1. Dr. Romain Desprat

2. Sommaire
• Projet INGESTEM
• Gouvernance et organisation : Comité de direction et personnels
• Objectifs de la plaforme de reprogrammation cellulaire
• Comité de direction et Platforme
• Type de collaboration et tarifs
• Charte de fonctionnement :
- Engagements de l’utilisateurs
- Engagements de la platforme
- Objectifs de la plateforme
- Type de collaboration et tarifs
• iPS production application form 1.0
• Méthodologies proposées
• SNL cellules nourricières pour la culture des iPS et génération d’iPS
• Virus Sendai
• Tests de pluripotence
• Morphologie des colonies
• Analyse des Caryotypes
• RT-PCR Immunostaining et Teratoma
• Instabilité genomique dans les iPS

3. Infrastructures nationales
en biologie et santé
PROJET INGESTEM
1
Le projet INGESTEM propose de constituer une biobanque unique de
DESCRIPTION cellules souches à vocation thérapeutique et de structurer cette
filière autour d’un pôle industriel.
APPORTS POUR La disponibilité de cette base de données de cellules souches va
LA SCIENCE permettre de réaliser des avancées significatives dans le domaine de la
2 modélisation des maladies humaines et dans le domaine de la définition
de nouveaux protocoles thérapeutiques.
INGESTEM va permettre à la France de passer du stade de la recherche
au stade industriel dans le domaine des thérapies cellulaires liées aux
APPORTS cellules souches en développant une biobanque unique, en instaurant
POUR LE SYSTEME DE des normes de production cliniques, des standardisations au niveau des
RECHERCHE méthodes de reprogrammation, de modélisation de pathologies et de
futurs protocoles de médecine régénératrice.
3
Plateforme de reprogrammation cellulaire SAFE-IPS ("la Plateforme") est une structure
interne du département HU de Biothérapie du CHRU de Montpellier

4. Gouvernance et organisation
Comité de Direction
• Réseau INGESTEM est coordonné par le Prof. Annelise
Bennaceur-Griscelli.
• Directeur de l’IRB (Prof. B.Klein), responsable et représentant de
la Plateforme au niveau du réseau INGESTEM.
• Deux responsables scientifiques désignés par le Directeur de
l'IRB sur la base de leurs compétences médicales et/ou
scientifiques (Prof. J. De Vos et Dr JM. Lemaitre) dans le domaine
des cellules souches pour la durée du projet INGESTEM.

5. Objectifs de la plateforme de
reprogrammation cellulaire
• Fournir un service de Reprogrammation, Amplification et
qualification de cellules adultes en cellules souches induites
pluripotentes iPS.
• Développer un programme de recherche et développement
propre visant à rendre plus efficaces et plus sûres les techniques de
reprogrammation cellulaires.

6. Comité de direction :
Bernard KLEIN (Porteur du projet)
E-mail : bernard.klein@inserm.fr Plateforme:
Phone : 04 67 33 04 19
Romain DESPRAT, Ingénieur responsable
opérationel, romain.desprat@inserm.fr
John DE VOS (responsable scientifique) Fabienne BECKER, technicienne,
E-mail : john.devos@inserm.fr fabienne.becker@inserm.fr
Phone : 04 67 33 04 79
Lydiane PICHARD , ingénieur,
lydiane.pichard@inserm.fr
Jean-Marc LEMAITRE (responsable
scientifique)
E-mail : Jean-Marc.Lemaitre@igf.cnrs.fr
Phone : 04 67 33 04 73
-Le comité de Direction effectue une veille technologique prospective afin de faire évoluer
la Plateforme et s’assure du financement de cette évolution.
-Les responsables scientifiques assurent l’organisation de la Plateforme et la
supervision du personnel.
http://irb.montp.inserm.fr/en/index.php?page=Plateau&IdEquipe=12

7. Mise en Place du Projet
Signature du Contrat ET de la chartre de reprogrammation
Mise en place d’un planning de reprogrammation en réunion avec le
comité de direction
Envois du formulaire “iPS production application form 1.0” disponible sur le site web
SAFE iPS, à romain.desprat@inserm.fr
Réception des cellules et vérification de la conformité des cellules
comme décrit dans le formulaire “iPS production application form 1.0”
6 mois
Production et Qualification des iPS
1-Phénotype caractéristique en 3-Une capacité de différenciation
microscopie optique in vivo attestée par la formation
de tératomes dans la souris
2-Facs et Immunostainning des NOD-scid IL2Rgammanull (NSG)
marqueurs de la pluripotence
OCT4, NANOG, SSEA3, TRA-1-60 4-Caryotype de chacun clones
Trois lignées indépendantes (trois clones) de cellules iPS

8. Charte de fonctionnement
Les trois types de collaborations comprennent :
•La reprogrammation, l'amplification et la qualification de cellules
adultes en cellules souches pluripotentes.
•La formation d'un collaborateur du demandeur pendant une durée
de 15 jours ETP.
•La conservation de quatre ampoules congelées de chaque lignée
par la platforme.

9. Chartre de fonctionnement
Responsabilités
Il est entendu entre la Plateforme et ses utilisateurs que celle-ci
n'est soumise qu'à une obligation de moyens dans le cadre de
ses activités.
La Plateforme n'est pas responsable de l'emploi fait par les
utilisateurs des résultats des prestations. Toute utilisation
partielle ou inappropriée ou toute interprétation dépassant les
résultats des prestations réalisées par la Plateforme ne saurait
engager sa responsabilité.
Si les cellules de départ proviennent patient  Consentement
écrit du patient et Comité de Protection des Personnes

10. iPS production application form 1.0
General information (part I)
Date of submission:
Project Leader :
Phone and e-mail:
Institution:
Other persons involved in the project :
Name, phone an e-mail:
……………………………………………………………………….…………………………………………
…………………………….……………………………………………………………………….……………
…………………..
Cell information
Name of person who will handle the iPS cell lines.
Possible Conflicts of interest: NO/YES
Cell type:
Method of isolation/Origin :
Sample(s) name and description:
……………………………………………………………………….………………………………………
Contact: Romain.desprat@inserm.fr

11. iPS production application form 1.0 (part II)
•Written and dated documentation that the cells are negative for
bacteria. If not possible,
this can be
•Written and dated documentation that the cells are negative for carried out by
mycoplasm. facility as a
service.
•Written and dated documentation that the cells are negative for the
following viruses : HIV1, HIV2, HB, HCV. Passage number (please
describe proliferation rate or doubling time):
If frozen, number of viable cells frozen (>= 5 x 10E5 viable cells)
Medium used to grow the cells (indicate the antibiotic and
concentration used in the media):
Contact: Romain.desprat@inserm.fr

12. (part III)
Freezing media composition:
Protocol to thaw the cells:
Dated karyotype of the cells. If not possible, this can be carried out by the
Chromostem facility as a service (please contact f-pellestor@chu-
montpellier.fr).
Mettre dans le site web le lien vers Franck.
Preferred reprogramming method (check the box):
 Sendai virus
 Lentivirus
 Retrovirus
Contact: Romain.desprat@inserm.fr

13. Méthodologies proposées Transfert
colonies iPS
Rétrovirus/Lentivirus (integratifs)
J -2 J 13 Colonies J 27
J 0 J 2
iPS
J -2 J 0 Virus Sendai J 13 J 27
colonies
iPS
mRNA et Rétrovirus/Lentivirus non integratifs
J -2 J 0 J 15 Colonies J 27
iPS
Protéines à venir prochainement
Adapted from: http://fr-fr.invitrogen.com/site/fr/fr/home/Products-and-Services/Applications/Stem-Cell-Research/Induced-Pluripotent-Stem-
Cells/Sendai-Virus-Reprogramming/Easy-Reprogramming.html

14. Virus Sendai
Invitrogen: sialic acid
MTA /Collaboration avec

15. SNL cellules nourricières pour la
génération et la culture d’iPS
•Cellules souches embryonnaires ont besoin de “feeders”.
•Lignée cellulaire immortalisée dérivée de fibroblastes murins
STO transformée avec du LIF murin et les gènes de résistance à la
néomicine (établis par le Dr. Allan Bradley (1)) .
• Utilisable pour la culture des iPS murins et humains.
• Doivent être bloque dans le cycle() avant l’ajout des cellules
souches embryonnaires humaines.
1. McMahon, A.P. and Bradley, A. (1990) Cell 62:1073–1085.

16. Plateforme de Vectorologie de Montpellier , Biocampus
Montpellier - UMS3426 Courriel : vectorologie@biocampus.cnrs.fr
 Test de non replicativite et dosage p24.
Production
Virale
optionel
Faster generation of hiPSCs by coupling high-titer lentivirus and column-based positive selection, Emily Dick, Elena Matsa, Lorraine E Young, David Darling &
Chris Denning, nature protocols | VOL.6 NO.6 | 2011 | 701

17. Distinct Regulatory Networks Control Transition versus Maintenance of
Pluripotency, Cell stem cell, Volume 11, Issue 6, 7 December 2012, Pages 769–782
“A color gradient (yellow-orange-red) depicts
the three phases of reprogramming, with the
maturation-to-stabilization transition upon
transgene withdrawal marked as a dotted line.
Genes that enhance and suppress transition
only (yellow), maintenance only (brown), or
both processes (orange) are displayed as
nodes. Associations (gray edges) were
obtained using GeneMANIA, with edge weight
(thickness and darkness) reflecting confidence,
as indicated.”
•-OKSM Transgenes Suppress the Stabilization Phase
•-Successful Transition of Reprogramming Cells to Stabilization Requires late Maturation Phase
->RNA profiling and down-regulation of OKSM is a key aspect

18. Tests de pluripotence
possible
Qualité du contrôle
Test de pluripotence But pour démontrer la
pluripotence
Vérifier que les iPS ont une morphologie similaire au
Morphologie des colonies Faible
hES
Marquage de la pluripotence:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-
Immunostaining Moyen
1-80, Nanog et SSEA
Détecte le niveau et la qualité d'expression des genes
RT-PCR Moyen-Bon
:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA
Capacité à se différencier dans les trois feuillets
Génération d'EB embryonnaires (ecto,endo, mésoderme et disparition Moyen-Bon
des marqueurs de la pluripotence)
Microarray ou RNA-seq Comparaison avec hES Moyen-Bon
Capacité à se différencier dans les trois feuillets
Teratoma formation Bon
embryonnaires (ecto,endo, mésoderme ) IN VIVO

19. Morphologie des colonies
Les cellules au centre de la colonie ont un ratio élevé noyaux /cytoplasme avec des
nucleoli proeminent , elles sont rondes et trés dense .
En comparaison avec les cellules au centre la colonie les cellules en peripherie montre
une morphologie plus mesenchymateuse et par consequant un ratio noyaux
/cytoplasme faible.

20. Chromostem : Analyse du Caryotype
(bande R et G sur metaphases)
f-pellestor@chu-montpellier.fr
Pour tout contrôle de la
formule chromosomique
(anomalie du nombre et de la
structure, le pouvoir résolutif
de cette technique ne permet
cependant de détecter que les
réarrangements
chromosomiques
de taille supérieure ou égale à
STEM CELLS Volume 27, Issue 11, 20 AUG 2009
5 à 10 mégabases (Mb):
Préparation
Anomalie Non Délai de rendu Coût -Avant et après la
Biologique Anomalie Détectable
requise
Détectable des résultats (TTC)
reprogrammation cellulaire
-Lors de la dérivation et/ou
Anomalies chromosomique de nombre et
mosaïque >10%, Anomalies
Mosaïque faible
(<10%),Anomalies
amplification,
Culot chromosomiques de structure de taille >
cellulaire fixé 10 Mb (translocation,
chromosomique de
structure de taille
3 semaines 350 euros
-Avant le stockage des lignées
inversion,délétions,duplications anneaux,
<10Mb
marqueurs chromosomiques

21. Les conditions de culture classiques des cellules ES humaines in vitro
permettant le maintien de leur état indifférencié, induisent de façon
non négligeable des trisomies des chromosomes 12, 17 ou X [1,2].
L’hypothèse qui prévaut actuellement pour expliquer ce phénomène
est que l’amplification de certains gènes portés par ces chromosomes
confère un avantage sélectif aux cellules souches indifférenciées.
1.Baker DE, Harrison NJ, Maltby E, et al. Adaptation to culture of human embryonic stem
cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol 2007 ; 25 : 207-15.
2. Draper JS, Smith K, Gokhale P, et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in
cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2004 ; 22 : 2253-4.
Améliorations des conditions de culture et de reprogrammation
X-Vivo Biospherix ( culture des cellules en milieux
athmospherique controler 100% du temps)

22. Immunocytochimie et facs RT-PCR
•Les Primers/amorces de RT-PCR seront
choisis afin de mesurer les niveaux
d’expression des genes sur-exprimes
utilises lors de la reprogrammation et de
leurs niveaux endogenes.
Efficient induction of transgene-free humain iPS using a vector
based on sendai virus, an RNA virus that does not integrate into
the host genome By Noemi FUSAKI, Hiroshi BAN, Akiyo NISHIYAMA, Koichi
SAEKI and Mamoru HASEGAWA, Efficient induction of transgene-free
humain iPS using a vector based on sendai virus, an RNA virus
that does not integrate into the host genome

23. Alkaline Phosphatase (AP)
Marquage sur cellules vivantes
(sans perte des cellules)
Alkaline Phosphatase (AP)
Marquage classique après fixation
“Gold standard”  Teratoma

24. Futurs projets afin d’offrir aux utilisateurs de la plateforme
des protocoles pre-établis permettant une meilleure
caratérisation de leurs iPS
-Création d’un test permettant de définir une signature
protéomique.
(Potentielle collaboration avec la Plate-forme Régionale de Protéomique Clinique,
Pr. S. Lehmann).
-Création d’une “custome chip” d’analyse d’expression
(coding et non coding) et CNV/SNP.
(Chip affymetrix sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. En collaboration
avec la Plateforme Régionale de Puces ADN très haute densité,IRB, V Pantesco).

25. Instabilité génomique dans les iPS
Cell Death and Differentiation (2011) 18, 745–753
Copy number variation and selection during reprogramming to
pluripotency, 3 MARCH 2011 , VOL 471 , NATURE , 59
Création d’un “custom chips” d’analyse d’expression et CNV/SNP (Affymetrix sur les genes
définissant l’état fibroblastique et iPS. En Collaboration avec la Plateforme Régionale de Puces
ADN très haute densité, V Pantesco)

26. Matérials à venir prochainement :
X-Vivo Biospherix,….

27. Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr
Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.fr
Projets dans à mettre en place :
•Production de beta-FGF sur Montpellier:
Permettant une diminution des coûts associes aux milieux -> plus d’utilisateurs
•Production de proteines (oct4,KLF, Sox…)  pour faire des iPS :
Permettant d’avoir des iPS sans integration genomique des vecteurs d’expression
permettant des potentielles applications cliniques futures
•Création de « custom chips » afin d’analyser l’expression et les
changements de CNV/SNP :
Sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. En collaboration avec la Plateforme
Régionale de Puces ADN très haute densité, Pr B.Klein

28. Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr
Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.fr
•Production de 6 virus sendai permettant l’expression transitoire
des six facteurs :
Oct4, Klf, Sox2, Myc, Lin28 Nanog, (La Plateforme de Vectorologie de Montpellier )
•Création d’un blog/site web (plus de flexibilité) et/ou en
utilisant un system déjà existant (INGESTEM), permettant un
partage plus fluide des protocols et publications, photo des
cellules, questions associées à la culture des iPS….
•Collaboration avec ReproCell afin de créer des ateliers ou
période d’apprentissage sponsorise par ReproCell et Ozyme pour
les milieux

29. Trois contrats et tarifs  la plateforme doit
s’autofinancer dans 3 ans
Un contrat de collaboration académique: Le coût représente la moitié des
dépenses engendrées par la prestation. Coût national INGESTEM. Le partenaire
académique utilise les cellules comme il le souhaite sur un plan académique, mais si
il engage un partenariat privé, la plateforme Safe-iPS sera associée dans la
valorisation.
Un contrat de collaboration avec compagnie privée : la plateforme Safe-iPS sera co-
propriétaire des lignées obtenues.
Un contrat avec prestation complète pour compagnie privée. les lignées iPS
obtenues sont la propriété exclusive de l'utilisateur.
Service Tarif
Collaboration académique 20 000 € TTC
Collaboration privée 40 000 € TTC
Collaboration privée complète 140 000 € TTC
Ces collaborations peuvent être mises en
place lors de l’écriture des demandes de
financement : ERC, ANR, INCA, ARC, Ligue
…