖc t¸ch dßng gen ë çc tÕ bµo ®éng vËt th× chËm h¬n nhiÒu bëi b× çc tÕ bµo nµy
nh©n lªn víi tèc ®é chËm so víi çc tÕ bµo E.Coli.
MÆc dï E.Coli lµ con ngùa thå (Workhorse) cña di truyÒn ph©n tö , nhng nh÷ng vi khuÈn nµy
còng cã nh÷ng ®iÓm bÊt lîi .Ch¼ng h¹n nh mét sè chñng E.Coli còng g©y bÖnh tiªu ch¶y ë trÎ
em vµ çc kh¸ch du lÞch (traveler’s diarrhea).
H¬n n÷a thµnh tÕ bµo cña çc tÕ bµo E.Coli cßn cã c¶ çc néi ®éc tè mµ çc néi ®éc tè nµy l¹i
cã h¹i cho con ngêi. Çc néi ®éc tè còng khã lo¹i ra khái çc chÕ phÈm thuèc .
E.Coli còng chØ t¹o ra ®îc mét lîng t¬ng ®èi Ýt protein , ®©y lµ ®iÓm yÕu lµm gi¶m gi¸ trÞ
cña nã trong c«ng nghÖ DNA .
Mét sinh vËt kh¸c ®îc biÕn ®æi , ®ã lµ vi khuÈn Bacillus Subtilis (H×nh 3.7b) . Sinh vËt h×nh
chiÕc gËy nµy kh«ng g©y bÖnh . N¨m 1958 nã ®îc biÕn n¹p trong çc thÝ nghiÖm Griffith vµ tõ
sau ®ã di truyÒn vi khuÈn ®· ®îc nghiªn cøu thÊu ®¸o h¬n .
Chñng B.Subtilis s¶n xuÊt protein mét çch tÝch cùc vµ chñng nµy ®· ®îc dïng trong c«ng
nghiÖp s¶n xó©t çc kh¸ng sinh , çc chÊt diÖt c«n trïng vµ çc enzym c«ng nghiÖp . Plasmid
cña B.Subtilis vµ sù tÊn c«ng cña virut sÏ ®îc ®Ò cËp kü trong çc ch¬ng sau.
Trong nh÷ng trêng hîp x¸c ®Þnh , ngêi ta muèn sö dông çc tæ chøc nh©n chuÈn – tøc lµ çc
tÕ bµo cã nh©n , çc c¬ quan tö vµ phøc t¹p h¬n çc vi khuÈn nh©n trÇn . Sinh vËt thÝch hîp
trong trêng hîp nµy lµ nÊm mem Saccharomycess Cerevisiae (H×nh 3.7c). NÊm men kh«ng
g©y bÖnh , ®· ®îc th¨m dß kü cµng vÒ mÆt di truyÒn vµ ®· ®îc sö dông mét çch thêng qui
trong qu¸ tr×nh lªn men vµ lµm b¸nh m× .
Sö dông çc tæ chøc nh©n chñan th× tèt h¬n cho viÖc s¶n xuÊt çc protein cho ngêi bëi v× çc
protein kh¸ phøc t¹p l¹i ®îc s¶n xuÊt bëi çc tæ chøc phøc t¹p h¬n . Mét vi sinh vËt nh©n
chuÈn kh¸c lµ nÊm còng ®îc sö dông trong c«ng nghÖ DNA , chóng ta sÏ xem xÐt sau.
Trong mét sè çc thÝ nghiÖm cña c«ng nghÖ DNA l¹i ®ßi hái çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó
(§VCV) . Khi sö dông çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó sÏ cã mét lîi thÕ lµ tr¸nh ®îc çc ®éc tè nh
khi sö dông vi khuÈn . Çc nhµ Ho¸ sinh còng ph¸t hiÖn r»ng mét sè protein lµ qu¸ lín vµ qu¸
phøc t¹p nÕu ph¶i tæng hîp b»ng vi khuÈn (ch¼ng h¹n nh çc chÊt ho¹t ho¸ plasminogen cña
m«) . V× çc protein phøc t¹p cã xu híng cuén l¹i kh«ng ®óng quy çch trong vi khuÈn vµ sù
khiÕm khuyÕt nµy cã thÓ dÉn tíi sù t¹o thµnh çc s¶n phÈm kh«ng cã ho¹t tÝnh . Vi khuÈn cßn
cã thÓ thiÕu hÖ enzym cã liªn quan tíi sù c¶i biÕn protein tíi d¹ng cuèi cïng cña nã nh viÖc
g¾n thªm ph©n tö cachohydrat ch¼ng h¹n .

32
H×nh 3.6. Çc tÕ bµo chñ lµ vi sinh vËt dïng cho c«ng nghÖ DNA ,(a) Escherichia Coli ,(b)
Bacillus subtilis , (c) Saccharomyces cerevisiae .
Mét bÊt lîi khi lµm viÖc víi çc tÕ bµo §VCV lµ thao t¸c rÊt khã kh¨n vµ ®¾t tiÒn so víi viÖc
sö dông çc tÕ bµo vi khuÈn . ViÖc nu«i cÊy çc tÕ bµo §VCV còng rÊt phøc t¹p vµ viÖc cµi çc

33
ph©n tö vec t¬ vµo çc tÕ bµo §VCV lµ cùc kú phøc t¹p. Tuy nhiªn, çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®·
ph©n chia ra nhiÒu ®êng híng ®Ó hoµn tÊt viÖc tæng hîp protein trong çc tÕ bµo §VCV b»ng
çch sö dông çc tr×nh tù promoter, nh÷ng vec t¬ míi ,vµ c¶ nh÷ng ph¬ng ph¸p míi ®Ó bµi
xuÊt protein .
Khi vec t¬ ®· ®îc chuÈn bÞ råi th× viÖc cµi nã vµo çc tÕ bµo hay tæ chøc tiÕp nhËn t¬ng ®èi
dÔ dµng . Plasmid vµ Cosmid sÏ th©m nhËp vµo çc tÕ bµo khi lµm nãng lªn hay lµm l¹nh ®i xen
kÏ cïng víi sù cã mÆt cña can xi clorua vµ virut x©m nhËp vµo tÕ bµo trong lóc çc qu¸ tr×nh
sao chÐp cña chóng vÉn diÔn ra mét çch b×nh thêng .
Mét ph¬ng ph¸p kh¸c dïng ®Ó cµi lµ ®¹n sinh häc biological bullistic” , çc
ph¬ng ph¸p vi tiªm (microsyring injection) sÏ ®îc bµn sau.
3.4.Sù biÓu hiÖn cña gen
Khi ®· chuÈn bÞ ®îc vec t¬ vµ cµi ®îc vµo çc tÕ bµo hay tæ chøc cña vËt chñ th× çc nhµ c«ng
nghÖ DNA ph¶i ý thøc tíi viÖc xem xÐt vÒ mÆt Ho¸ sinh v× nã cßn gãp phÇn vµo sù thµnh , b¹i
cña c¶ qu¸ tr×nh.
Nh÷ng bíc nµy còng ph¶i thËn träng nh çc bíc tríc bëi v× çc qu¸ tr×nh sinh ho¸ cßn
liªn quan tíi sù biÓu hiÖn gen bªn trong tÕ bµo .
Mçi bø¬c nh thÕ phô thuéc vµo sù ®Þnh vÞ chiÕn lîc (strategic location), tøc lµ ph¶i ®Æt chÝnh
x¸c gen cÇn cµi vµo ®óng vÞ trÝ trªn plasmid (H5.9) . Khi enzym RNA polymeraza phiªn m·
DNA thµnh mRNA th× còng lµ lóc b¾t ®Çu qu¸ tr×nh ®Þnh vÞ mét vÞ trÝ nhËn d¹ng trªn ph©n tö
DNA .VÞ trÝ nµy gäi lµ vÞ trÝ promoter (promoter site), ®ã lµ mét tr×nh tù baz¬ nãi lªn r»ng
enzym ®· b¾t ®Çu tæng hîp mRNA .Enzym nµy sau ®ã di chuyÓn däc theo ph©n tö DNA vµ
tæng hîp mRNA cho tíi khi ®Õn m· kÕt thóc. §Ó cã sù biªu hiÖn gen th× vÞ trÝ promoter ph¶i
®îc ®Æt ®óng dÊu (spot) trªn vec t¬ cã liªn quan víi gen.
H×nh 3.7. Vai trß cña Vec t¬ ch¼ng h¹n nh plasmid m· ho¸ Insulin. Plasmid cã çc vÞ trÝ ®Ó
khëi ®Çu sù h×nh thµnh mRNA (promoter), nã cho phÐp g¾n víi Riboxom vµ kÕt thóc sù t¹o
thµnh mRNA (terminator) . Trong çc tÕ bµo nh©n chuÈn th× mRMA më ®Çu ®îc c¶i biÕn
b»ng çch lo¹i ®i nh÷ng intron ®Ó t¹o thµnh ph©n tö mRNA cuèi cïng .
VÞ trÝ kÕt thóc (termination site) còng cã tÇm quan träng nh vÞ trÝ promoter. §©y lµ m· cña çc
baz¬ tÝn hiÖu kÐt thóc qu¸ tr×nh phiªn m· . §iÒu nµy thËt lµ h÷u Ých v× ®· ®Æt mét tÝn hiÖu h÷u
hiÖu ngay sau gen ®Ó ng¨n ngõa viÖc ®äc lÊn c¶ sang çc gen bªn c¹nh .Gen mong muèn sÏ
®îc ®Æt thËt chÝnh x¸c gi÷a vÞ trÝ promoter vµ vÞ trÝ kÕt thóc ®Ó ®¶m b¶o cho sù phiªn m· hîp
lý .
H¬n n÷a, ®èi víi çc vÞ trÝ promoter vµ vÞ trÝ kÕt thóc th× çc vec t¬ ph¶i chøa mét tr×nh tù baz¬
cho vÞ trÝ g¾n riboxom (ribosomal binding site). VÞ trÝ nµy lµ cÇn thiÕt bëi v× bëi v× ph©n tö
mRNA ®îc m· ho¸ bëi gen ph¶i ®îc g¾n víi riboxom vµ ®Ó lµm ®îc ®iÒu ®ã th× cÇn ph¶i cã
mét tr×nh tù baz¬ bæ cøu víi nã trªn riboxom .NÕu viÖc g¾n kh«ng thµnh c«ng th× pha dÞch m·
®Ó tæng hîp protein sÏ kh«ng x¶y ra vµ gen kh«ng ®îc biÓu hiÖn.
Mét vÊn ®Ò kh¸c cÇn ph¶i xem xÐt ®èi víi sù biÓu hiÖn gen cã liªn quan tíi sù tæng hîp çc
ph©n tö mRNA.ë vi khuÈn toµn bé tr×nh tù DNA ®îc phiªn m· thµnh ph©n tö mRNA .Nhng

GEN TRỊ LIỆU

Recomendados

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Mais procurados

Mais procurados (20)

Semelhante a GEN TRỊ LIỆU

Semelhante a GEN TRỊ LIỆU (20)

Mais de Great Doctor

Mais de Great Doctor (20)

GEN TRỊ LIỆU