Relatorio 5

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Relatorio 5

  1. 1. UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTESETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA DANIELLY DE CASTRO SCHUPCHEK FELIPE M. BUCO SAULO BALLS SHARONN M. HARTMANN AULA PRÁTICA N° 5 ESPECTROFOTOMETRIA Relatório apresentado como requisito para obtenção de nota parcial, na disciplina de Bioquímica do curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Centro-Oeste – UNICENTRO. Professora: Franciely Grose Colodi GUARAPUAVA
  2. 2. 22012
  3. 3. 3 SUMÁRIO1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................032. OBJETIVOS.............................................................................................................................042.1 OBJETIVOS GERAIS...........................................................................................................042.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS...............................................................................................043. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................................043.1 REAGENTES.........................................................................................................................043.2 PROCEDIMENTOS..............................................................................................................044. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................064.1 CURVA DE ABSORÇÃO.................................................................................................... 064.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO....................................... 074.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRAPROBLEMA.................................................................................................................................075. CONCLUSÃO..........................................................................................................................096. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................107. APÊNDICE...............................................................................................................................11
  4. 4. 4 1. INTRODUÇÃO O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir aintensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de medida éutilizada a espectrofotometria que se baseia na absorção da radiação nos comprimentos de ondaentre o ultravioleta e o infravermelho. O aparelho espectrofotômetro faz passar um feixe de luzmonocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essasolução. Um prisma contido no aparelho separa a luzem feixes com diferentes comprimentos deonda. Assim é possível passar um feixe de luz monocromática através da amostra. Oequipamento permite saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda. O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um compostochama-se espectro de absorção e varia de substância para substância. Como diferentessubstâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria permite identificar equantificar substâncias com base no seu espectro. A quantificação é realizada com a relação entrequantidade de luz absorvida e concentração da substância. A absorção da luz é tanto maiorquanto mais concentrada for a solução por ela atravessada e quanto maior for a distânciapercorrida pelo feixe luminoso através da amostra. Esses princípios formam a Lei de Lambert –Beer Para determinação da concentração de um soluto em uma amostra porespectrofotometria, temos a comparação da absorbância da amostra com uma solução padrão, naqual já é conhecida a concentração do soluto. Em geral, é utilizada uma solução-padrão comdiferentes concentrações (padrões de referência), que tem sua absorbância determinada. Essespadrões são preparados diluindo-se a solução-padrão na proporção necessária para a obtenção dasconcentrações desejadas. Com os valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se traçar um gráficocujo perfil é conhecido como “curva-padrão” ou “curva analítica”. Nesse gráfico, a reta indica aproporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância e a porção linearcorrespondente ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto emquestão.
  5. 5. 5 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Abordar a espectrofotometria como método analítico na determinação da concentração. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Determinar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteínaalbumina; • Elaborar uma curva de calibração para dosagem de proteínas pelo método doBiureto; • Determinar a concentração de proteína em uma amostra-problema; • Exercitar a prática de diluição na determinação da concentração, • Montar a curva de referência com auxílio do programa EXCEL® no computador. 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 REAGENTES Foram utilizados como reagentes: solução padrão de proteína (albumina) 5 mg/mL,amostra problema de concentração desconhecida e reagente de Biureto. 3.2 PROCEDIMENTOS Utilizamos seis tubos de ensaio que foram numerados de 1 a 6 para realizar oexperimento. Cada tubo foi preparado da seguinte forma: 1° Tubo: (branco) 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
  6. 6. 6 2° Tubo: 0,2 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0ml de reagente de biureto; 3° Tubo: 0,4 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0ml de reagente de biureto; 4° Tubo: 0,6 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,4 ml de água destilada e 5,0ml de reagente de biureto; 5° Tubo: 0,8 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,2 ml de água destilada e 5,0ml de reagente de biureto, 6° Tubo: 1,0 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL) e 5,0 ml de reagente debiureto. Logo após todos os tubos estarem prontos, foram agitados e deixados de repouso por 10minutos. Depois de passado o tempo de repouso, calculou-se a concentração final de cada um,usando a formula C1 . V1 = C2 . V2, e anotamos os resultados na tabela abaixo: TUBOS 1 2 3 4 5 6 5 . 0,2 = 5 . 0,4 = 5 . 0,6 = 5 . 0,8 = 5 . 1,0 = CALCULO - C2.1 C2 . 1 C2 . 1 C2 . 1 C2 . 1 CONCENTRAÇÃO BRANCO 1mg/ml 2mg/ml 3mg/ml 4mg/ml 5mg/ml Então, dando continuidade ao experimento, utilizou-se o espectrofotômetro paradeterminar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteína albumina,utilizando os tubos 1 e 6 do experimento montado, para determinar: a) Curva de absorção de proteína com Reagente de Biureto; b) Curva de referência para determinar a concentração de uma amostra-problema, c) Concentração de proteínas na amostra-problema.
  7. 7. 7 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 CURVA DE ABSORÇÃO Para determinar a curva de absorção, foi ligado o espectrofotômetro e colocado oconteúdo dos tubos 1 e 6 em duas cubetas diferentes que foram inseridas ambas no interior doequipamento. O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentescomprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância do tubo 6. Verificou-se a absorbância da solução do tubo 6 em diferentes λ no espectrofotômetro,anotando os valores de absorbância para cada comprimento de onda utilizado na tabela abaixo: ʎ (nm) Absorbância ʎ (nm) Absorbância 1 460 5 540 0.156 2 480 6 560 0.154 3 500 0.107 7 580 0.142 4 520 0.142 8 600 De acordo com os resultados da tabela acima, foi montado um gráfico correlacionandocomprimento de onda com absorbância do tubo 6, e de acordo com o gráfico, o tubo 5apresentou o ponto Maximo de absorbância:
  8. 8. 8 4.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO Para calibrar/zerar o espectrofotômetro foi utilizado o tudo 1: 0 de absorbância nocomprimento de onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção. Anotamos a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6 na tabela abaixo: TUBOS 1 2 3 4 5 6 ABSORBÂNCIA Branco 0.030 0.059 0.092 0.120 0.156 4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRA PROBLEMA Foram separados dois tubos de ensaio e identificados como tubo A (amostra-problema) etubo B (amostra-problema diluída), e adicionaram-se os reagentes conforme tabela abaixo: Tubos Reagentes (ml) A B* Amostra problema 1,0 0,5 Água destilada - 0,5 Reagente de Biureto 5,0 5,0 Depois de preparados, os tubos foram deixados em repouso por 10 minutos. Utilizau-se o tubo 1 para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância no comprimentode onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção Tubos A B* Absorbância 0,080 0,047 (*Fator de diluição da amostra = ___2_______) Resultado do volume total dividido pela amostra que foi colocada. Fator de diluição équantas vezes a amostra cabe no volume total após a diluição.
  9. 9. 9 Conforme os valores obtidos na curva de calibração, a concentração de proteínas(mg/mL) presente nas amostras problema utilizando regra de três. Utilizamos como referenciaqualquer um dos valores obtidos na curva de calibração: Amostra problema – absorbância: 0, 047 concentração: x Tubo 2 absorbância: 0,03 concentração 1mg/ml 0, 047 -------------------x 0,03x= 0,047 0,03---------------------1 x= 0,047 / 0,03 x=1,57mg/ml. Utilizando o programa EXCEL®, encontramos a equação da reta referente a curva decalibração conforme gráfico abaixo: Finalmente, para calcular a concentração de proteínas (mg/mL) presente nas amostrasproblema utilizando a equação da reta obtida com a curva de calibração, obteve-se os seguintesresultados: Y= a.x + b (excluímos b porque passa no 0) Tubo A: Abs = 0,03 . conc  0,08/0,03 = conc.  Conc. = 2,7 mg/mlconcentração original. Tubo B: Abs = 0,03 . conc  0,047/0,03 = conc.  Conc. = 1,6 mg/ml amostradiluída.
  10. 10. 10 5 CONCLUSÃO Com o experimento pudemos abordar a espectrofotometria para determinar asconcentrações de algumas amostras e a concentração de proteína na amostra problema,conseguimos determinar a curva de absorção para o reagente de biureto em presença da proteínaalbumina. Também pudemos aplicar conhecimentos do programa EXCEL®, elaborando a curvade calibração para dosagem de proteína e montamos a curva de referencia agregando novosconhecimentos ao experimento. Então concluímos que os objetivos do experimento foram alcançados com êxito.
  11. 11. 11 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASUniversidade federal do rio grande do sul. Espectrofotometria. Disponível em: <http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/espectrodeantipiril.html>. Acesso em 28 de agosto de 2012.NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: WorthPublishers, 2000. 1152p.
  12. 12. 12 7. APÊNDICE 1. Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica? A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigaçõesbiológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar aradiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida desoluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parececompletamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível.A água absorve fortemente na região do infravermelho. A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem dasestruturas das moléculas, e é característica para cada substância química. Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): aenergia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos deondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aquelescomprimentos de ondas não absorvidos. 2. O que significa a linearidade dos métodos colorimétricos e como ela édeterminada? Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados diretamenteproporcionais à concentração da substância em exame (analito). 3. Que critério deve ser usado para selecionar determinado comprimento de ondapara uma técnica colorimétrica? Deve-se levar em conta a relação entre quantidade de luz absorvida e concentração dasubstância. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por elaatravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra.
  13. 13. 13 4. Qual o conteúdo e a finalidade do tubo “branco”? O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentescomprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância dos outros tubos. Otubo branco foi preparado com 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto. 5. De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado composto apresentaum máximo de absorção em 545nm e para uma concentração de 3mg/mL foi obtida umaabsorbância de 0,22, calcule a concentração deste composto correspondente a uma absorbânciade 0,15, sabendo-se que a linearidade do método utilizado é de 0,5 a 5mg/mL. 0,22-------------------------3 0,22x=0,45 x=0,45/0,22 x= 2,41 0,15-------------------------x

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