1.
Molekularna Biologija
Izolacija DNK iz humanog tkiva

2.
Izolacija DNK iz ćelije podrazumijeva oslobađanje DNK iz jedra (nuklearna DNK) ili organela (mitohondrijalna ili
plastidna DNK). Pri tome se koriste hemikalije kojima se razbijaju i liziraju: ćelijska membrana (animalnih ćelija),
membrane organela (mitohondrija i plastida), ćelijski zid (bakterija, biljaka, gljiva), ali i veoma čvrsti zidovi spora
(sporogenih bakterija, protozoa) i druge jako čvrste tvorevine (hitinska kutikula, kosti, rožne tvorevine, keratin.
Izolacija (ekstrakcija) DNK
(klasičnom metodom – bez kolonica, odnosno silikatnih membrana) Potrebna laboratorijska oprema:
‐ centrifuga,
‐ vodeno kupatilo (termoblok),
‐ epruvete (zapremine 1,5 i 2 ml),
‐ set mikropipeta* (za male, srednje i velike nastavke)
‐ set nastavaka za mikropipete* (malih, srednjih i velikih)
Potrebni reagensi:
‐ lizirajući rastvor (koji može sadržati i deterdžent i enzim proteinazu K
‐ rastvor koncentrisane soli
‐ Izopropil alkohol
■Oprema za uzimanje uzorka (vatirani štapići za uzimanje brisa, čiste epruvete)

3.
Izolacija DNK iz brisa bukalne sluznice obuhvata sledeće korake:
1)sakupljanje ćelija bukalne sluznice
2)razbijanje ćelija da se iz njih oslobodi DNK
3)odvajanje DNK od proteina i ćelijskih ostataka
4)izolacija koncentrovane DNK
Detalji svakog koraka ekstrakcije:
1) sakupljanje ćelija bukalne sluznice (bris)
-Uzimanje ćelija epitela bukalne sluznice obavlja se pomoću vatiranog vrha štapića za uzimanje brisa.
-Bris (vatirani vrh štapića) treba staviti u epruvetu (1,5 ml). Bris sadrži stotine „finih“ (tankomembranoznih)
ćelija bukalne sluznice.
Unutar svake ćelije nalazi se jedro, a unutar jedra je DNK.
2) razbijanje ćelija da se iz njih oslobodi DNK
-Odsjecanje brisa (vrha štapića) kako bi epruveta mogla da se zatvori.
-Nalivanje lizirajućeg rastvora(grč. lysis = razgradnja, raspadanje, razaranje, razlaganje)
-Inkubacija u vodenom kupatilu na 56 0C (10 min – 30 min, zavisno od tipa uzorka, ali dovoljno dugo da se
- oslobodi DNK).
Lizirajući rastvor sadrži dva važna sastojka: deterdžent i enzim proteinazu K. Deterdžent razbija ćelijsku i
jedarne membrane čime omogućava pucanje ćelija i oslobađanje DNK iz njih. Međutim, DNK je i dalje veoma
čvrsto obavijena proteinima (histonima), te proteinaza K siječe i odvaja histone da oslobodi DNK. Po završetku
inkubacije vrh štapića treba izvaditi iz epruvete.

4.
-Tokom prethodnog koraka (inkubacije u vodenom kupatilu) oslobođena je DNK. Sljedeći korak je dodavanje rastvora
koncentrisane soli u epruvetu.
-So obezbjeđuje da se proteini i drugi ostaci (razbijenih) ćelija grupišu.
-Epruvete se stavljaju u centrifugu
-Obezbjedi se „balans“ stavljanjem druge epruvete sa istom zapreminom tečnosti (može i obična voda).
-Centrifugiranjem epruvete na velikoj brzini postiže se da teški ugrušci proteina i ćelijskih ostataka spadnu (stalože
se) na dno epruvete, dok DNK lanci ostaju difuzno raspoređeni u tečnom sadržaju epruvete.
-Tečni sadržaj epruvete prenosi se u čistu epruvetu, dok talog (koga čine proteini i ćelijski ostaci) ostaje u epruveti koju
bacamo
3) odvajanje DNK od proteina i ćelijskih ostataka
4) izolacija koncentrovane DNK
- Dodaje se izopropil alkohol u epruvetu sa rastvorenom DNK i promiješa laganim (ručnim) okretanjem epruvete. Time se
postiže da se DNK, koja nije rastvorljiva u izopropil alkoholu, izdvoji iz rastvora u vidu ugrušaka vidljivih golim okom

5.
ZADATAK:
Probajte u kućnim uslovima izolovati svoju DNK iz bukalne sluznice ili pljuvačke prema uputama sa linka:
https://www.youtube.com/watch?v=qfa0hi6s35E
Ako neko dobije rezultat može da uslika i pošalje u google učionicu

6.
Molekularna Biologija
Određivanje koncentracije izolovane DNK

7.
Kvantifikacija DNK
• Dobili ste dakle DNK i sada treba da odredite koliko je imate (što je jako bitno za
svu dalju upotrebu) i koliko je čista (što isto može da bude jako bitno za neke
upotrebe recimo sekvenciranje!)
• Količina dobijene DNK može se odrediti na različite načine, najčešće korišteni su:
1) mjerenje apsorbance
2) agarozna elektroforeza
3) korišćenje fluorescentnih DNK vezujućih molekula (boja).
•Koji metod ćemo koristi zavisi od uređaja koji posjedujemo, s obzirom na to da su
metode jednostavne i ne zahtjevaju puno vremena.

8.
Kvantifikacija DNK-Apsorbanca
•Najčešće korištena metoda za određivanje koncentracije i čistoće DNK uzorka je
mjerenje njegove apsorbance.
•Nukleinske kiseline apsorbuju svjetlost u UV dijelu spektra heterocikličnim
prstenovima nukleotida dok šećerno-fosfatna kičma DNK ne doprinosi apsorpciji.
•Talasna dužina maksimuma apsorpcije za DNK i RNK je 260nm, i to je const. ali će
ekstinkcioni koeficijent zavisiti od sredine (rastvora) u kom se apsorbanca mjeri.
•Razlike u apsorbanci između izolovanih nukleotida, RNK, ss i ds DNK (hipohromni
efekat) posljedica su između ostalog hidrofobnih i dipol-dipol interakcija između
elektronskih sistema baza koje učestvuju u stacking interakcijama.
•Ove apsorpcione osobine DNK nam omogućuju da je detektujemo, kvantifikujemo i
donekle odredimo čistoću uzorka.
•Dakle, sve što nam je potrebno najčešće već postoji u laboratoriji -spektrofotometar
sa UV lampom i kivete koje propuštaju UV svjetlost.
Znamo da nukleinske kiseline apsorbuju UV zračenje, i onda naš uzorak osvjetljavamo
svjetlošću talasne dužine 260 nm, a foto-detektor iza mjeri količinu svjetlosti koja je
prošla kroz uzorak

9.
Lambert Beer-ovog zakona: izračunavamo koncentraciju DNK.
Što se više svjetlosti apsorbuje ima više nukleinske kiseline u uzorku.
•Na talasnoj dužini od 260 nm, srednji ekstinkcioni koeficijent za dvostruku DNK je 0.020
(μg/ml)-1cm-1, za jednostruku DNK 0.027 (μg/ml)-1cm-1, a za jednostruku RNK 0.025
(μg/ml)-1cm-1.
•Dakle, izmjerena optička gustina (ili OD) od 1 odgovara koncentraciji dvostruke DNKod
50 μg/ml
•Često je uzorak kontaminiran*, pa nam odnos apsorpcijena 260 i 280nm (A260/A280) koristi
se za određivanje čistoće uzorka nukleinskih kiselina.
•Čista DNK ima A260/A280 od približno 1.8 a čista RNK A260/A280 približno 2.
A230 (fenolati, tiocijanati organska jedinjenja) i A320 (turbidnost)

10.
POSTUPAK- priprema uzoraka DNK sa difenilaminom
Tretman molekula DNK sa kiselinama uz zagrijavanje izaziva denaturaciju baza i hidrolizu estarskih veza između šećera i
fosfata te dehidtrataciju dezoksiriboze u hidroksi-levunil aldehid. Ovaj nastali aldehid se kondenzuje sa difenilaminom
dajući plavo obojeno jedinjenje sa maksimumom apsorpcije na 595 nm
Potrebni reagensi:
• Glacijalna sirćetna kiselina
• 10% sirćetna kiselina
• Sumporna kiselina
• Difenilamin (1 g u 100 mL glacijalne sirćetne i 2 mL konc. sumporne kiseline)
• Rastvor standarda 2-dezoksi-D-riboze 1 mg/mL
• Postupak:
• Uzorak DNK hidrolizovati u 10% sirćetnoj kiselini (1:2 v:v) na 95 0C 10 min
• Alikvot se razblaži sa 2 dijela vode i 5 dijelova difenilaminskog reagensa, promiješa a potom ponovo ključa 10 min.
• Mjerenje apsorbance nakon hlađenja se radi na 595 nm (slijepa proba svi reagensi osim uzorka)
• Od komercijalnog rastvora dezoksiriboze se pripremi srija koncentracija u rasponu 10-200 μg/mL i za svaku
koncentraciju se odradi ista reakcija kao i za uzorak i mjeri apsorbanca. Od serije apsorbanci za standard izradi se
kalibraciona kriva kao zavisnost A od koncentracije i dobije jednačina pravca
• Računanje koncentracije DNK u uzorku se izračunava tako što se vrijednost dobijene apsorbance uvrštava u jednačinu
pravca ua standard.

11.
Zadatak:
Izračunati koncentraciju DNK u uzorku ukoliko je jednačina pravca za standard dezoksiriboze: Y= 0,589 X + 0,055 (R2=
0,9765) a apsorbanca na 595 nm pri tom iznosi 0,315 (uzorak je nakon svih opisanih reakcija u epruveti koji su navedeni u
prethodnom postupku dodatno razblažen- 1 mL u 10 mL vode.

12.
Molekularna Biologija
Određivanje tačke topljenja izolovane DNK

13.
DNK se razgrađuje na karakterističnoj temperaturi koja se zove temperatura
topljenja (Tm- „melting temperature“) i definiše se kao temperatura na kojoj se
50% DNK heliksa denaturiše. Temperatura topljenja DNK molekula zavisi od
veličine fragmenta i sastava nukleotida, dakle fragmenti bogati GC baznim
parovima imaju višu Tm od fragmenata bogatih AT baznim parovima.

14.
Zavisnost apsorbance na 260 nm rastvorene
DNK od temperature

15.
Tm oligonukleotida se najpreciznije određuje empirijski. Na nju utiče veliki broj faktora:
koncentracija DNK, koncentracija soli u rastvoru, prisustvo denaturišućih agenasa, dužina
DNK molekula, bazni sastav i dr.
Najjednostavnija formula (prema Wallace-u) koja se može primjeniti za procjenu Tm, za
veoma kratke oligonukleotide 14-20 bp glasi:
Tm (0C) = 2 0C (A+T) + 4 0C (G+C)
Pri tom se sadržaj A, T, C i G odnosi na samo jedan lanac DNK

16.
POSTUPAK:
1) Izolovanu DNK rastvoriti u 0,1 M Tris puferu pH 7
2) Podijeliti uzorak u 5 epruveta i inkubirati 5 min , istovremeno ali na različitim
temperaturama: 22,40, 60, 80, 100 0C
3) Epruvete ohladiti i u što kraćem roku izmjeriti apsorbancu na 260 nm
• Na milimetarskom papiru izraditi kalibracionu krivu, dobijenu iz zavisnosti
apsorbance od temperature na kojoj je inkubirana DNK.
• Na Y osi naći vrijednost na kojoj je početna apsorbanca DNK udvostručena
• Potom od te tačke povući okomito prema kalibracionoj krivoj pravu liniju,
presjeći krivu, i sa te tačke okomito presjeći X osu
• Sa X ose očitati Tm

17.
Zadaci:
1) Izraditi kalibracionu krivu na mm papiru prema
sljedećim vrijednostima za apsorbance i temperature
inkubacije DNK:
• T= 220C, A=0,315
• T= 400C, A=0,460
• T= 600C, A=0,576
• T= 800C, A=0,732
• T= 1000C, A=0,883
2) Izračunajte Tm sljedećeg fragmenta dvolančane DNK:
AATCTGGGACGGCGCGGCAATCGCA
TTAGACCCTGCCGCGCCGTTAGCGT

18.
Molekularna Biologija
Izolacija RNK iz ćelija kvasca

19.
Izolacija (ekstrakcija) RNK
Izolacija RNK predstavlja odvajanje RNK od svih ostalih komponenti iz bioloških uzoraka.
Cijelu proceduru izolacije RNK komplikuje prisustvo ribunukleaza (RNAza) koji se nalaze u
ćelijama i tkivima, a koji vrlo brzo mogu da razgrade RNK. Pojedine RNAze mogu biti
izuzetno otporne pa je i njihova neutralizacija značajno teža u poređenju sa
dezoksiribunukleazama (DNAzama). Pored ćelijskih, postoji i nekolicina RNAza koje se
nalaze u našem okruženju, poput RNAaze 7 koju se oslobađa sa ljudske kože. Zbog svega
navedenog, oprema koja se koristi u postupcima izolacije RNK se temeljno čisti, drži
odvojeno od standardne laboratorijske opreme, ali se i tretira određenim hemikalijama koje
uništavaju RNAaze. Iz istih razloga, laboranti koji učestvuju u izvođenju samog eksperimenta
treba posebno da vode računa o tome da golim rukama ne dodiruju opremu i hemikalije.

20.
Kao i u slučaju izolacije DNK, izolacija RNK može se obaviti na više različitih načina.
Postupak izolacije RNK se veoma malo razlikuje od izolacije DNK, te navodimo samo
osnovne korake izolacije RNK i u primjeru izolacije pomoću kolonica sa silikatnim gel
membranama:
1.Priprema uzorka
2.Liziranje uzorka
3. Otklanjanje nečistoća i genomske DNK (gDNK) pomoću kolonice sa silikatnom gel
membranom
4. Prečišćavanje (purifikacija) RNK:
a) Tretman za uništavanje preostalih tragova DNK pomoću enzima DNAaza
b) b) Prečišćavanje pomoću specifičnih pufera.
c) c) Ispiranje RNK sa silikatnih gel membrana (elucija).

21.
Za razliku od ekstrahovane DNK, koja je prilično stabilna čak i na sobnoj temperaturi,
za RNK je svojstveno da brzo degradira. Okvirno, RNK je prilično stabilna na
temperaturi od -80ºC do godinu dana. Za sve periode duže od godinu dana preporučuje
se lagerovanje RNK izolata u parama tečnog azota na temperaturi od -196 ºC, ili u
nekim komercijalnim reagensima koji stabilizuju RNK, odnosno sprečavaju
degradaciju nukleinskih kiselina. Izolacija RNK predstavlja prvi korak u postupku
detekcije patogena koji kao genetski materijal sadrže samo RNK (npr. RNK virusa), ali
i u postupku analize ekspresije gena.

22.
Izolacija RNK iz ćelija kvasca:
Princip:
Jedan od načina da se RNK izdvoji iz ćelija kvasca je ekstrakcija sa fenolom iz vodene
suspenzije cijelih ćelija. Koncentrovani rastvor fenola cijepa vodonične veze u
makromolekulama izazivajući denaturaciju proteina. Zamućena suspenzija se centrifugira
na sobnoj temperaturi, nastaju dvije faze: gornja vodena i donja fenolna. Vodena sadrži
RNK i ugljene hidrate a donja DNK. Denaturisani proteini između faza u vidu bjeličastog
prstena.
RNK se taloži iz rastvora sa etanolom
Materijal:
Suvi kvasac (10 g)
Rastvor fenola (900 g/L)
Kalijum acetat 200 g/L pH 5
Etanol 96 %
Dietil etar
Tris HCl om1 M pH 7,5

23.
• Suspendovati 2 g osušenog kvasca u 20 mL destilovane vode prethodno zagrijane
na 370C, i ostaviti 15 minuta da stoji, a potom dodati 20 mL rastvora fenola.
• Suspenziju miješati 30 minuta mehanički, a potom centrifugirati na 15000 rpm 15
min
• Vodenu fazu (gornju) odvojiti pažljivo pipetom u čašu postavljenu u ledeno
kupatilo, a potom dodati 20% kalijum acetat do krajnje koncentracije od 2 % u
odnosu na kalijum acetat a potom na tu zapreminu dodati još ohlađen etanol da bi
krajnja zapremina bila još veća 2, 5 puta
• Rastvor ostaviti na ledu još 1 sata potom ga ponovo centrifugirati 5 miniuta na
15000 rpm
• Zaostali talog isprati smjesom etanol: voda (3:1) a potom etrom.
• Osušiti talog na vazduhu i izmjeriti prinos
* Kvasac sadrži oko 4% RNK u odnosu na suvu masu

24.
Pitanja i zadaci:
1) Navedite najvažnije poteškoće u izolaciji RNK
2) U odnosu na vrstu RNK (informaciona, ribozomalna, transportna) koja RNK
cini najmanji % u ćelijskom izolatu?
3) Izračunati koju zapreminu 20% kalijum acetata treba dodavati u 30 mL
alikvota RNK izolata da bi se dobio 2% rastvor.