Llevats no-Saccharomcyes com a eines per a controlar el grau alcohòlic dels vins: Importància de l’oxigen i la respiració. Ramón González

1. Levaduras no-Saccharomyces como
alternativa para controlar el grado
alcohólico de los vinos.
El papel del oxígeno y la
respiración.
www.icvv.es/microwine

3. Selección clonal y varietal Técnicas de cultivo
Desalcoholización parcial
Objetivo: compensar 2-3 grados

4. Tres limitaciones:
Productos secundarios debido a
reajustes metabólicos (acético,
acetoína, productos de
“oxidación”)
¿(multi) GMOs en vino?
Estrategias basadas en
levaduras recombinantes
(S. cerevisiae)

5. Tres limitaciones:
Productos secundarios debido a
reajustes metabólicos (acético,
acetoína, productos de
“oxidación”)
¿(multi) GMOs en vino?
¿Qué hacemos con el azúcar?
Estrategias basadas en
levaduras recombinantes
(S. cerevisiae)

6. Ethanol
Glucosa + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O
Glucosa 2 Etanol + 2 CO2

9. Opción co-inoculación

10. Azúcar
GL
GL

11. GL
GL
GL
GL
Azúcar

12. GL
GL
GL
GL
GL
GL
Azúcar

13. Tres limitaciones previstas
Fermentación con especies alternativas de levaduras
Necesitamos oxígeno
Ninguna de ellas es la auténtica limitación
Exceso de oxígeno disuelto
Efecto Crabtree en S. cerevisiae

16. Candida sake x4
Candida stellata
Candida vanderwaltii
Candida vinaria
Candida zemplinina x4
Debaryomyces hansenii x4
Debaryomyces fabryi
Hanseniaspora guilliermondii x3
Hanseniaspora uvarum x2
Hanseniaspora vineae
Hansenula polymorpha
Kazachstania exigua x2
Kloeckera apiculata x3
Kluyveromyces sp. x4
Kluyveromyces nonfermentans
Kregervanrija fluxuum
Lanchancea cidrii
Lanchancea thermotolerans
Metschnikowia pulcherrima x4
Pichia anomala x4
Pichia membranifaciens x4
Saccharomyces cerevisiae x4
Scheffersomyces stipitis x4
Starmerella bombicola x4
Torulaspora delbrueckii x3
Zygosaccharomyces bailii
Zygosaccharomyces rouxii
65 cepas de levadura (28 especies)
AQ (IATA), CIDA (ICVV), CIAL (IFI), CRA-ENO (Asti), CBS

17. RQ=1: respiración pura
RQ= ∞: fermentación pura
RQ=
%respiración=
100/(3RQ-2)
CO2 producido
O2 consumido
¿Cuánto azúcar respira o fermenta cada cepa?
•pH 3.5
•200g/L de azúcar
•Aire 0.2 vvm
•Preaclimatación 24h
Cuantificación de RQs
O cómo soslayar el stripping del etanol
RQ=2: 25 % respiración

20. Acético
Mosto sintético, aireación moderada, 15+2 cepas

21. Factores que afectan a la reducción de grado
•Temperatura
15ºC, 20ºC, 25ºC
•Intensidad de oxigenación
10% O2, 21% O2, 50% O2
•Nitrógeno asimilable
•150 mg/L, 200 mg/L, 250 mg/L
Ensayos con cuatro cepas de levadura
y tres niveles por parámetro
(diseño ortogonal: 9 de 27 combinaciones)
•Metschnikowia pulcherrima
•Kluyveromyces lactis
•Candida sake
•Saccharomyces cerevisiae

22. Consumo de azúcar 72 h

23. Rendimiento en glicerol 72 h

24. Rendimiento en ácido acético 72 h

25. Rendimiento en etanol 72 h

26. Grados de reducción

27. Eficacia

28. Relevancias relativas de cada parámetro
S. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake
Consumo de
[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +
azúcar
YAN 45 + 45 + 50 + 18 +
TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +
Etanol
[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -
(rendimiento)
YAN 44 + 67 + 33 + 71 +
TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +
Ácido acético
[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +
(rendimiento)
YAN 15 - 46 - 28 + 46 +
TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +
Glicerol
[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -
(rendimiento)
YAN 2 + 78 - 4 - 12 -
TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -
Reducción
[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +
de grado
YAN 27 + 35 + 29 + 28 -
TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +
Eficacia
[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -
YAN 46 - 37 + 30 - 67 -
TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

29. El efecto del oxígeno sobre la respiración es el esperado
(pero siempre tiende a aumentar el acético)
S. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake
Consumo de
[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +
azúcar
YAN 45 + 45 + 50 + 18 +
TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +
Etanol
[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -
(rendimiento)
YAN 44 + 67 + 33 + 71 +
TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +
Ácido acético
[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +
(rendimiento)
YAN 15 - 46 - 28 + 46 +
TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +
Glicerol
[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -
(rendimiento)
YAN 2 + 78 - 4 - 12 -
TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -
Reducción
[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +
de grado
YAN 27 + 35 + 29 + 28 -
TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +
Eficacia
[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -
YAN 46 - 37 + 30 - 67 -
TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

30. La producción de glicerol por M. pulcherrima
responde de manera opuesta al resto
S. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake
Consumo de
[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +
azúcar
YAN 45 + 45 + 50 + 18 +
TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +
Etanol
[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -
(rendimiento)
YAN 44 + 67 + 33 + 71 +
TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +
Ácido acético
[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +
(rendimiento)
YAN 15 - 46 - 28 + 46 +
TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +
Glicerol
[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -
(rendimiento)
YAN 2 + 78 - 4 - 12 -
TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -
Reducción
[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +
de grado
YAN 27 + 35 + 29 + 28 -
TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +
Eficacia
[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -
YAN 46 - 37 + 30 - 67 -
TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

31. El oxígeno raramente es el factor más relevante
(dentro de los márgenes estudiados)
S. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake
Consumo de
[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +
azúcar
YAN 45 + 45 + 50 + 18 +
TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +
Etanol
[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -
(rendimiento)
YAN 44 + 67 + 33 + 71 +
TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +
Ácido acético
[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +
(rendimiento)
YAN 15 - 46 - 28 + 46 +
TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +
Glicerol
[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -
(rendimiento)
YAN 2 + 78 - 4 - 12 -
TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -
Reducción
[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +
de grado
YAN 27 + 35 + 29 + 28 -
TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +
Eficacia
[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -
YAN 46 - 37 + 30 - 67 -
TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

32. Puesta a punto de condiciones para reducir el
grado alcohólico
Cultivo mixto con M. pulcherrima, diferente
proporciones de inoculación, mosto natural, 25ºC,
aireación controlada 48 h (resto anaeróbico)

33. Consumo de azúcar en mosto natural
Etanol producido
 -3 grados

34. Consumo de azúcar en mosto natural
Etanol producido
 -3 grados
0.17 g/L
1.90 g/L
0.64 g/L
Acidez volátil final

35. Consumo de azúcar en mosto natural
Etanol producido
0.17 g/L
0.51 g/L
0.35 g/L
Acidez volátil final
 -2.1
grados

36. 0
20
40
60
80
100
DO
0 34 67 101 134 168
hours
Time
100% air
M. pulcherrima
0
20
40
60
80
100
DO
0 34 67 101 134 168
hours
Time
100% air
M. pulcherrima/S. cerevisiae (1%)
0
20
40
60
80
100
DO
0 34 67 101 134 168
hours
Time
100% air
M. pulcherrima/S. cerevisiae (10%)
0
24
48
72
96
120
DO
0 34 67 101 134 168
hours
Time
100% air
S. cerevisiae
0
20
40
60
80
100
DO
0 34 67 101 134 168
hours
Time
25% air
M. pulcherrima/S. cerevisiae (10%)
0
20
40
60
80
100
DO
0 34 67 101 134 168
hours
Time
25% air
S. cerevisiae
¿Puede haber exceso de oxígeno?

37. Con la industria
Investigación de base
•Metabolismo energético de especies alternativas de levaduras
(y su regulación)
•Mecanismo de producción de acético en condiciones oxigenación
(S. cerevisiae y otras especies)
•Interacciones metabólicas en condiciones aeróbicas
•Factores determinantes para la competición entre cepas
•Selección de cepas con criterios enológicos
•Optimización de parámetros de proceso
•Desarrollo de dispositivos específicos de control

38. GRACIAS