次世代シーケンシング（NGS＝Next Generation Sequencing）についての、初心者向けセッションの配布資料です。（2013年9月）

1. いまさら聞けない
NGS超！入門
株式会社ジナリス
竹田 綾

2. ブース＃40： 株式会社ジナリス

3. 目的
• NGSについて「少し会話ができるレベル」になる
• 知りたい情報を効率よく入手するためのヒント

4. OUTLINE
• NGS：なにができるの？
• 「次世代」シーケンサー
– 活躍中のシーケンサー
– 第ｎ世代シーケンサーたち
• 基本の「き」 用語集
– ライブラリー作製
– シーケンシング
– データ解析
• 情報源のまとめ

5. NGSで何ができるの？
（どんなふうに使われているのか）

6. http://cell-innovation.nig.ac.jp/public/contents/sra_stat.html
４２％
NCBI Short Read Archive
DDBJ = DRA

8. アプリケーション
• 新規ゲノム解析
• リシーケンス（変異）
• RNA-seq（発現）
• 新規トランスクリプトーム
• miRNA
• ChIP-seq
• メチル化
• 16S rRNAメタゲノム
• メタゲノム（ショットガン）
などなど

9. NGS ＝ 実験ツール
“一方、シークエンサーはマイクロアレイと違い、DNA 多型から、転写、
DNAタンパク質相互作用、エピゲノムまで、あらゆる現象を捉える「多目的
顕微鏡」になっている。先日、“何々-Seq”がどのぐらいあるかを、数人で思
い出してみたところ、60手法ぐらいはすらすらと出てきた。”
（大会長挨拶より）

10. 「次世代」シーケンサーたち

11. http://flxlexblog.wordpress.com/2012/12/03/developments-in-next-generation-sequencing-a-visualisation/
Dec 3rd, 2012

13. 41%
8%
1%0%0%0%
50%
シーケンサー別統計
Illumina
Roche454
SOLiD
IonTorrent
PacBio
Helicos
Others

14. Next“次世代”シーケンサー
• Qiagen GeneReader
– Intelligent Bio-System “Max-Seq Genome Sequencer”
– 20-400M reads/flowcell, 20 flowcell (independent)
– Early access starts 2013
• GnuBIO
– Beta version start shipping in April
– Sequence by Hybridization
– Read length ~1000bp, 1.2Gb/run, $50,000
• Oxford Nanopore GridION & MinION

15. 基本の「き」 用語集

16. （ほぼ）共通のながれ
ライブラリー
作製
シーケンシ
ング
データ解析
①

17. ライブラリー作製
• DNA断片化→シーケンシングアダプター付与
• フラグメントサイズ：断片化したDNAの長さ
• RNA：PolyA濃縮／ rRNA除去後、ｃDNA作製
• Target capture
• Amplicon
など

18. ライブラリー
フラグメント／シングルエンド ペアエンド
アダプター DNAフラグメント
シーケンスリード

19. メイトペアライブラリー
http://wako-chem.co.jp/siyaku/jutaku/dna_sequence/img/figure_03_01.jpg

20. マルチプレックス
http://www.illuminakk.co.jp/technology/multiplexing_sequencing_assay.ilmn

21. （ほぼ）共通のながれ
ライブラリー
作製
シーケンシ
ング
データ解析
②

22. “生データ”
• 生データ： ベースコールと最低限のフィルタ
リング後、シーケンサーから出力されるリード
配列とそのクオリティー情報
（Fastq, SFF, etc)
• 出力データ量 ＝ リード数 x リード長
• リード長
• クオリティー Phred Score

23. Phred Score
http://en.wikipedia.org/wiki/Phred_quality_score

24. http://en.wikipedia.org/wiki/Phred_quality_score

25. トリミング・フィルタリング
生データのQual. Valueの分布
1 51 bp
トリミング後のデータの
Qual. Valueの分布
1 51 bp
（株）ジナリス

26. （ほぼ）共通のながれ
ライブラリー
作製
シーケンシ
ング
データ解析
③

27. アセンブリー ｖｓ マッピング
コンセンサス配列
参照配列／リファレンス

28. リード
アダプター DNAフラグメント
シーケンスリード
http://www.slideshare.net/kbradnam/assemblathon-2-talk

29. ペアリード
アダプター DNAフラグメント

30. メイトペアリード

31. コンティグ
コンティグ

32. スキャフォールド／スーパーコンティグ
コンティグ１ コンティグ２

33. スキャフォールド／スーパーコンティグ
コンティグ１ コンティグ２
NNNNNNNNNNNN
スキャフォールド
ギャップ

34. アセンブリー結果の評価
• アセンブリーサイズ：総コンティグ／スキャフォールド長
• コンティグ・スキャフォールド数
• N50
• ギャップ数・ギャップ長

35. N50
１２個のスキャフォールド／コンティグ、総塩基長２００Mb
http://www.slideshare.net/kbradnam/assemblathon-2-talk

36. N50
１２個のスキャフォールド／コンティグ、総塩基長２００Mb
http://www.slideshare.net/kbradnam/assemblathon-2-talk

37. マッピングの評価
参照配列／リファレンス
A
A
A
A
A
Depth＝リードの厚み
％Coverage ＝ 参照配列の全長に対して、リードがマップされている領域の割合

38. SNP・一塩基置換
A
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
G
A
A
G
G

39. InDel
Deletion
Insertion

40. リピート配列
ATTGGCTATGGTTACAGAACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCATTGCACTT
GTTACA
GTTACA
GCACTT
GCACTT
CGCGCG
CGCGCG
??

41. 高次解析
• 遺伝子アノテーション
• SNP解析
• 発現量解析
• コピー数
• 菌叢推定
などなど

42. 情報収集源

43. First Option
https://www.google.com/?tbm=pts
Google 特許

44. メーカーサイト
http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn

45. http://454.com/publications/index.asp

46. http://cell-innovation.nig.ac.jp/wiki/tiki-index.php

47. http://togotv.dbcls.jp/index.rb?category=NGS

48. http://seqanswers.com/

49. http://qa.lifesciencedb.jp/

50. http://www.genome.gov/27552682

51. 業界ニュース

52. 個人ブログ
http://pacbiobrothers.blogspot.jp/
http://shortreadbrothers.blogspot.jp/

53. 匠たちに聞く
• Twitter

54. #ngsfield

55. http://genaport.genaris.com/GOC_topics.php

56. http://genaport.genaris.com/GOC_topics.php
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57. ご清聴ありがとうございました
宿題： せっかくですので、本会期中に「匠」印の人
を見つけて、一つ質問してみましょう！