Presentacion Chagas, Festival Italiano 2010

1. Italia-VenezuelaResultados del proyecto conjunto en el diagnostico serologico del Mal de Chagas2009-2010 Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

2. COLABORADORES Lic. Franca Pace Instituto Inmunologia UCV Lic. Anny Perez Instituto Medicina Tropical Lic. Vanessa Nardelli Byo Latin America

3. Mal de Chagas Un profundo Agradecimiento: Emb. Luigi Maccotta Dr. Alfredo Giorgi Dra. Belkisyolè de Noya Dr. Isaac Blanca Dr. Piero Di Dio Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

4. Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) Istituto di neurobiologia e medicina molecolare (INMM) BIO GENETIX srl Unipersonale Facultad Medicina UCV Byo Research Srl Instituto de Medicina Tropical, Sección de Immunología Universidad Central de Venezuela Spin-off Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

5. … LA HISTORIA CONTINUA Byo Research Srl Instituto de Medicina Tropical Sección de Immunología Mal de Chagas Desarrollo y validacion de un test serologico para el Mal de Chagas Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

6. Mal de Chagas Por Què Juntos? Instituto de Medicina Tropical Sección de Immunología Know-how venezolano Byo Research Srl Diagnòstico de Chagas confiable aplicado a una tecnologìa automatizada multiparamètrica ycuantitativa Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

7. Mal de Chagas METODOS DIAGNOSTICOS Analisis directo – Bùsquedadel Trypanosoma cruzi FASE AGUDA 1. Anàlisis al microscopio òptico 4. Xenodiagnòstico 2. QBC (Quantitative Buffy Coat) 5. PCR (PolymeraseChainReaction) 3. Hemocultivo ALTA ESPECIFICIDAD BAJA SENSIBILIDAD LARGA COMPLEJA COSTOSA Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

8. Diagnosi del Mal de Chagas Anàlisis serologico – Bùsqueda de Ac anti-T. cruzi FASE CRONICA TEST CONVENCIONALES TEST NO CONVENCIONALES Ag: Recombinante o pèptidos sinteticos Ag: paràsito completo – extractos solubles o purificados - epimastigote Test immunològicos OTROSTEST 1. IHA(IndirectHaemagglutinationAssay) 1. RapidImmunochromatographicAssay 2. IFA(ImmunoFluorescenceAssay) 2. RIPA (Radio ImmunoPrecipitationAssay) 3. ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay) 3. Immunoblot 4. Reacciòn de fijaciòn del complemento ALTA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD RAPIDA FACIL ECONOMICA Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

9. Mal de Chagas Exigencias en el diagnòstico de Chagas Epidemiafase aguda Tratamiento clìnico/farmacològico correcto ytempestivo Screening en poblaciòn asintomàtica (endèmica)fase crònica para un tratamiento clìnico/farmacològico antes de la apariciòn de la sintomatologìa cardìaca e intestinal Screening en donantesfase crònicapara evitar una difusiòn de la enfermedad en poblacion no endèmica Screening en mujeres endèmicas embarazadasfase crònica para evitar el contagio del feto con consecuente muerte intrauterina, parto prematuro o lesiones orgànicas al feto Follow-up tratamiento farmacològico Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

10. Mal de Chagas Puntos Crìticos en el diagnòstico de Chagas Ausencia de un test de referencia internacional (Gold Standard) Existencia de diferentes cepas de Trypanosoma cruzi (alta diversidad genètica) T. cruzi I – regiones al norte de la Amazonia (ciclo selvàtico – menos resistentes a fàrmacos) T. cruzi II - regiones al sur de la Amazonia (ciclo domèstico – màs resistentes a fàrmacos) IIa – IIb – IIc – IId T. cruziIII (de Freitaset al.,2006) Reacciòn Cruzadacon otras enfermedades infecciosas: Leishmaniasis, Malaria, Lepra, EBV y enfermedades autoinmunes (i.e. LES) Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

11. Mal de Chagas Còmo diagnosticar Mal de Chagas (OPS – OMS) Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

12. E E E E E E Test ELISA Ricerca Ab anti-Trypanosoma cruzi Byo Research Srl Instituto de Medicina Tropical Sección de Immunología Ac IgG Anti-T. cruzi Ag Mal de Chagas Ag Purificado o Ag Recombinante o Ambos? Fase solida Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

13. ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale EfficientNewEnzymaticAntigenSYSTEM Mal de Chagas Multiparàmetrico (Chagas, Dengue, Malaria etc.) Cuantitativo Automatizado Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

15. Test Chagas conAg Puro Entero (IMT)Cuantitativo(U/ml) Test Automatizado– 150 anàlisis 90 min Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

16. Antìgenos: Mal de Chagas Antìgeno purificado entero - IMT Extracto total del epimastigote Antìgeno recombinante-TcF polipèptido de fusiòn producido con E. coli formado por 4 pèptidos inmunoreactivos identificados mediante libreria de cDNA del Trypanosoma cruzi Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

17. A.C.E. – Allergen/AntigenChamberEnzymatic mm 2 15 25 Mal de Chagas FASE SOLIDA 5 micropozos ACE (55 ul) al que se le adhiere el antìgeno especìfico Ag Recombinante - TcF Ag Puro Entero - IMT Caracas, 12 giugno 2010 Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy

19. Caracterizaciòn serològica con una metòdica de referenciaPositivos– en lo posible Fase Aguda/Crònica Sensibilidad clìnica/relativa Negativos– zonas endèmicas y no-endèmicas Especificidad clinica/relativa Positivos a otras enfermedadesdiferentes al Chagas que podrìa cross-reaccionar: Leishmaniasis, Trypanosoma rangeli, otras enfermedades infecciosas (i.e. EBV, Malaria) enfermedades autoinmunes (i.e. LES) Especificidad analìtica – cross reacciòn Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

22. RESULTADOS PRELIMINARES Antigeno TcF Cut off 150 Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100% Cut off 250 Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100% ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy

23. VALIDACION EXTERNA antìgeno TcF Cut-off270 sensibilidad 99% - specificidad 97% Cut-off150 sensibilità 99% - specificità 70% Cut-off250 sensibilità 99% - specificità 96% Cut-off410 Sensibilidad 98% - Especificidad 99%

24. VALIDACION EXTERNA antigeno TcF Cut-off150 sensibilità 99% - specificità 69% Cut-off270 sensibilidad 99% - especificidad 98% Cut-off250 sensibilità 99% - specificità 96% Cut-off410 sensibilidad 99% - especificidad 100%

25. VALIDACION EXTERNA Antìgeno TcF CROSS-REACTIVIDAD 0.0% 0.0% 20.0% 0.0% 5.2% 4.3% 0.0% 20.0% 0.0% 5.2% 410 250

27. VALIDACION INTERNA antìgeno TcF Cut-off200 Sensibilidad 98% - Especificidad 100% Cut-off300 Sensibilidad 98% - Especificidad 100%

28. VALIDACION INTERNA antìgeno IMT Cut-off200 sensibilidad 100% - especificidad 96% Cut-off300 sensibilidad 96% - especificidad 99%

29. Discusion de los resultados Luego optimizaciòn de la fase sòlida Y del tampone di dilucion sueros Validacion Interna Antigene TCF (Validazione esterna) Antigene IMT Antigene TCF 410 N° 148 Donatore N° 101 Negrar 270 N° 60 Venezuela N° 17 Venezuela N° 53 Venezuela N° 115 Donatore N° 101 Negrar N° 53 Venezuela N° 148 Donatore N°60-115 Venezuela N° 17 Venezuela Cut-off410 sensibilità 98% specificità 99% Cut-off270 sensibilità 99% specificità 97% sensibilità 100% specificità 96% sensibilità 98% specificità 100% VPP 94% VPN 100% VPP 100% VPN 99%

30. Analisis Cuantitativo Mal de Chagas Cut-offTcF 200 – 300 ABS 0.08 – 0.11 U/ml Cut-off IMT 200 – 300 ABS 0.11 – 0.15 U/ml Reproducibilidad del test CV% < 20% en sueros bajos positivos Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

31. Diagnostico Mal de Chagas Correlacion test ENEASYSTEM III y Microplaca (96 pozos) n = 30 sueros positivos n = 10 sueros negativos Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

32. Diagnòstico Mal de Chagas CONCLUSION 50 sueros positivos 30 venezolanos y 20 de poblaciòn endèmica residente en Italia: Antìgeno Recombinante 1 suero falso negativo – venezolano sensibilidad 98% 0 sueros falsos negativos Antìgeno Entero Puro sensibilidad 100% 75 sueros negativos10 venezolanos y65 donantes Italianos: 0 sieri falsi positivi Antìgeno Recombinante Especificidad 100% 3 sueros falsos positivos – 2 donantes italianos y1 venezolano Antìgeno Entero Puro Especificidad 96% Positivos Antìgeno Entero Purificado Negativos Antìgeno Recombinante Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

33. Instituto de Medicina TropicalSección de Immunología Caracas - Venezuela Byo Research Srl Diagnòstico Mal de Chagas …LA HISTORIA CONTINUA … Aumentando el panel de sueros Positivos, Negativos y Cross-Reactivos; 2. Desarrollando el test para las IgM (fase aguda) Centro Malattie Tropicali Ospedale Sacro Cuore Don Calabria Negrar – Verona - Italia Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010